Einzellige Analyse der Immunophenotype und Produktion von Zytokinen im peripheren Blut über Masse Zytometrie

Diese Methode kann helfen, Fragen im Bereich der Autoimmunität zu beantworten, wie z. B. die Identifizierung von Anomalien der Zellfrequenz und Funktionsunterschiede, wie z. B. die Produktion von Schlüsselzytokinen im Rahmen von Autoimmunerkrankungen. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass sie ein breites Repertoire oder verschiedene Zelltypen und Funktionsunterschiede aus einer leicht erhältlichen peripheren Blutprobe erfassen kann. Im Allgemeinen können Personen, die neu in diesem Prozess sind, Schwierigkeiten haben, das Timing der Blutverarbeitungsschritte, das Design des Antikörper-Panels, den Barcoding-Prozess selbst und die Analyse hochdimensionaler Einzelzelldaten zu finden.

Dieser systemimmunologische Ansatz eignet sich besonders für Autoimmunerkrankungen wie SLE, bei denen die Immundysregulation weit verbreitet und im peripheren Blut offensichtlich ist. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist wichtig, um das Timing der Schritte zu verdeutlichen und auch zu zeigen, wie mehrere Proben vor der Massenzytometrie-Analyse mit einem Barcode versehen und gepoolt werden können. Um diesen Vorgang zu starten, legen Sie die beschrifteten Polystyrolröhrchen mit rundem Boden und fünf verschiedenen Bedingungen für die Vollblutverarbeitung auf ein Gestell.

Geben Sie als Nächstes einen Milliliter 37 Grad Celsius RPMI in jedes Röhrchen. Geben Sie dann einen Milliliter Vollblut in jedes Röhrchen und pipettieren Sie mehrmals auf und ab, um es gründlich mit RPMI zu mischen. Geben Sie anschließend 10 Mikroliter vorverdünntes Ruxolitinib in das Röhrchen mit der Bezeichnung T sechs plus fünf R und mischen Sie gründlich.

Stellen Sie das Gestell mit den Röhrchen bei 37 Grad Celsius in den Inkubator und beginnen Sie mit der Timierung der Inkubation. Um die T-Null-Probe zu verarbeiten, pipettieren Sie den gesamten Inhalt des T-Null-Röhrchens in ein markiertes konisches Röhrchen mit 20 Millilitern 37 Grad Celsius Lyse-/Fix-Puffer bei Arbeitskonzentration. Um die Zellrückgewinnung zu optimieren, spülen Sie das Röhrchen mit Lyse/Fix-Puffer und mischen Sie, indem Sie das konische Röhrchen umdrehen.

Inkubieren Sie die Zellen 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um eine Lyse und Fixierung zu ermöglichen. Zentrifugieren Sie die Zellen dann fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 500-facher G-Menge. Anschließend wird der Überstand dekantiert und die Zellen in einem Milliliter eiskaltem PBS wieder suspendiert, um das Pellet aufzubrechen.

Füllen Sie dann das konische Röhrchen bis zu einem Volumen von 15 Millilitern mit PBS. Anschließend zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 500 mal G. Suspendieren Sie die Zellen erneut in einem Milliliter CSM, um das Pellet aufzubrechen.

Übertragen Sie dann die Probe zur Antikörperfärbung in ein markiertes Mikrozentrifugenröhrchen. Zählen Sie die Zellen mit einem automatisierten Zellzähler mit einer 10-Mikroliter-Probe. Zentrifugieren Sie anschließend die Zellen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 500 mal G.

Anschließend wird der Überstand abgesaugt, wobei das Pellet in etwa 60 Mikrolitern Rückstand verbleibt. Bewahren Sie dieses Pellet auf Eis auf, bis die Proben aus anderen Bedingungen die Verarbeitung abgeschlossen haben. Bei T gleich 30 Minuten wird das Röhrchengestell in die Gewebekulturhaube überführt.

Geben Sie 10 Mikroliter R848 zu 0,1 Gramm pro Mikroliter in das Tube T six plus R848 und mischen Sie gründlich. Geben Sie dann 10 Mikroliter LPS mit 0,01 Mikrogramm pro Mikroliter in das T six plus LPS-Röhrchen und mischen Sie gründlich. Geben Sie anschließend vier Mikroliter Proteintransportinhibitor in die Röhrchen mit der Aufschrift T sechs, T sechs plus fünf R und T sechs plus LPS und geben Sie die Proben in den Inkubator zurück, bis T sechs Stunden beträgt.

Mischen Sie die Proben alle zwei Stunden gründlich mit einer P1000-Pipette. Bei T gleich zwei Stunden geben Sie vier Mikroliter Proteintransportinhibitor-Cocktail in das Tube T sechs plus R848. Mischen Sie alle Proben und stellen Sie das Gestell wieder in den Inkubator, bis T sechs Stunden entspricht.

Bei T gleich vier Stunden mischen Sie die Proben noch einmal mit einer P1000-Pipette. Bei T gleich sechs Stunden sind T sechs, T sechs plus LPS, T sechs plus R848 und T sechs plus fünf R-Blutprobenröhrchen zu verarbeiten, wie für die T Null-Probe beschrieben. Lagern Sie die Pellets dann im Rest-CSM-Volumen bei minus 80 Grad Celsius, um sie später zu verarbeiten.

Um die lysierten, fixierten Zellen mit einem Barcode zu versehen, tauen Sie die Proben aus der bei minus 80 Grad Celsius warmen Lagerung langsam auf Eis auf. Verdünnen Sie den 10-fachen Barcoding-Perm-Puffer mit PBS um eins bis 10 und stellen Sie genügend Puffer für drei Milliliter pro Probe her. Füllen Sie einen unsterilen Trog mit CSM und einen mit dem einen X Barcoding Perm-Puffer.

Geben Sie dann einen Milliliter eiskaltes CSM zu den frisch aufgetauten Proben, mischen Sie es gründlich und geben Sie es in die entsprechenden vorbeschrifteten Polypropylen-Cluster-Röhrchen. Entnehmen Sie nun eine 10-Mikroliter-Probe und zählen Sie die Zellen mit einem automatisierten Zellzähler. Normalisieren Sie die Zellzahlen in jedem Cluster-Röhrchen, indem Sie das Volumen der überschüssigen Zellen entfernen.

Zentrifugieren Sie dann die Zellen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 600-facher G-Temperatur. Suspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter eines X-Barcoding-Perm-Puffers mit einer Mehrkanalpipette und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 600-fachem G. Saugen Sie anschließend den Überstand ab.

Richten Sie die Cluster-Röhrchen in der gleichen Reihenfolge wie auf dem Barcode-Schlüssel angegeben auf einem Gestell aus, sodass die Probe mit dem Barcode übereinstimmt. Geben Sie 800 Mikroliter eines X-Barcoding-Perm-Puffers per Mehrkanalpipette zu allen Proben in den Cluster-Röhrchen, ohne das Zellpellet zu berühren, um den Zellverlust zu reduzieren. Stellen Sie dann das Gestell mit den Cluster-Röhren beiseite.

Entfernen Sie die Röhrenstreifen des 20-Plex-Palladium-Barcode-Kits bei minus 20 Grad Celsius und tauen Sie sie bei Raumtemperatur auf. Geben Sie 100 Mikroliter eines X-Barcode-Perm-Puffers hinzu, mischen Sie gründlich und überführen Sie 120 Mikroliter der resuspendierten Barcode-Mischung in die entsprechenden Zellproben in den Cluster-Röhrchen. Gründlich mit einer Mehrkanalpipette mischen, damit es zu keiner Kreuzkontamination zwischen einzelnen Barcode-Proben kommt.

Inkubieren Sie Cluster-Röhrchen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur, damit die Barcodes die Zellen kennzeichnen können. Nach 30 Minuten werden die Proben bei 600-fachem G fünf Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Aspirieren Sie den Überstand und suspendieren Sie ihn dann wieder in einem Milliliter CSM.

Anschließend zentrifugieren und erneut in CSM suspendieren. Danach wird bei 600 mal G fünf Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert und der Überstand aspiriert. Übertragen Sie mit einer einzigen Pipette und mit derselben Spitze alle Zellpellets in etwa 70 bis 80 Mikrolitern Restvolumen in ein Styroporröhrchen.

Werfen Sie die Pipettenspitze nicht aus. Legen Sie die einzelne Pipette mit dieser Spitze beiseite. Mit einer Mehrkanalpipette und neuen Spitzen können Sie 100 Mikroliter CSM in jedes Original-Cluster-Röhrchen geben, um die Zellrückgewinnung zu maximieren.

Übertragen Sie mit der einzelnen Pipette und der beiseite gelegten Spitze alle Zellpellets mit 100 Mikrolitern Restvolumen in dasselbe Polystyrolröhrchen. Fügen Sie CSM hinzu, um das Styroporrohr auf etwa drei Milliliter aufzufüllen. Zählen und notieren Sie die Zellennummer des gepoolten Barcode-Satzes.

Dann wird bei 600 mal G fünf Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert und der Überstand aspiriert. Fahren Sie noch am selben Tag mit dem Färben der Barcode-Proben fort. Dieses Schema zeigt den Arbeitsablauf für die Stimulation und Verarbeitung der peripheren Blutproben, einschließlich der Zuteilung von Blutprobenaliquoten, des Zeitpunkts der Zugabe von Stimulationsmitteln, des Proteintransportinhibitor-Cocktails und der Inkubationszeiten bis zur Lyse und Fixierung der roten Blutkörperchen.

Die Wahl der Stimulierungsmittel hängt von den Signal- und Zytokinwegen ab, auf die die Bewertung abzielt. Nach der Fixierung und Erythrozytenlyse wurden die einzelnen lysierten, fixierten Zellproben eines gesunden Spenders mit einem Barcode versehen, mit 26 Antikörpern gegen Oberflächenmarker markiert, permeabilisiert und mit 14 Antikörpern gegen Zytokine gefärbt. Die Limited-Gating-Strategie, die die Identifizierung von CD14-hohen Monozyten darstellt, ist hier dargestellt.

Von links nach rechts ist jedes dargestellte 2D-Diagramm eine Teilmenge der Grundgesamtheit von der übergeordneten Grundgesamtheit, die von dem 2D-Diagramm unmittelbar links abgegrenzt wird. Unter Verwendung von CD14-hohen Monozyten als repräsentativ für acht Immunzell-Subgruppen wurde eine Massenzytometrie-Analyse an peripheren Blutproben eines gesunden Spenders zum Zeitpunkt Null ohne Stimulation und nach Stimulation mit dem TLR-Agonisten LPS und R848 und dem T-Zell-Aktivator PMA Ionomycin durchgeführt. Es wird ein Beispiel für die Zytokininduktion in CD14-hohen Monozyten gezeigt und ausgewählte Zytokine mit Spezifität zum verwendeten Stimulationsmittel dargestellt.

R848 induziert selektiv die IL-12p40-Untereinheit und MCP1 in CD14-hohen Monozyten, während LPS dies nicht tut. Im Gegensatz dazu induziert PMA-Ionomycin keine Zytokine in CD14-hohen Monozyten. Sobald die Blutstimulation gemeistert ist, können sie in etwa sieben Stunden durchgeführt werden, und der Barcode-Schritt kann in nur etwa einer Stunde durchgeführt werden.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, auf das Timing der Schritte zu achten und entsprechend im Voraus zu planen. Sobald Sie dieses Verfahren eingerichtet haben, können Sie in Erwägung ziehen, die Blutstimulationsbedingungen im Massenzytometrie-Panel zu ändern, um die Immunzellreaktionen zu bewerten, die spezifisch für Ihre eigenen Forschungsziele sind. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Zytokinreaktionen aus Vollblutproben hervorruft und wie man mehrere Proben in einem Barcode-Set für die Massenzytometrie-Analyse zusammenfasst.