Implementierung eines Systems durchlässige Membran Insert-basierten Infektion der Auswirkungen von sekretierten bakteriellen Toxins zur Untersuchung auf Säugetierwirtszellen

Das übergeordnete Ziel dieses auf durchlässigen Membraninserts basierenden Infektionssystems besteht darin, die Wirkungen bakterieller Toxine auf Wirtszellen während einer Infektion zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Wirt-Pathogen-Interaktionen zu beantworten, beispielsweise wie spezifische sekretierte bakterielle Komponenten zu den Reaktionen der Wirtszellen während einer bakteriellen Infektion beitragen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie die Untersuchung sekretierter bakterieller Komponenten ermöglicht und eine physiologisch relevantere Wirt-Pathogen-Umgebung im Kontext einer menschlichen Infektion besser abbildet.

Die Durchführung des Verfahrens wird Rebecca Flaherty, eine Doktorandin aus meinem Labor, übernehmen. Um isogene Wildtyp-Stämme von Gruppe-A-Streptokokken (GAS) und GAS-M1T1-5448-Mutanten vorzubereiten, beginnen Sie mit Übernachtkulturen, indem Sie fünf bis zehn Milliliter Todd-Hewitt-Brühe ansäen und 16 Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren. Zentrifugieren Sie die Übernachtkulturen der Bakterien und resuspendieren Sie das Pellet in dem ursprünglichen Volumen frischem Bakterienmedium.

Normieren Sie anschließend die Bakterienkulturen auf gleiche Startkonzentrationen, indem Sie die erneut suspendierten Kulturen durch Zugabe von zusätzlichem Medium auf denselben OD600 einstellen. Um Lysate für Signalanalysen und ATP-Bestimmungen zu gewinnen, säen Sie HaCaT-Zellen in sechswelligen Platten mit einer Ansiedlungsdichte von etwa drei mal 10 hoch fünf Zellen pro Vertiefung aus und kultivieren Sie sie bis zu 90 % Konfluenz. Für Ethidiumhomodimer-Membranpermeabilisierungs- und Lactatdehydrogenase-Freisetzungsassays säen Sie HaCaT-Zellen in 24-well-Platten mit einer Ansiedlungsdichte von etwa fünf mal 10 hoch vier Zellen pro Vertiefung aus und lassen sie bis zu 90 % Konfluenz wachsen.

Kurz vor der Behandlung die Zellen mit 1x PBS waschen. Anschließend zwei Milliliter frisches Wachstumsmedium mit oder ohne pharmakologische Behandlung in die 6-Loch-Platten geben oder 0,5 Milliliter Medium in die Vertiefungen der 24-Loch-Platten. Danach unter einer sterilen Flüssigkeitsabsaughaube mit sterilen Pinzetten vorsichtig einen sterilen durchlässigen Membraneinsatz mit einer Porengröße von 0,4 Mikrometern in jedes Loch einbringen.

Die schonende und sterile Handhabung der durchlässigen Einsätze während der Infektionsvorbereitung ist entscheidend, um zu verhindern, dass die Membran während dieses Vorgangs beschädigt oder kontaminiert wird. Geben Sie frisches Zellkulturmedium in die obere Kammer jedes Wells gemäß den Herstelleranweisungen. Anschließend geben Sie ein geeignetes Volumen der normalisierten Bakterienkulturen in die obere Kammer des durchlässigen Membraneinsatzsystems und fügen Sie Bakterienmedium in die Kontrollwells hinzu.

Das sorgfältige Hinzufügen der Bakterien in die obere Kammer sowie der schonende Transport der infizierten Zellen in den Inkubator sind entscheidend, da es unbedingt vermieden werden muss, dass Bakterien während des Versuchsaufbaus die untere Kammer kontaminieren. Um freigesetzte Wirtproteine zu untersuchen, entfernen Sie mit sterilen Pinzetten vorsichtig den durchlässigen Membraneinsatz. Sammeln Sie anschließend unter möglichst geringer Störung der Zellmonolayer das Medium aus der unteren Kammer in 1,5-Milliliter-Röhrchen.

Zentrifugieren Sie die Proben bei 14.000 RCF und vier Grad Celsius für 10 Minuten, um zellulären Abfall zu pelletieren. Entfernen Sie anschließend alles bis auf 50 Mikroliter des Überstandes, überführen Sie diesen in ein frisches 1,5-Milliliter-Röhrchen und lagern Sie bei minus 20 Grad Celsius oder verwenden Sie ihn unmittelbar. Zur Beurteilung von Wirtszelllysaten aspirieren Sie vorsichtig das Medium über der Zellschicht, ohne die Wirtszellen zu stören.

Anschließend die Zellen einmal mit PBS spülen. Den PBS vorsichtig abpipettieren und unmittelbar ein Volumen eiskalter Lysepuffer hinzufügen, um beispielsweise eine Proteinkonzentration von 0,5 bis 1,5 Milligramm pro Milliliter zu erreichen. Danach die Proben 15 Minuten auf Eis inkubieren.

Verwenden Sie anschließend einen Zellabstreifer, um die Zellen von der Plattenoberfläche jedes Wells zu lösen, und überführen Sie den gesamten Inhalt jedes Wells in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Proben dann bei 14.000 RCF und vier Grad Celsius für 20 Minuten. Um lösliche Lysatbestandteile zu analysieren, überführen Sie das Überstand in ein neues Röhrchen und lagern Sie es bei minus 20 Grad Celsius oder verwenden Sie es unmittelbar.

Um nukleäre oder andere unlösliche Lysatbestandteile zu untersuchen, das Pellet auffangen und bei minus 20 Grad Celsius lagern oder sofort verwenden. Zur Untersuchung mittels Immunfluoreszenzbildgebung das Medium abpipettieren und die Zellen mit 1x kalter PBS waschen. Anschließend die Zellen mit 4 % PFA in PBS über Nacht fixieren.

Führen Sie weitere Analysen gemäß dem Textprotokoll durch. Die hier gezeigten Western-Blot-Daten demonstrieren eine signifikant verstärkte Aktivierung der p38-MAP-Kinase und der Keratinozyten in Gegenwart von Streptolysin S oder SLS-produzierenden Gas-Stämmen, was darauf hinweist, dass dieses System zur Beurteilung von Veränderungen in der Aktivierung kontaktunabhängiger Wirtssignalproteine verwendet werden kann. In dieser Abbildung wird die SLS-abhängige Aktivierung des wichtigen entzündungsfördernden Mediators nukleärer Faktor-kappa B gezeigt, der bei Aktivierung aus dem Zytoplasma in den Zellkern transloziert; dies zeigt, dass dieses System zur Visualisierung der Wirkung sekretierter bakterieller Faktoren auf die Proteinantworten des Wirts mithilfe immunfluoreszenzmikroskopischer Verfahren genutzt werden kann.

Hier werden signifikante Zunahmen sowohl der Membranpermeabilisierung als auch der Freisetzung von LDH aus Wirtszellen nach Exposition gegenüber SLS-produzierenden Gas-Stämmen im Vergleich zu nicht infizierten Zellen oder Zellen, die einem SLS-defizienten Stamm ausgesetzt waren, gezeigt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass dieses System toxische Abhängigkeit von Veränderungen in der zellulären Zytotoxizität beurteilen kann. In diesem Experiment wurden die ATP-Spiegel in Keratinozyten und deren Reaktion auf Gas-Infektion bestimmt.

16 Stunden nach der Infektion wurde eine signifikante Abnahme des ATP beobachtet, und der Verlust an ATP war in Gegenwart von SLS stärker ausgeprägt, was mit den toxinabhängigen Anstiegen der Signalübertragung der Wirtszellstressantwort und der Toxizität übereinstimmt. Sobald diese Technik etabliert ist, kann sie verwendet werden, um die spezifischen Reaktionen jedes sekretierten mikrobiellen Faktors auf eine Vielzahl von Wirtszelltypen zu untersuchen. Während der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, während aller experimentellen Aufbauschritte sterile Technik anzuwenden und die permeablen Membraneinsätze sowohl während des anfänglichen Aufbaus als auch während der Probenentnahme sorgfältig zu handhaben.

Nach Durchführung dieses Verfahrens können Methoden wie Western Blotting, Immunfluoreszenz-Mikroskopie und Membranpermeabilisierungs-Assays durchgeführt werden, um zu bestimmen, wie der bakterielle Faktor des Interesses zu Veränderungen in Signaltransduktionskaskaden beiträgt und die gesamte Zytotoxizität während einer Infektion beeinflusst. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Wirtszellproben für die Untersuchung einer Vielzahl von Wirtszellantworten nach Exposition gegenüber einem bestimmten sekretierten bakteriellen Faktor des Interesses vorbereitet werden. Vergessen Sie nicht, dass der Umgang mit biohazardösen Materialien, wie bakteriellen Pathogenen, bestimmte Sicherheitsaspekte erfordert.

Die angemessene Verwendung von Schutzbrille, Handschuhen und Laborkitteln sowie die korrekte Nutzung einer Biosicherheitswerkbank ist notwendig, um diese Experimente sicher durchzuführen.