Der Nachweis von modifizierte Formen von Cytosin Mit Sensitive Immunhistochemie

Das übergeordnete Ziel dieses immunchemischen Protokolls ist es, die räumliche Verteilung von modifizierten Formen von Cytosin in verschiedenen Gewebe- und zellulären Kontexten auf der Grundlage der Verwendung von Peroxidase-konjugierten Sekundärantikörpern und der Tyramid-Signalamplifikation zu bewerten. Diese Methode überwindet die Einschränkungen anderer Techniken, die keine räumlichen Informationen liefern, die für das Verständnis der biologischen Funktion modifizierter Formen von Cytosin erforderlich sind. Darüber hinaus ermöglicht diese Methode den Co-Nachweis von modifizierten Formen von Cytosin mit Proteinlinienmarkern und kann zur Untersuchung ihrer Kernlokalisation eingesetzt werden.

Um dieses Verfahren zu beginnen, fixieren Sie rehydrierte Gewebeabschnitte von Wildtyp-CD1-Mausembryonen und adultem Gehirngewebe, indem Sie sie entweder 15 Minuten lang bei Raumtemperatur in eiskaltes 4%PFA oder 4%FA legen. Entfernen Sie dann das überschüssige Fixiermittel, indem Sie die Abschnitte fünf Minuten lang bei Raumtemperatur in PBS waschen. Als nächstes permeabilisieren Sie die Gewebeschnitte, indem Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in ein mit PBX gefülltes Coplin-Glas geben.

Entfernen Sie anschließend die überschüssige PBX, indem Sie die Abschnitte kurz in PBT waschen. Legen Sie nun die permeabilisierten Abschnitte für 60 Minuten bei Raumtemperatur in 2 N HCl für die DNA-Depurinierung. Übertragen Sie dann die Abschnitte für 30 Minuten bei Raumtemperatur auf 10 millimolare Tris-Hcl, um den HCl zu neutralisieren.

Alternativ können Sie die Abschnitte dreimal für jeweils fünf Minuten in PBS waschen. Die Schnitte werden fünf Minuten lang bei Raumtemperatur in PBT inkubiert. Entfernen Sie danach vorsichtig die Flüssigkeit aus dem Bereich um die Gewebeabschnitte.

Halten Sie in der Zwischenzeit die Gewebeschnitte feucht. Verwenden Sie einen hydrophoben Barrierestift, um die Abschnitte zu umschließen, ohne sie zu berühren. Anschließend werden die Schnitte in 100 Mikrolitern Blockierlösung eine Stunde lang bei Raumtemperatur in einer Feuchtkammer inkubiert.

Inkubieren Sie dann die Gewebeschnitte in 100 Mikrolitern einer Verdünnung von 1:5000 eines monoklonalen Anti-5hmC-Primärantikörpers der Maus und einer Verdünnung von 1:1000 eines polyklonalen Anti-5caC-Primärantikörpers von Kaninchen in einer Blockierungslösung für eine Stunde bei Raumtemperatur. Alternativ können Sie die Inkubation über Nacht bei vier Grad Celsius durchführen. Entfernen Sie anschließend überschüssige Antikörper, indem Sie die Schnitte in einem mit PBT gefüllten Coplin-Glas dreimal für jeweils fünf Minuten bei Raumtemperatur waschen.

Entfernen Sie dann überschüssiges PBT und umschließen Sie die Abschnitte bei Bedarf erneut mit einem hydrophoben Barrierestift, da PBT Reinigungsmittel enthält, das die hydrophobe Barriere schwächen kann. Anschließend wird eine Verdünnung des Ziegen-Anti-Kaninchen-HRP-konjugierten Antikörpers im Verhältnis 1:400 und des Esel-Anti-Maus-555-konjugierten Antikörpers im Verhältnis 1:400 in einer Blockierungslösung vorgenommen. Anschließend inkubieren Sie die Gewebeschnitte in 100 Mikrolitern des Sekundärantikörpergemisches für eine Stunde bei Raumtemperatur in einer Feuchtkammer.

Waschen Sie anschließend die Gewebeschnitte in einem mit PBT gefüllten Coplin-Glas dreimal für jeweils fünf Minuten bei Raumtemperatur. Dann überführen Sie die Gewebeschnitte für zwei Minuten bei Raumtemperatur in 100 Mikroliter Tyramid in einer Verdünnung von 1:200 im Tyramid-Signalamplifikationspuffer. Die Inkubationszeit, in der die Tyramidlösung experimentell für jede einzelne Charge des Tyramid-Signalverstärkungskits optimiert werden sollte, wobei eine lineare Beziehung zwischen der Signalintensität und der Dauer der tyramidbasierten Signalverstärkung beobachtet wird.

Entfernen Sie unmittelbar danach überschüssige Tyramidlösung, indem Sie die Objektträger dreimal für jeweils fünf Minuten in PBT waschen. Entfernen Sie vorsichtig überschüssiges PBT und bedecken Sie die Abschnitte sofort mit einem Tropfen Eindeckmedium. Legen Sie vorsichtig einen Deckslip auf die Tissue-Abschnitte und versiegeln Sie den Deckslip mit Nagellack.

Halten Sie dann die Gewebeschnitte vor der mikroskopischen Untersuchung mehrere Stunden lang bei vier Grad Celsius. Um die Verteilung von 5hmC in Hirngewebeschnitten zu bestimmen, wurde die Co-Detektion dieser epigenetischen Modifikation mit einem Marker für postmitotische Neuronen, NeuN, durchgeführt. Immunhistochemische Analysen zeigten, dass die prominente 5hmC-Färbung mit NeuN-positiven Zellen kolokalisierte, während NeuN-negative Gliazellen niedrigere Spiegel an genomischem 5hmC aufwiesen.

Um die Verteilung von 5caC in differenzierenden neuralen Stammzellen zu bestimmen, wurde die Kofärbung dieses Markers mit einem Gliamarker, GFAP, auf den fixierten Kulturen neuraler Stammzellen drei Tage nach der Induktion der glialen Differenzierung durchgeführt. Anders als in neuralen Stammzellen oder reifen Astrozyten wurde in einem großen Teil der Zellen, die GFAP exprimieren, ein starkes 5caC-Signal beobachtet. Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa acht Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, dass Sie alle Reagenzien und Materialien zusammen mit Ihren Proben bereit haben. Im Anschluss an dieses Verfahren kann eine konfokale Bildgebung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Kernverteilung von modifizierten Formen von Cytosin zu beantworten. Dies kann dazu beitragen, ihre mögliche biologische Funktion zu entschlüsseln.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit 2 N Hcl extrem gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie Sicherheitsschrank und Schutzkleidung getroffen werden sollten.