Implementierung eines Systems durchlässige Membran Insert-basierten Infektion der Auswirkungen von sekretierten bakteriellen Toxins zur Untersuchung auf Säugetierwirtszellen

Das übergeordnete Ziel dieses permeablen Membraninsert-basierten Infektionssystems ist es, die Auswirkungen von sekretierten Bakterientoxinen auf Wirtszellen während der Infektion zu untersuchen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Wirt-Pathogen-Interaktionen zu beantworten, z. B. wie bestimmte sezernierte bakterielle Komponenten zu den Reaktionen der Wirtszellen während einer bakteriellen Infektion beitragen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Untersuchung von sezernierten Bakterienbestandteilen ermöglicht und eine physiologisch relevante Wirt-Pathogen-Umgebung im Kontext einer menschlichen Infektion genauer modelliert.

Rebecca Flaherty, eine leitende Doktorandin aus meinem Labor, wird das Verfahren vorführen. Zur Herstellung von isogenen Wildtyp-Streptokokken der Gruppe A (GAS) und GAS M1T1 5448-Mutantenstämme beginnen Sie mit der Injektion von Flüssigkulturen über Nacht, indem Sie fünf bis 10 Milliliter Todd-Hewitt-Bouillon inokulieren und 16 Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Zentrifugieren Sie die Bakterienkulturen über Nacht und verwenden Sie das ursprüngliche Volumen des frischen Bakterienmediums, um das Pellet wieder zu suspendieren.

Normalisieren Sie dann die Bakterienkulturen auf die gleichen Ausgangskonzentrationen, indem Sie die resuspendierten Kulturen in zusätzlichem Medium verdünnen, um den gleichen OD600 zu erhalten. Um Lysate für die Durchführung von Signalanalysen und ATP-Bestimmungsassays zu sammeln, werden HaCaT-Zellen in Sechs-Well-Schalen mit einer Sitzdichte von etwa dreimal 10 bis zu den fünften Zellen pro Well plattiert und auf 90 % Konfluenz kultiviert. Zur Durchführung von Ethidium-Homodimer-Membranpermeabilisierungs- und Laktatdehydrogenase-Freisetzungsassays werden HaCaT-Zellen in 24-Well-Schalen mit einer Sitzdichte von etwa fünfmal 10 bis zu den vierten Zellen pro Well plattiert und auf 90 % Konfluenz anwachsen.

Verwenden Sie unmittelbar vor der Behandlung 1x PBS, um die Zellen zu waschen. Tragen Sie dann zwei Milliliter frisches Wachstumsmedium mit oder ohne pharmakologische Behandlung auf die Sechs-Well-Platten oder 0,5 Milliliter Medium auf die Wells der 24-Well-Platten auf. Verwenden Sie anschließend eine sterile Pinzette unter einer Laminar-Flow-Haube, um vorsichtig einen sterilen 0,4 Mikrometer durchlässigen Membraneinsatz in jede Vertiefung zu platzieren.

Ein schonender und steriler Umgang mit den durchlässigen Einsätzen während der Infektionsvorbereitung ist entscheidend, um zu verhindern, dass die Membran während dieses Prozesses beeinträchtigt oder kontaminiert wird. Tragen Sie frisches Zellkulturmedium gemäß den Anweisungen des Herstellers auf die obere Kammer jeder Vertiefung auf. Tragen Sie dann ein geeignetes Volumen der normalisierten Bakterienkulturen auf die obere Kammer des permeablen Membraneinsatzsystems auf und tragen Sie Bakterienmedium auf die Kontrollvertiefungen auf.

Eine sorgfältige Zugabe der Bakterien in die obere Kammer sowie ein schonender Transport der infizierten Zellen zum Inkubator sind entscheidend, da es wichtig ist, dass Bakterien während des Versuchsaufbaus die untere Kammer nicht kontaminieren. Um zu beurteilen, ob sezernierte Wirtsproteine vorhanden sind, verwenden Sie eine sterile Pinzette, um den permeablen Membraneinsatz vorsichtig zu entfernen. Sammeln Sie dann, ohne die Monoschicht der Zellen zu stören, das Medium aus der unteren Kammer in 1,5-Milliliter-Röhrchen.

Zentrifugieren Sie die Proben 10 Minuten lang bei 14.000 RCF und vier Grad Celsius, um Zelltrümmer zu pelletieren. Entfernen Sie dann alle bis auf 50 Mikroliter des Überstands, geben Sie ihn in ein frisches 1,5-Milliliter-Röhrchen und lagern Sie ihn bei minus 20 Grad Celsius oder verwenden Sie ihn sofort. Zur Beurteilung der Lysate der Wirtszelle wird das Medium sanft über der Monoschicht abgesaugt, ohne die Wirtszellen zu stören.

Verwenden Sie dann PBS, um die Zellen einmal zu spülen. Aspirieren Sie das PBS vorsichtig und tragen Sie sofort ein Volumen eiskalten Lysepuffers auf, um beispielsweise eine Proteinkonzentration von 0,5 bis 1,5 Milligramm pro Milliliter zu erreichen. Inkubieren Sie die Proben dann 15 Minuten lang auf Eis.

Verwenden Sie anschließend einen Zellschaber, um die Zellen von der Plattenoberfläche jeder Vertiefung zu lösen, und übertragen Sie den gesamten Inhalt jeder Vertiefung in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Proben dann 20 Minuten lang bei 14.000 RCF und vier Grad Celsius. Um lösliche Lystatbestandteile zu beurteilen, überführen Sie den Überstand in ein frisches Röhrchen und lagern Sie ihn bei minus 20 Grad Celsius oder verwenden Sie ihn sofort.

Zur Beurteilung von nuklearen oder anderen unlöslichen Lysatbestandteilen das Pellet aufbewahren und bei minus 20 Grad Celsius lagern oder sofort verwenden. Für die Beurteilung durch Immunfluoreszenzbildgebung aspirieren Sie das Medium und verwenden Sie 1x kaltes PBS, um die Zellen zu waschen. Fixieren Sie die Zellen dann mit 4% PFA und PBS über Nacht.

Führen Sie weitere Analysen gemäß dem Textprotokoll durch. Die hier gezeigten Western-Blot-Daten zeigen eine signifikant erhöhte Aktivierung der p38-MAP-Kinase und der Keratinozyten in Gegenwart von Streptolysin S- oder SLS-produzierenden Gasstämmen, was darauf hindeutet, dass dieses System zur Beurteilung von Veränderungen in der Aktivierung von kontaktunabhängigen Wirtssignalproteinen verwendet werden kann. In dieser Abbildung ist die SLS-abhängige Aktivierung des wichtigsten Entzündungsmediators Kernfaktor-Kappa B, der bei Aktivierung vom Zytoplasma in den Zellkern transloziert, dargestellt, was darauf hindeutet, dass dieses System verwendet werden kann, um die Auswirkungen von sezernierten bakteriellen Faktoren auf die Reaktionen von Wirtsproteinen mit Hilfe von Immunfluoreszenzmikroskopie-Ansätzen zu visualisieren.

Hier wird eine signifikante Zunahme sowohl der Membranpermeabilisierung als auch der Freisetzung von LDH aus Wirtszellen nach Exposition gegenüber SLS-produzierenden Gasstämmen im Vergleich zu nicht infizierten Zellen oder Zellen, die einem SLS-defizienten Stamm ausgesetzt waren, gezeigt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass dieses System toxinabhängige Veränderungen der Zytotoxizität des Wirts beurteilen kann. In diesem Experiment wurden die ATP-Spiegel in Keratinozyten und das Ansprechen auf eine Gasinfektion bestimmt.

16 Stunden nach der Infektion wurde eine signifikante Verringerung des ATP beobachtet, und der Verlust von ATP war in Gegenwart von SLS ausgeprägter, was mit dem toxinabhängigen Anstieg der Stressantwort des Wirts und der Toxizität übereinstimmt. Sobald diese Technik etabliert ist, kann sie verwendet werden, um die spezifischen Reaktionen eines sekretierten mikrobiellen Faktors auf eine Vielzahl von Wirtszelltypen zu untersuchen. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die sterile Technik während der gesamten Versuchsaufbauschritte zu üben und einen sorgfältigen Umgang mit den durchlässigen Membraneinsätzen beizubehalten, sowohl während der Ersteinrichtung als auch während der Probenentnahme.

Im Anschluss an dieses Verfahren können Methoden wie Western Blotting, Immunfluoreszenzbildgebung und Membranpermeabilisierungsassays durchgeführt werden, um zu bestimmen, wie der interessierende bakterielle Faktor zu Veränderungen in den Signalkaskaden beiträgt und die Gesamtzytotoxizität während der Infektion beeinflusst. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Wirtszellproben für die Bewertung einer Vielzahl von Wirtszellreaktionen nach Exposition gegenüber einem bestimmten sezernierten bakteriellen Faktor von Interesse vorbereitet werden. Vergessen Sie nicht, dass der Umgang mit biologisch gefährlichen Materialien, wie z. B. bakteriellen Krankheitserregern, bestimmte Sicherheitsaspekte erfordert.

Die ordnungsgemäße Verwendung von Schutzbrille, Handschuhen und Laborkitteln sowie die ordnungsgemäße Verwendung einer Biosicherheitshaube sind erforderlich, um diese Experimente sicher durchzuführen.