Name: Einzellige Analyse der Immunophenotype und Produktion von Zytokinen im peripheren Blut über Masse Zytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 36 s
Description: Erfahren Sie die Einzelzellanalyse von Immunphänotypen und Zytokinproduktion in peripherem Blut mittels Massenzytometrie. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung immunologischer Dysregulation bei Autoimmunerkrankungen.

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Wir möchten Aimee Pugh-Bernard für ihre geistigen Input und hilfreichen Kommentare danken. Diese Arbeit war die Boettcher Stiftung Webb Waring Biomedical Research Award und Award K23-1K23AR070897 von der NIH, Elena W.Y. Hsieh unterstützt. Sie wurde auch von prämiennummer K12-HD000850 von Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health und Human Development and Lucile Packard Foundation für Kinder Gesundheit, Stanford CTSA UL1 TR001085 und Child Health Research unterstützt. Institut der Stanford University.

Alle hier beschriebene Methoden sind durch die Colorado mehrere institutionelle Review Board (COMIRB) von der University of Colorado genehmigt worden. Alle unten beschriebene Verfahren sollte in einem sterilen Gewebekultur Abzug durchgeführt werden, sofern nichts anderes mit gefilterten Pipettenspitzen und alle Reagenzien gefiltert.
1. Vorbereitung der Reagenzien für die peripheren Vollblut Verarbeitung
<ol><li>Bereiten Sie Ruxolitinib Lager Aliquote (10 – 15 μl/Vial zur Einzelnutzung) bei 10 mM durch Verdünnung der lyophilisierte Reagenz in DMSO gemäß Herstellervorschrift (Shop bei-80 ° C). Halten Sie DMSO Konzentrationen in allen Tests einschließlich unstimulierte Kontrollen unter 0,2 % (Vol/Vol).</li>
	<li>Bereiten Sie R848 (Resiquimod) Lager Aliquote (10 – 15 μl/Vial zur Einzelnutzung) bei 1 μg/μL durch Verdünnung der lyophilisierte Reagenz in sterilem Wasser als die gemäß Herstellerangaben. Shop bei-80 ° C.</li>
	<li>Bereiten Sie Lipopolysaccharid (LPS) Lager Aliquote (5 μl pro Fläschchen für einmaligen Gebrauch nur) bei 1 μg/μL durch Verdünnung der lyophilisierte Reagenz in sterilem Wasser gemäß Anweisungen des Herstellers. Shop bei-80 ° C.</li>
	<li>Bereiten Sie die Zelle Färbung Medien (CSM) mit PBS, 0,5 % BSA und 0,02 % NaN3.</li>
	<li>Erwerben Sie und halten Sie den Protein Transport-Inhibitor (PTI) Cocktail (Table of Materials) bereit.</li>
	<li>Tauen Sie auf und verdünnen Sie der Ruxolitinib Lager Ampulle (10 mM) 01:10 in sterilen PBS (1 mM). Bei Raumtemperatur in einer Gewebekultur Kapuze beiseite.</li>
	<li>Auftauen und verdünnen das R848 Lager Fläschchen (1 µg/µL) 01:10 in sterilen PBS (0,1 µg/µL). Bei Raumtemperatur in einer Gewebekultur Kapuze beiseite.</li>
	<li>Auftauen und die LPS Lager Fläschchen (1 µg/µL) 1: 100 in sterilen PBS verdünnen (0,01 µg/µL). Bei Raumtemperatur in einer Gewebekultur Kapuze beiseite.</li>
	<li>Wärmen Sie sterile RPMI (keine L-Glutamin) im Wasserbad standard 37 ° C (für mindestens 10 min vor).</li>
	<li>Verdünnen Sie die Lyse/Fix-Puffer mit 1:5 in gefilterten DdH2O (arbeiten Konzentration) auf die Tischplatte (muss nicht steril sein). Hinweis: 1 mL Vollblut benötigt 20 mL arbeiten Konzentration der lyse/Fix-Puffer.<ol>
<li>Lyse/Fix Puffer für 5 Bedingungen von 1 mL Vollblut je (mindestens 100 mL) zu machen. Aliquoten 20 mL der Arbeit Konzentration der Lyse/Fix Puffer in 50 mL konische Röhrchen pro Milliliter Vollblut (halten die Lyse/Fix-Lösung bei 37 ° C bis benötigt). Die Bedingungen auf den konischen Rohren mit lyse/Fix Puffer wie folgt zu kennzeichnen: T0 (Zeitpunkt Null), T6 + 5R (6 h mit 5 Zeit Umm Ruxolitinib), T6 + R848 (Zeitpunkt 6 h mit 1 μg/mL R848), T6 + LPS (mal 6 h mit 0,1 μg/mL LPS), T6 (Zeitpunkt 6 h).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Label Runde Unterseite sterile Polystyrol Rohre mit Kappen und 1 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit der selben Nomenklatur wie in Schritt 1.10.</li>
</ol>2. Stimulation und Verarbeitung von peripheren Vollblut (Abbildung 1)
<ol><li>Legen Sie den beschrifteten Rundrohre unten Polystyrol aus Schritt 1.11 (T0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + LPS, T6) auf einem Gestell. Hinweis: Die folgenden Schritte sind bei dieser Art von Rohr durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Kappe die Rohre bei der Übertragung zwischen der Gewebekultur Haube und Inkubator zu Sterilität.</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL von 37 ° C RPMI (keine L-Glutamin) für jedes der Rohre (T0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + LPS, T6). Das blutsammelröhrchen mehrmals zu invertieren, jedes Rohr 1 mL Vollblut hinzu, und pipette nach oben und unten mehrmals gründlich mit RPMI mischen (Verdünnung mit RPMI verhindert Verklumpung des Blutes während der Inkubationszeit von 6 h).</li>
	<li>Hinzufügen von 10 μL der 01:10 Ruxolitinib T6 + 5R. Mischen Sie gründlich, mit einer Pipette P1000. Platzieren Sie die Zahnstange von Rohren im Inkubator bei 37 ° C und beginnen mit der Zeitmessung der Inkubation (T = 0).</li>
	<li>Die T0-Probe wie folgt zu verarbeiten.<ol>
<li>Der gesamte Inhalt der T0-Röhre in einem beschrifteten konischem Rohr mit 20 mL 37 ° C arbeiten Konzentration lyse/Fix Puffer Pipette. Zur Optimierung der Zelle Erholung spülen Sie das Rohr mit Konzentration lyse/Fix Puffer arbeiten. Durch Umkehrung der konischen Röhre mischen.</li>
		<li>Inkubation bei 37 ° C für 15 min zur Lyse und Fixierung ermöglichen. Führen Sie nach Fixierung alle weiteren Schritte auf der Tischplatte. Zentrifugieren Sie Zellen bei 500 X g für 5 min bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Den überstand abgießen. Aufschwemmen der Zellen in 1 mL Eis kaltem PBS Pellet aufzubrechen, dann füllen mit PBS kegelförmig bis 15 mL Volumen.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 X g für 5 min bei Raumtemperatur. Den überstand abgießen. Wiederholen Sie die PBS waschen (Schritte 2.4.3–2.4.4), wenn Pellets rot sind. Aufzuwirbeln Sie die Zellen in 1 mL der CSM, brechen Sie die Tablette, dann übertragen auf die beschrifteten Microcentrifuge Schlauch (Schritt 1.11) für Antikörper Färbung. Nehmen Sie eine 10 µL Probe mit einem automatisierten Zelle Zähler oder Hemocytometer Zellen zu zählen. Hinweis: Da alle Zellen zu diesem Zeitpunkt fixiert sind, ist es nicht erforderlich, einen Lebensfähigkeit Fleck aufzunehmen.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 X g für 5 min bei Raumtemperatur. Aspirieren Sie den überstand, so dass das Pellet in ~ 60 µL Restvolumen. Halten Sie diese Pellet auf Eis, bis Proben von anderen Erkrankungen Verarbeitung abgeschlossen haben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bei T = 30 min nach der Gewebekultur Haube Rohr Rack (Schritt 2.3) und führen Sie die folgenden.<ol>
<li>Hinzufügen von 10 μL von 0,1 μg/μL R848 T6 + R848. Mischen Sie gründlich, mit einer Pipette P1000.</li>
		<li>T6 + LPS 10 μL von 0,01 μg/μL LPS hinzufügen. Mischen Sie gründlich, mit einer Pipette P1000.</li>
		<li>T6, T6 und T6 + 5R, LPS (aber nicht zu T6 + R848) 4 μl Protein Transport Inhibitor (bestand bei 500 X) hinzufügen und wieder die Proben in den Inkubator bis T = 6 h. Mischung gründlich mit einer Pipette P1000 alle 2 h. Hinweis: R848 ist ein endoplasmic TLR-Agonist und erfordert daher eine zeitliche Verzögerung bei der Addition von Protein Transport Inhibitor, um Zugang zu ihren Ziel-Rezeptor zu ermöglichen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bei T = 2 h, 4 μl Protein Transport Inhibitor cocktail (bestand bei 500 X) hinzufügen, die T6 + R848 Rohr. Alle Proben mit einer Pipette P1000 mischen und wieder das Rack in den Inkubator bis T = 6 h.</li>
	<li>Mischen der Proben mit einem P1000 noch einmal bei T = 4 h.</li>
	<li>Bei T = 6 h, zu verarbeiten, T6, T6 + LPS, T6 + R848 und T6 + 5R Blut Probenröhrchen wie unter Schritt 2.4 für die T0-Probe.</li>
	<li>Speichern Sie die Zelle Pellets in CSM Restvolumen bei-80 ° C zu einem späteren Zeitpunkt verarbeiten. Alternativ fahren Sie mit Barcode und Antikörper Färbung ohne zu speichern.</li>
</ol>3. Barcode der Blutkörperchen lysiert/behoben
<ol><li>Die lysiert/fixed Zellproben von-80 ° C Lagerung langsam auf Eis Auftauen; maximal 20 Proben kann mit einmaligen Barcodes beschriftet und gebündelt, mit diesem System. Verdünnen Sie die 10 X barcoding Perm Puffer von 01:10 mit PBS; machen Sie genügend Puffer für ~ 3 mL pro Probe.</li>
	<li>Füllen Sie einen unsterilen Trog mit dem CSM und eines mit 1 X barcoding Perm Puffer. Fügen Sie 1 mL Eis kalt CSM frisch aufgetauten Proben mischen mit einer Pipette, und übertragen Sie auf die jeweiligen bereits beschriftete Polypropylen Cluster-Röhren.</li>
	<li>Nehmen Sie eine 10 μl Probe mit einem automatisierten Zelle Zähler oder Hemocytometer Zellen zu zählen. Die Zellzahlen 1,5 – 2 x 106 Zellen pro Probe in jedem Cluster Röhrchen zu normalisieren: entfernen und entsorgen Sie das Volumen des überschüssigen Zellen über den 2 x 106 Zellen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellen bei 600 X g für 5 min bei Raumtemperatur. Aufschwemmen der Zellen in 1 mL 1 X barcoding-Perm-Puffer mit einem Mehrkanal-Pipette und Zentrifuge bei 600 X g für 5 min bei Raumtemperatur. Aus der Überstand abgesaugt.</li>
	<li>Line-up der Cluster-Röhren auf einem Gestell in der gleichen Reihenfolge wie auf dem Barcode-Schlüssel angegeben, damit die Probe mit seinen Barcode entspricht. Fügen Sie 800 μl 1 X Barcode Perm Puffer Mehrkanal-Pipette auf alle Proben in den Cluster-Röhren ohne Berührung der Zelle Pellet mit Pipettenspitzen (keine Mischung), Zellverlust zu reduzieren. Das Gestell mit den Cluster-Rohren beiseite.</li>
	<li>Entfernen Sie 20-Plex Pd Barcoding Kit Schlauch Streifen von-20 ° C und bei Raumtemperatur Auftauen. 100 μl 1 X barcoding Perm Puffer hinzufügen, mischen und 120 μL der resuspendierte Barcode-Mischung in die entsprechende Zellenproben in den Cluster-Röhren zu übertragen.</li>
	<li>Mischen von Mehrkanal-Pipette so, dass es keine Kreuzkontamination zwischen individuell Barcode Proben. Inkubieren Sie Cluster Rohre für 30 min bei Raumtemperatur erlauben die Barcodes, die Zellen zu kennzeichnen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie bei 600 X g für 5 min bei Raumtemperatur. Aspirieren des Überstands, dann in 1 mL der CSM aufzuwirbeln.</li>
	<li>Zentrifugieren und Aufschwemmen in CSM wieder wie in Schritt 3,8. Hinweis: Jede Probe wird nun mit einem eindeutigen Barcode beschriftet und Proben sind bereit, gebündelt werden.</li>
	<li>Zentrifugieren bei 600 X g für 5 min bei Raumtemperatur und den überstand abgesaugt. Mit einer einzigen Pipette und mit der gleichen Spitze, übertragen alle Zelle Pellets in ~ 70 – 80 μl Restvolumen, ein Polystyrol-Röhrchen. Nicht kann die PIPETTENSPITZE Auswerfen; die einzige Pipette mit diesem Tipp beiseite.</li>
	<li>Fügen Sie mit einer Mehrkanal-Pipette und neue Tipps hinzu ~ 100 μL CSM jeder ursprünglichen Cluster Tube Zelle Erholung zu maximieren. Übertragen Sie mit der einzigen Pipette mit der Spitze, die beiseite gesetzt wurde alle Zelle Pellets in ~ 100 μL Restvolumen auf das gleiche Polystyrol Rohr.</li>
	<li>Oben das Polystyrol Rohr (~ 3 mL) CSM hinzufügen. Graf und Aufzeichnung der Handynummer des gepoolten Barcodes eingestellt. Zentrifugieren bei 600 X g für 5 min bei Raumtemperatur und den überstand abgesaugt. Fahren Sie mit der Färbung der Barcode-Proben am gleichen Tag. Hinweis: Es ist normal, ~ 20 – 30 % Zellverlust Barcoding dabei zu erwarten.</li>
</ol>4. Färbung des Barcodes feste lysiert/Blutkörperchen und Vorbereitung für die Analyse auf Masse Zytometrie Instrument
Hinweis: Je 1 X Titer der Färbung Antikörper (1 μl des Antikörpers pro 100 μL Färbung Reaktion), kann in der Regel 3 – 4 x 106 Zellen färben. Daher, wenn alle Barcodes Proben in einem Rohr gebündelt sind, muss die Menge des Antikörpers hochskaliert werden. Wenn 20 Barcodes Proben belaufen sich auf 30 x 106 Zellen und jeweils 1 X Titer 3 – 4 x 106 Zellen färben kann, erfordert die Barcode-Probe nur einen 10 X-Titer, im Gegensatz zu beflecken jede Probe individuell, erfordern eine 20 X Menge des Antikörpers (1 X pro einzelne Röhre). Die Konzentration des Antikörpers zu Handynummer sollte sorgfältig für jeden einzelnen Antikörper cocktail (hier nicht behandelt) titriert werden.
<ol><li>Färben Sie die Zellen mit Antikörpern (Table of Materials) für Oberflächen Beflecken und Zytokin-Induktion.<ol>
<li>Machen die Oberfläche Färbung cocktail durch die Berechnung des Betrags, um hinzugefügt und Buchhaltung für Pipettier Fehler sein (d. h., wenn 20 Barcodes Proben von 2 x 106 Zellen in jeder Probe Färbung einem 10-fach Titer Fleck ist erforderlich; für Endvolumen Berechnungen, pipettieren Fehler von denen ein 10,5 X Finale Färbelösung auszugleichen Sie).</li>
		<li>Fügen Sie 10 X Wert der Oberfläche Volumen zum Barcode Zelle Pellet Färbung. Verringerung des zellverlustes, mit der gleichen Spitze, mischen Sie und Messen Sie die Lautstärke der Oberfläche Flecken und Zelle Pellet.</li>
		<li>Basierend auf das Volumen der Zellen und Färbung cocktail, CSM fügen Sie eine Färbung Endvolumen von 50 μL pro Anzahl der Zellproben (d. h., wenn eine Reihe von 20 Proben, 50 μL X 20 = 1 mL ausgeführt hinzu). 30 min bei 4 ° c inkubieren Schütteln Sie die Probe alle 15 min zur Förderung sogar Färbung.</li>
		<li>Während der Inkubation Oberfläche Fleck bereiten Sie Perm/Waschpuffer (Table of Materials) durch Verdünnung 01:10 mit gefilterten DdH2O. Prepare Volumen von 2 mL für Permeabilisierung und 5 mL zum Waschen. Halten Sie bei 4 ° C oder auf Eis.</li>
		<li>Die Krönung der Oberfläche Beflecken Rohr mit CSM und Zentrifuge bei 600 X g bei 4 ° C für 5 min. Überstands Aspirieren. Aufschwemmen die Barcode-Probe in 2 mL 4 ° C, 01:10 Verdünnung Perm/Waschpuffer. Bei 4 ° C für 20-30 min bis die Zellen voll permeabilize inkubieren.</li>
		<li>Bei 600 X g bei 4 ° C für 5 min zentrifugieren und den überstand abgesaugt.</li>
		<li>Für intrazelluläre Färbung, Schritte ähnliche Färbung (z. B. für Oberfläche Färbung). Jedoch verwenden die 4 ° C, 01:10 Verdünnung Perm/Waschpuffer anstelle der CSM, machen die gesamte Lautstärke Färbung, so dass die Zellen in einem permeabilizing Umfeld in die intrazelluläre Färbung bleiben.</li>
		<li>Fügen Sie der intrazelluläre Antikörper cocktail an die Oberfläche gebeizt und permeabilized Zelle Pellet (Schritte 4.1.2–4.1.17). Bringen Sie die Summe Volumen 50 μL pro Anzahl der Zellproben Färbung. 60 min bei 4 ° c inkubieren Schütteln Sie die Probe alle 15 min darauf sogar Färbung.</li>
		<li>Während die intrazelluläre Färbung, bereiten Sie die Intercalator-Lösung: 900 μl des gefilterten PBS + 100 μL des gefilterten 16 % PFA (Endkonzentration von 1,6 % PFA) + 0,2 μl 500 Umm Intercalator Farbstoff (Table of Materials).</li>
		<li>Die Krönung der Zelle Pellet + cocktail mit kalten 01:10 intrazellulären Antikörper Perm/Waschpuffer.</li>
		<li>Bei 600 X g bei 4 ° C für 5 min zentrifugieren und den überstand abgesaugt. Krönen Sie den befleckenden Schlauch mit CSM. Zählen und Erfassen der Anzahl von Zellen. Bei 600 X g bei 4 ° C für 5 min zentrifugieren und den überstand abgesaugt. Die Zellen in 1 mL Intercalator-Lösung von Schritt 4,9 aufzuwirbeln. Mindestens 20 min bei Raumtemperatur für volle Interkalation inkubieren, oder über Nacht bei 4 ° C (Proben in Intercalator Lösung bei 4 ° C für bis zu 1 Woche vor der Ausführung auf die Masse zytometrie Instrument bleiben).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie die Zellen für die Masse zytometrie Instrument.<ol>
<li>Krönen Sie das Rohr mit 3 mL gefilterte DdH2O und Zentrifuge bei 600 X g für 5 min bei 4 ° C. Aufschwemmen der Zellen in gefilterten DdH2O. Pass 3 mL Suspension durch einen 100 μm-Filter zu entfernen Schmutz oder Aggregate, die potenziell die Masse zytometrie Instrument verstopfen könnten.</li>
		<li>Zählen Sie und erfassen Sie der Zelle Nummer nachfiltrierung. Zentrifuge bei 600 X g für 5 min bei 4 ° C</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie die Wulst Kalibrierlösung (Table of Materials) durch Verdünnen es 01:10 in gefilterten DdH2O.</li>
	<li>Aufschwemmen der gefärbten Zellen in das erforderliche Volumen von 01:10 verdünnt Wulst Kalibrierlösung Zellkonzentration von ~ 1 x 106 Zellen/mL zu erreichen. Hinweis: Für eine CyTOF1 bei 45 µL/min ist das empfohlene Optimum 5 x 105 Zellen/mL; für Helios bei 30 µL/min, 7,5 x 105 Zellen/mL.</li>
	<li>Gehen Sie zum Ausführen des Beispiels auf die Masse zytometrie Instrument9.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Hier beschreiben wir eine neuartige, einzellige, Proteomic Ansatz für mehrere Immunzelle Arten gleichzeitig zu beurteilen und ihre verschiedenen Zytokin-Störungen im Umfeld des Patienten spezifische "pathogenen" peripheren Blutplasma zirkulierende Faktoren zu erkennen. Diese Methode setzt peripheren Vollblut sowie die analytische Fahrzeug Masse zytometrie als Instrument für die Bewertung der immunologischen zellulären phänotypische und funktionelle Veränderungen. Die Methode ist leicht anwendbar auf Menschen und Mäusen S...

Autoimmunerkrankungen sind eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität 3-8 % der Bevölkerung betroffen. In den Vereinigten Staaten, autoimmune-Erkrankungen gehören zu den führenden Todesursachen bei junge und Mittelalte Frauen (Alter < 65 Jahre)1,2. Autoimmune-Erkrankungen zeichnen sich durch heterogene klinische Präsentation und unterschiedlichen zugrunde liegenden immunologische Prozesse. Das Spektrum der Heterogenität ist über verschiedene Störungen, wie gemeinsame Beteiligung bei der rheumatoiden Arthritis (RA) und neurologische Erkrankung bei multipler Sklerose (MS) vertreten. Dieses Maß an Heterogenität zeigt jedoch auch innerhalb einer einzelnen Störung, wie systemischer Lupus erythematodes (SLE): bei einigen Patienten können mit renal Pathologie präsentieren, während andere leiden an hämatologischen oder gemeinsame Beteiligung3.
Die zugrunde liegenden immunpathogenese in Autoimmun-Erkrankungen spiegelt die klinische Heterogenität, mit Auto - und hyper-Aktivierung von angeborenen und der adaptiven Immunzelle Teilmengen und damit einhergehende Dysregulated Produktion von Zytokinen. Während Zytokine eine zentrale Rolle in der Pathogenese von Autoimmunkrankheiten spielen, nachweislich verstehen ihre besondere Rolle in den Mechanismus der Krankheit eine Herausforderung sein. Zytokine sind geprägt von Pleiotropie (ein Zytokin kann mehrere Effekte auf verschiedene Zelltypen haben), Redundanz (mehrere Zytokine können die gleiche Wirkung haben), Dualität (ein Zytokin kann pro- und antiinflammatorische Effekte unter verschiedenen Bedingungen haben), und Plastizität (Zytokine können in eine Rolle unterscheidet sich von der "original", je nach Umgebung geformt werden)4,5,6. Folglich können nicht Populationsebene Methoden heterogene zelluläre Reaktionen auf die gleichen "Zytokin-Milieu" unterscheiden. In ähnlicher Weise bieten Studiendesigns, die sich auf einen spezifischen Aspekt des Immunsystems (eine einzelne Zellentyp oder Cytokine), keine Gesamtbewertung aller Elemente in komplexen Autoimmunkrankheit beteiligt. Während Sera-basierten Studien Patienten wichtige Erkenntnisse zur Autoimmunität geleistet haben, bieten sie nicht die spezifische zelluläre Quelle der Dysregulated Zytokine entdeckt.
Vor kurzem haben wir einen einzelligen Proteomic Ansatz zur Bewertung gleichzeitig mehrere Arten von Immunzellen und ihre verschiedenen Zytokin-Störungen im Umfeld des Patienten spezifische "pathogenen" peripheren Blutplasma zirkulierende Faktoren zu erkennen. Die hier beschriebene Workflow zeichnet sich durch die Verwendung von intakten peripheren Vollblut-Proben, im Gegensatz zu isolierten peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs). Peripheren Blut stellt die meisten physiologisch relevante Fahrzeug immun-vermittelte systemerkrankung, einschließlich 1) nicht-mononukleären Blutzellen oft eingebunden in Autoimmunerkrankung (d.h., Neutrophilen Granulozyten und Thrombozyten) und Plasma (2) studieren zirkulierenden Faktoren wie Nukleinsäuren, Immunkomplexe und Zytokine, haben die immun aktivierende Rollen. Erfassen der "inneren pathogenen" Dysregulated Produktion von Zytokinen, peripherem Blut Proben unmittelbar nach der Blutentnahme (T0, Stunde Null), und nach 6 h Inkubation bei 37 ° C (physiologische Körpertemperatur) mit einem Protein-Transport erfolgt Inhibitor bei fehlender exogene anregende Zustand (T6, Zeit 6 h), Produktion von Zytokinen (Akkumulation, T6-T0) erkennen, die die "intrinsische" Krankheitszustandes (Abbildung 1) widerspiegeln würde. Dysregulated Prozesse, die über widerspiegeln oder unter Aktivierung der Signalwege in Immunreaktionen relevant für die Krankheit, periphere Blutproben sind zu studieren (6 h Inkubation bei 37 ° C mit einem Protein-Transport-Inhibitor) mit einer exogenen behandelt Bedingung, die Pathogenese der Krankheit, wie Toll-Like-Rezeptor (TLR) Agonisten bei SLE (T6 + R848, mal 6 h mit 1 µg/mL R848), um die Produktion von Zytokinen zu erkennen, die eine Reaktion auf Nukleinsäuren widerspiegeln würde reflektiert anregend (Vergleich T0 vs. T6 vs. T6 + R848, Abbildung 1). Um immunmodulatorische Effekte von verfügbaren Therapeutika ex Vivo, studieren, wie sie die präzise immun Dysregulated Prozesse für bestimmte Patienten betreffen, werden mit einem JAK Inhibitor bei den relevanten therapeutischen peripherem Blutproben behandelt. Konzentration (hier 5 Umm Ruxolitinib; T6 + 5R, mal 6 h mit 5 Umm Ruxolitinib), zum Erkennen von Änderungen in "intrinsische" Krankheit Staat als Reaktion auf das Medikament (T0 vs. T6 vs. T6 + 5R, Abbildung 1). Ein JAK Inhibitor wurde für diese Studie ausgewählt, weil JAK-Hemmer nachweislich erfolgreich bei der Behandlung von Autoimmun-Krankheiten wie RA
Um gleichzeitig in mehreren Immunzelle Teilmengen, periphere Blutproben von SLE beschriebenen Dysregulated-Prozesse bewerten wurden Patienten und gesunden Kontrollpersonen verarbeitet, wie oben beschrieben und analysiert durch Masse zytometrie. Masse zytometrie, auch bekannt als Zytometrie-Time-Of-Flight, bietet einzellige Analyse von über 40 Parametern ohne Probleme der spektralen7,8,9überlappen. Diese Technik nutzt seltene Erden Metall-Isotope in Form von löslichen Metall-Ionen als Tags an Antikörpern, statt Fluorophore10gebunden. Zusätzliche Details bezüglich der Masse zytometrie technological Platform (d.h., tuning und Kalibrierung, Probe Erwerb) finden Sie im Leipold Et Al. und McCarthy Et al. 11 , 12 High-Dimensionalität der Masse zytometrie ermöglicht gleichzeitige Messung mehrerer Zytokine in angeborene und adaptive Immunzellen Teilmengen mit einzelligen Granularität (Table of Materials).
Aktuelle konventionellen klinischen und Labor-Parameter sind oft nicht empfindlich oder spezifisch genug, zur Erkennung von laufenden Krankheitsaktivität oder die Reaktion auf bestimmte Immunmodulatoren13, reflektieren die Notwendigkeit, das zugrunde liegende Immunsystem besser abzugrenzen Änderungen, die Schübe zu fahren. Angesichts die Allgegenwart der Cytokine Dysregulation bei Autoimmunerkrankung, haben eine Vielzahl von Behandlungsansätzen, die Antikörper oder kleine Molekulare Inhibitoren targeting Zytokine oder signalproteinen beteiligt bei der Regulierung der Produktion von Zytokinen verwenden vor kurzem entstanden. In ihrer grundlegenden Form bietet der hier beschriebene peripherem Blut analytische Ansatz eine Plattform um patientenspezifische Dysregulated Zelle Teilmengen und ihre abnorme Zytokin-Produktion in Autoimmunerkrankung mit systemischen Manifestationen zu identifizieren. Diese Methodik ermöglicht die Personalisierung von therapeutischen Möglichkeiten wie spezifische Dysregulated Zytokine identifiziert werden können, und eine spezifische Behandlung, die Optionen Ex Vivo getestet zu ihrer Fähigkeit, Immunomodulate zu beurteilen Patienten spezifische Krankheit Prozesses.

<table><tbody><tr><td>Ruxolitinib</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-364729A</td><td>Lagerbestand: 10 mM; Endergebnis: 5 &mu; M</td></tr><tr><td>R848</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-r848-5</td><td>Lagerbestand: 1 &mu; g/&mu; L; Endergebnis: 1 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>LPS-EK</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-eklps</td><td>Bestand Conc: 1 &mu; g/&mu; L; Finale Conc: 0.1 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>steril PBS</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>Lyse/Fix-Puffer</td><td>BD biosciences</td><td>558049</td><td>Lagerbestand: 5X; Final Conc: 1X (verdünnt in ddH2O)</td></tr><tr><td>BD Phosflow Perm/Wash Puffer I</td><td>BD biosciences</td><td>557885</td><td>Lager Conc: 10X; Endwert: 1:10 (verdünnt in ddH2O)</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>21870-076</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazid (NaN3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-8032</td><td>Lagerbestand: >99,9%; Endwert: 0,0002</td></tr><tr><td>Proteintransport-Inhibitor (PTI)</td><td>eBiosciences</td><td>00-4980-93</td><td>Lagerbestand: 500X; Final Conc: 1X</td></tr><tr><td>DNA Intercalator</td><td>Fluidigm</td><td>201192B</td><td>Lager Conc: 500 &mu; M; Finale Conc: 0.1 &mu; M</td></tr><tr><td>Zell-Färbemedien (CSM)</td><td></td><td></td><td>PBS + 0,5 % BSA, 0,02 % NaN3</td></tr><tr><td>MaxPar Barcode Perm Puffer</td><td>Fluidigm</td><td>201057</td><td>Lager Conc: 10X; Final Conc: 1X</td></tr><tr><td>20-Plex PD Barcode Set</td><td>Fluidigm</td><td>S0014</td><td>Lager Conc: n/a; Endwert: n/a</td></tr><tr><td>EQ TM Vier-Element-Kalibrierkugeln</td><td>Fluidigm</td><td>201078</td><td>Lager Conc: 10X; Endwert: 1X</td></tr><tr><td>16% MeOH-freie Formaldehydlösung</td><td>Thermo</td><td>28908</td><td>Lagerwert: 16% (w/v); Endwert: 1,6% (w/v)</td></tr><tr><td>Sterile Polystyrolröhrchen mit rundem Boden</td><td>VWR</td><td>60818-496</td><td>Lagerwert: n/a; Final Conc: n/a</td></tr><tr><td>Polypropylen-Cluster-Rohre</td><td>Light Labs</td><td>A-9001</td><td>Lager Conc: n/a; Final Conc: n/a</td></tr><tr><td>Helios CyTOF Instrument</td><td>Fluidigm</td><td>Helios</td><td>Alle Lösungen, die in der CyTOF-Analyse verwendet werden sollen, müssen frei von Metallverunreinigungen sein. ddH2O wird bei der Herstellung von Lösungen verwendet, die einen spezifischen Widerstand von mindestens 18,0 M&Omega; aufweisen sollten. cm. ddH2O und selbst hergestellte Lösungen sollten in neuen Plastik- oder Glasflaschen gelagert werden, die noch nie autoklaviert wurden.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen</td><td><>Katalognummer<</td><td>strong>Kommentare</td></tr><tr><td>Antikörper für die Massenzytometrie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oberflächenmarker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD1c</td><td>Biolegend</td><td>L161</td><td>Masse: 161</td></tr><tr><td>CD3</td><td>BD</td><td>UCHT1</td><td>Masse: 144</td></tr><tr><td>CD4</td><td>Biolegend</td><td>SK3</td><td>Masse: 174</td></tr><tr><td>CD7</td><td>BD</td><td>M-T701</td><td>Masse: 149</td></tr><tr><td>CD8</td><td>Biolegend</td><td>SK1</td><td>Masse: 142</td></tr><tr><td>CD11b</td><td>Fluidigm</td><td>ICRF44</td><td>Masse: 209</td></tr><tr><td>CD11c</td><td>BD</td><td>B-ly6</td><td>Masse: 152</td></tr><tr><td>CD15</td><td>BD</td><td>HI98</td><td>Masse: 115</td></tr><tr><td>CD14</td><td>Biolegend</td><td>M5E2</td><td>Masse: 154</td></tr><tr><td>CD16</td><td>eBioscience/Thermo</td><td>B73.1</td><td>Masse: 165</td></tr><tr><td>CD19</td><td>Santa Cruz</td><td>SJ25C1</td><td>Masse: 163</td></tr><tr><td>CD21</td><td>Biolegend</td><td>Bu32</td><td>Masse: 141</td></tr><tr><td>CD27</td><td>BD</td><td>L128</td><td>Masse: 155</td></tr><tr><td>CD38</td><td>Fluidigm</td><td>HIT2</td><td>Masse: 172</td></tr><tr><td>CD45 gesamt</td><td>Biolegend</td><td>HI30</td><td>Masse: 89</td></tr><tr><td>CD45RA</td><td>Biolegend</td><td>HI100</td><td>Masse: 153</td></tr><tr><td>CD56</td><td>Miltenyi</td><td>REA196</td><td>Masse: 168</td></tr><tr><td>CD66</td><td>BD</td><td>B1.1/CD66</td><td>Masse: 113</td></tr><tr><td>CD86</td><td>Fluidigm</td><td>IT2.2</td><td>Masse: 150</td></tr><tr><td>CD123</td><td>Fluidigm</td><td>6H6</td><td>Masse: 143</td></tr><tr><td>CD278/ICOS</td><td>Biolegend</td><td>C398.4A</td><td>Masse: 156</td></tr><tr><td>CD179/PD1</td><td>Biolegend</td><td>EH12.2H7</td><td>Masse: 162</td></tr><tr><td>IgD</td><td>Biolegend</td><td>IA6-2</td><td>Masse: 146</td></tr><tr><td>IgM</td><td>Biolegend</td><td>MHM-88</td><td>Masse: 151</td></tr><tr><td>CXCR5</td><td>BD</td><td>RF8B2</td><td>Masse: 173</td></tr><tr><td>HLADR</td><td>Biolegend</td><td>L243</td><td>Masse: 167</td></tr><tr><td><stark>Zytokine</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IL-1&alpha;</td><td>Biolegend</td><td>364-3B3-14</td><td>Masse: 147</td></tr><tr><td>IL-1&beta;</td><td>Biolegende&nbsp;</td><td>H1b-98</td><td>Masse: 169</td></tr><tr><td>IL-1RA</td><td>Santa Cruz&nbsp;</td><td>AS17</td><td>Masse: 157</td></tr><tr><td>IL-6</td><td>Biolegend</td><td>MQ2-13A5</td><td>Masse: 164</td></tr><tr><td>IL-8</td><td>BD</td><td>E8N1</td><td>Masse: 160</td></tr><tr><td>IL-12/IL-23p40</td><td>Biolegend&nbsp;</td><td>C8.6</td><td>Masse: 171</td></tr><tr><td>IL-17A</td><td>Biolegende&nbsp;</td><td>BL168</td><td>Masse: 148</td></tr><tr><td>IL23p19</td><td>eBioscience/Thermo</td><td>23dcdp</td><td>Masse: 176</td></tr><tr><td>MIP1&beta;</td><td>BD</td><td>D21-1351</td><td>Masse: 158</td></tr><tr><td>MCP1</td><td>BD</td><td>5D3-F7</td><td>Masse: 170</td></tr><tr><td>IFN&alpha;</td><td>Miltenyi&nbsp;</td><td>LT27:295</td><td>Masse: 175</td></tr><tr><td>IFN&gamma;</td><td>Biolegend</td><td>4S. B3</td><td>Masse: 165</td></tr><tr><td>PTEN</td><td>BD</td><td>A2B1</td><td>Masse: 159</td></tr><tr><td>TNF&alpha;</td><td>Biolegend</td><td>Mab11</td><td>Masse: 166</td></tr><tr><td>Hinweis: Wenn der Hersteller als Fluidigm angegeben ist, wurde dieser Antikörper von Fluidigm mit vorkonjugiertem Metall gekauft. Wenn der Hersteller als ein anderer als Fluidigm angegeben ist, wurde dieser Antikörper mit dem MaxPar Multi-Metal Labeling selbst konjugiert. Kit (Fluidigm Cat: 201300) gemäß Herstellerprotokoll.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

einzellige analyse der immunophenotype und produktion von zytokinen im peripheren blut über masse zytometrie

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Zytokine spielen eine zentrale Rolle in der Pathogenese von Autoimmunkrankheiten. Daher wurde die Messung der Zytokin Ebenen der Schwerpunkt von mehreren Studien in einem Versuch, die genauen Mechanismen zu verstehen, die zum Zusammenbruch der Selbsttoleranz und anschließende Autoimmunität führen. Ansätze bisher basieren auf der Studie einen spezifischen Aspekt des Immunsystems (Single oder paar Zelltypen oder Zytokine) und bieten keine umfassende Beurteilung der komplexen Autoimmunerkrankung. Während Sera-basierten Studien Patienten wichtige Erkenntnisse zur Autoimmunität geleistet haben, bieten sie nicht die spezifische zelluläre Quelle der Dysregulated Zytokine entdeckt. Eine einzellige Gesamtkonzept für die Produktion von Zytokinen in mehreren Immunzelle Teilmengen im Rahmen des "intrinsische" Patienten-spezifischen Plasma zirkulierenden Faktoren zu bewerten ist hier beschrieben. Dieser Ansatz ermöglicht die Überwachung des Patienten-spezifischen immun Phänotyps (oberflächenmarker) und Funktion (Zytokine), entweder in seiner Heimat "inneren pathogenen" Krankheit Staat, oder in der Gegenwart von Therapeutika (in Vivo und ex Vivo).

Abbildung 1 zeigt den Workflow für die Stimulation und Verarbeitung der peripheren Blutproben, einschließlich Zuweisung von Blut Probe Aliquote, Timing der Zusatz von Stimulation, Protein Inhibitor cocktail, und Inkubation Zeiten bis zur Lyse der Erythrozyten (RBC) und Fixierung. Die Wahl der anregenden Agenten hängt von der Signal- und Cytokine Bahnen, die für die Bewertung ausgerichtet sind. Beispielsweise werden in dem hier beschriebenen Protokoll TLR-Agon...

Hier beschreiben wir einen Einzellige Proteomic Ansatz um Immune phänotypische und funktionelle (intrazelluläre Zytokin Induktion) bewerten Veränderungen in peripheren Vollblut Proben, über Masse zytometrie analysiert.

Einzellige Analyse der Immunophenotype und Produktion von Zytokinen im peripheren Blut über Masse Zytometrie

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...

Diese Methode kann helfen, Fragen im Bereich der Autoimmunität zu beantworten, wie z. B. die Identifizierung von Anomalien der Zellfrequenz und Funktionsunterschiede, wie z. B. die Produktion von Schlüsselzytokinen im Rahmen von Autoimmunerkrankungen. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass sie ein breites Repertoire oder verschiedene Zelltypen und Funktionsunterschiede aus einer leicht erhältlichen peripheren Blutprobe erfassen kann. Im Allgemeinen können Personen, die neu in diesem Prozess sind, Schwierigkeiten haben, das Timing der Blutverarbeitungsschritte, das Design des Antikörper-Panels, den Barcoding-Prozess selbst und die Analyse hochdimensionaler Einzelzelldaten zu finden.Dieser systemimmunologische Ansatz eignet sich besonders für Autoimmunerkrankungen wie SLE, bei denen die Immundysregulation weit verbreitet und im peripheren Blut offensichtlich ist. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist wichtig, um das Timing der Schritte zu verdeutlichen und auch zu zeigen, wie mehrere Proben vor der Massenzytometrie-Analyse mit einem Barcode versehen und gepoolt werden können. Um diesen Vorgang zu starten, legen Sie die beschrifteten Polystyrolröhrchen mit rundem Boden und fünf verschiedenen Bedingungen für die Vollblutverarbeitung auf ein Gestell.Geben Sie als Nächstes einen Milliliter 37 Grad Celsius RPMI in jedes Röhrchen. Geben Sie dann einen Milliliter Vollblut in jedes Röhrchen und pipettieren Sie mehrmals auf und ab, um es gründlich mit RPMI zu mischen. Geben Sie anschließend 10 Mikroliter vorverdünntes Ruxolitinib in das Röhrchen mit der Bezeichnung T sechs plus fünf R und mischen Sie gründlich.Stellen Sie das Gestell mit den Röhrchen bei 37 Grad Celsius in den Inkubator und beginnen Sie mit der Timierung der Inkubation. Um die T-Null-Probe zu verarbeiten, pipettieren Sie den gesamten Inhalt des T-Null-Röhrchens in ein markiertes konisches Röhrchen mit 20 Millilitern 37 Grad Celsius Lyse-/Fix-Puffer bei Arbeitskonzentration. Um die Zellrückgewinnung zu optimieren, spülen Sie das Röhrchen mit Lyse/Fix-Puffer und mischen Sie, indem Sie das konische Röhrchen umdrehen.Inkubieren Sie die Zellen 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um eine Lyse und Fixierung zu ermöglichen. Zentrifugieren Sie die Zellen dann fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 500-facher G-Menge. Anschließend wird der Überstand dekantiert und die Zellen in einem Milliliter eiskaltem PBS wieder suspendiert, um das Pellet aufzubrechen.Füllen Sie dann das konische Röhrchen bis zu einem Volumen von 15 Millilitern mit PBS. Anschließend zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 500 mal G. Suspendieren Sie die Zellen erneut in einem Milliliter CSM, um das Pellet aufzubrechen.Übertragen Sie dann die Probe zur Antikörperfärbung in ein markiertes Mikrozentrifugenröhrchen. Zählen Sie die Zellen mit einem automatisierten Zellzähler mit einer 10-Mikroliter-Probe. Zentrifugieren Sie anschließend die Zellen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 500 mal G.Anschließend wird der Überstand abgesaugt, wobei das Pellet in etwa 60 Mikrolitern Rückstand verbleibt. Bewahren Sie dieses Pellet auf Eis auf, bis die Proben aus anderen Bedingungen die Verarbeitung abgeschlossen haben. Bei T gleich 30 Minuten wird das Röhrchengestell in die Gewebekulturhaube überführt.Geben Sie 10 Mikroliter R848 zu 0,1 Gramm pro Mikroliter in das Tube T six plus R848 und mischen Sie gründlich. Geben Sie dann 10 Mikroliter LPS mit 0,01 Mikrogramm pro Mikroliter in das T six plus LPS-Röhrchen und mischen Sie gründlich. Geben Sie anschließend vier Mikroliter Proteintransportinhibitor in die Röhrchen mit der Aufschrift T sechs, T sechs plus fünf R und T sechs plus LPS und geben Sie die Proben in den Inkubator zurück, bis T sechs Stunden beträgt.Mischen Sie die Proben alle zwei Stunden gründlich mit einer P1000-Pipette. Bei T gleich zwei Stunden geben Sie vier Mikroliter Proteintransportinhibitor-Cocktail in das Tube T sechs plus R848. Mischen Sie alle Proben und stellen Sie das Gestell wieder in den Inkubator, bis T sechs Stunden entspricht.Bei T gleich vier Stunden mischen Sie die Proben noch einmal mit einer P1000-Pipette. Bei T gleich sechs Stunden sind T sechs, T sechs plus LPS, T sechs plus R848 und T sechs plus fünf R-Blutprobenröhrchen zu verarbeiten, wie für die T Null-Probe beschrieben. Lagern Sie die Pellets dann im Rest-CSM-Volumen bei minus 80 Grad Celsius, um sie später zu verarbeiten.Um die lysierten, fixierten Zellen mit einem Barcode zu versehen, tauen Sie die Proben aus der bei minus 80 Grad Celsius warmen Lagerung langsam auf Eis auf. Verdünnen Sie den 10-fachen Barcoding-Perm-Puffer mit PBS um eins bis 10 und stellen Sie genügend Puffer für drei Milliliter pro Probe her. Füllen Sie einen unsterilen Trog mit CSM und einen mit dem einen X Barcoding Perm-Puffer.Geben Sie dann einen Milliliter eiskaltes CSM zu den frisch aufgetauten Proben, mischen Sie es gründlich und geben Sie es in die entsprechenden vorbeschrifteten Polypropylen-Cluster-Röhrchen. Entnehmen Sie nun eine 10-Mikroliter-Probe und zählen Sie die Zellen mit einem automatisierten Zellzähler. Normalisieren Sie die Zellzahlen in jedem Cluster-Röhrchen, indem Sie das Volumen der überschüssigen Zellen entfernen.Zentrifugieren Sie dann die Zellen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 600-facher G-Temperatur. Suspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter eines X-Barcoding-Perm-Puffers mit einer Mehrkanalpipette und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 600-fachem G. Saugen Sie anschließend den Überstand ab.Richten Sie die Cluster-Röhrchen in der gleichen Reihenfolge wie auf dem Barcode-Schlüssel angegeben auf einem Gestell aus, sodass die Probe mit dem Barcode übereinstimmt. Geben Sie 800 Mikroliter eines X-Barcoding-Perm-Puffers per Mehrkanalpipette zu allen Proben in den Cluster-Röhrchen, ohne das Zellpellet zu berühren, um den Zellverlust zu reduzieren. Stellen Sie dann das Gestell mit den Cluster-Röhren beiseite.Entfernen Sie die Röhrenstreifen des 20-Plex-Palladium-Barcode-Kits bei minus 20 Grad Celsius und tauen Sie sie bei Raumtemperatur auf. Geben Sie 100 Mikroliter eines X-Barcode-Perm-Puffers hinzu, mischen Sie gründlich und überführen Sie 120 Mikroliter der resuspendierten Barcode-Mischung in die entsprechenden Zellproben in den Cluster-Röhrchen. Gründlich mit einer Mehrkanalpipette mischen, damit es zu keiner Kreuzkontamination zwischen einzelnen Barcode-Proben kommt.Inkubieren Sie Cluster-Röhrchen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur, damit die Barcodes die Zellen kennzeichnen können. Nach 30 Minuten werden die Proben bei 600-fachem G fünf Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Aspirieren Sie den Überstand und suspendieren Sie ihn dann wieder in einem Milliliter CSM.Anschließend zentrifugieren und erneut in CSM suspendieren. Danach wird bei 600 mal G fünf Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert und der Überstand aspiriert. Übertragen Sie mit einer einzigen Pipette und mit derselben Spitze alle Zellpellets in etwa 70 bis 80 Mikrolitern Restvolumen in ein Styroporröhrchen.Werfen Sie die Pipettenspitze nicht aus. Legen Sie die einzelne Pipette mit dieser Spitze beiseite. Mit einer Mehrkanalpipette und neuen Spitzen können Sie 100 Mikroliter CSM in jedes Original-Cluster-Röhrchen geben, um die Zellrückgewinnung zu maximieren.Übertragen Sie mit der einzelnen Pipette und der beiseite gelegten Spitze alle Zellpellets mit 100 Mikrolitern Restvolumen in dasselbe Polystyrolröhrchen. Fügen Sie CSM hinzu, um das Styroporrohr auf etwa drei Milliliter aufzufüllen. Zählen und notieren Sie die Zellennummer des gepoolten Barcode-Satzes.Dann wird bei 600 mal G fünf Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert und der Überstand aspiriert. Fahren Sie noch am selben Tag mit dem Färben der Barcode-Proben fort. Dieses Schema zeigt den Arbeitsablauf für die Stimulation und Verarbeitung der peripheren Blutproben, einschließlich der Zuteilung von Blutprobenaliquoten, des Zeitpunkts der Zugabe von Stimulationsmitteln, des Proteintransportinhibitor-Cocktails und der Inkubationszeiten bis zur Lyse und Fixierung der roten Blutkörperchen.Die Wahl der Stimulierungsmittel hängt von den Signal- und Zytokinwegen ab, auf die die Bewertung abzielt. Nach der Fixierung und Erythrozytenlyse wurden die einzelnen lysierten, fixierten Zellproben eines gesunden Spenders mit einem Barcode versehen, mit 26 Antikörpern gegen Oberflächenmarker markiert, permeabilisiert und mit 14 Antikörpern gegen Zytokine gefärbt. Die Limited-Gating-Strategie, die die Identifizierung von CD14-hohen Monozyten darstellt, ist hier dargestellt.Von links nach rechts ist jedes dargestellte 2D-Diagramm eine Teilmenge der Grundgesamtheit von der übergeordneten Grundgesamtheit, die von dem 2D-Diagramm unmittelbar links abgegrenzt wird. Unter Verwendung von CD14-hohen Monozyten als repräsentativ für acht Immunzell-Subgruppen wurde eine Massenzytometrie-Analyse an peripheren Blutproben eines gesunden Spenders zum Zeitpunkt Null ohne Stimulation und nach Stimulation mit dem TLR-Agonisten LPS und R848 und dem T-Zell-Aktivator PMA Ionomycin durchgeführt. Es wird ein Beispiel für die Zytokininduktion in CD14-hohen Monozyten gezeigt und ausgewählte Zytokine mit Spezifität zum verwendeten Stimulationsmittel dargestellt.R848 induziert selektiv die IL-12p40-Untereinheit und MCP1 in CD14-hohen Monozyten, während LPS dies nicht tut. Im Gegensatz dazu induziert PMA-Ionomycin keine Zytokine in CD14-hohen Monozyten. Sobald die Blutstimulation gemeistert ist, können sie in etwa sieben Stunden durchgeführt werden, und der Barcode-Schritt kann in nur etwa einer Stunde durchgeführt werden.Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, auf das Timing der Schritte zu achten und entsprechend im Voraus zu planen. Sobald Sie dieses Verfahren eingerichtet haben, können Sie in Erwägung ziehen, die Blutstimulationsbedingungen im Massenzytometrie-Panel zu ändern, um die Immunzellreaktionen zu bewerten, die spezifisch für Ihre eigenen Forschungsziele sind. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Zytokinreaktionen aus Vollblutproben hervorruft und wie man mehrere Proben in einem Barcode-Set für die Massenzytometrie-Analyse zusammenfasst.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

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