Der Nachweis von modifizierte Formen von Cytosin Mit Sensitive Immunhistochemie
16. August 2016
Hierin beschreiben wir eine empfindliche immunchemische Methode zur Kartierung der räumlichen Verteilung von 5mC-Oxidationsderivaten, die auf der Verwendung von Peroxidase-konjugierten Sekundärantikörpern und Tyramid-Signalamplifikation basiert.
Das allgemeine Ziel dieses immunochemischen Protokolls besteht darin, die räumliche Verteilung modifizierter Formen von Cytosin in verschiedenen Gewebe- und zellulären Kontexten basierend auf der Verwendung von mit Peroxidase konjugierten sekundären Antikörpern und der Tyramid-Signalverstärkung zu bewerten. Diese Methode überwindet die Einschränkungen anderer Techniken, die nicht die räumlichen Informationen liefern, die notwendig sind, um die biologische Funktion modifizierter Cytosin-Formen zu verstehen. Außerdem ermöglicht diese Methode die gleichzeitige Detektion modifizierter Cytosin-Formen zusammen mit proteinbasierten Linienmarkern und kann zur Untersuchung ihrer nukleären Lokalisation eingesetzt werden.
Um dieses Verfahren zu beginnen, fixieren Sie rehydrierte Gewebeschnitte von Wildtyp-CD1-Maus-Embryonen und adulten Hirngeweben, indem Sie sie für 15 Minuten bei Raumtemperatur entweder in eiskalter 4 % PFA oder 4 % FA platzieren. Entfernen Sie anschließend das überschüssige Fixativ, indem Sie die Schnitte bei Raumtemperatur fünf Minuten lang mit PBS waschen. Permeabilisieren Sie danach die Gewebeschnitte, indem Sie sie für 30 Minuten bei Raumtemperatur in ein Coplin-Gefäß mit PBX geben.
Anschließend entfernen Sie das überschüssige PBX durch kurzes Waschen der Schnitte in PBT. Danach geben Sie die permeabilisierten Schnitte zur DNA-Depurinierung für 60 Minuten bei Raumtemperatur in 2 N HCl. Überführen Sie anschließend die Schnitte zur Neutralisierung der HCl für 30 Minuten bei Raumtemperatur in 10 Millimolar Tris-HCl.
Alternativ die Schnitte dreimal für jeweils fünf Minuten in PBS waschen. Die Schnitte anschließend für fünf Minuten bei Raumtemperatur in PBT inkubieren. Danach die Flüssigkeit vorsichtig aus dem Bereich um die Gewebeschnitte herum entfernen.
Halten Sie die Gewebeschnitte derweil feucht. Umgeben Sie die Schnitte mit einem hydrophoben Barrierestift, ohne sie zu berühren. Anschließend inkubieren Sie die Schnitte für eine Stunde bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer mit 100 Mikrolitern Blockierungslösung.
Anschließend inkubieren Sie die Gewebeschnitte für eine Stunde bei Raumtemperatur in 100 Mikrolitern einer 1:5000-Verdünnung eines mausmonoklonalen primären Anti-5hmC-Antikörpers und einer 1:1000-Verdünnung eines kaninchpolyklonalen primären Anti-5caC-Antikörpers in Blockierungslösung. Alternativ kann die Inkubation über Nacht bei vier Grad Celsius durchgeführt werden. Entfernen Sie anschließend überschüssige Antikörper, indem Sie die Schnitte dreimal für jeweils fünf Minuten bei Raumtemperatur in einem Coplin-Behälter mit PBT waschen.
Entfernen Sie anschließend überschüssiges PBT und umkreisen Sie die Schnitte gegebenenfalls erneut mit einem hydrophoben Barrierestift, da PBT ein Detergens enthält, das die hydrophobe Barriere schwächen kann. Danach stellen Sie eine 1:400-Verdünnung des mit HRP konjugierten Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörpers und eine 1:400-Verdünnung des mit 555 konjugierten Esel-Anti-Maus-Antikörpers in der Blockierungslösung her. Inkubieren Sie die Gewebeschnitte dann für eine Stunde bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer mit 100 Mikrolitern der sekundären Antikörpermischung.
Anschließend die Gewebeschnitte in einem mit PBT gefüllten Coplin-Behälter dreimal je fünf Minuten bei Raumtemperatur waschen. Danach die Gewebeschnitte in 100 Mikroliter Tyramid in einer 1:200-Verdünnung im Tyramid-Signalverstärkungspuffer für zwei Minuten bei Raumtemperatur überführen. Die Inkubationszeit im Tyramid-Reagenz sollte experimentell für jede einzelne Charge des Tyramid-Signalverstärkungskits optimiert werden, bei dem ein linearer Zusammenhang zwischen der Signalintensität und der Dauer der tyramidbasierten Signalverstärkung beobachtet wird.
Entfernen Sie unmittelbar danach überschüssige Tyramid-Lösung, indem Sie die Objektträger dreimal für jeweils fünf Minuten in PBT waschen. Entfernen Sie vorsichtig überschüssiges PBT und bedecken Sie die Schnitte sofort mit einem Tropfen Eindeckmedium. Legen Sie vorsichtig ein Deckglas auf die Gewebeschnitte und verschließen Sie das Deckglas mit Nagellack.
Anschließend die Gewebeschnitte vor der mikroskopischen Untersuchung mehrere Stunden bei vier Grad Celsius lagern. Um die Verteilung von 5hmC in Gehirngewebeschnitten zu bestimmen, wurde die gleichzeitige Nachweisung dieser epigenetischen Modifikation mit einem Marker für postmitotische Neuronen, NeuN, durchgeführt. Die immunhistochemische Analyse zeigte, dass die ausgeprägte 5hmC-Färbung zwar mit NeuN-positiven Zellen colokalisierte, NeuN-negative Gliazellen jedoch geringere Mengen an genomischem 5hmC aufwiesen.
Um die Verteilung von 5caC in differenzierenden neuronalen Stammzellen zu bestimmen, wurde eine Doppelfärbung dieses Markers mit einem glialen Marker, GFAP, an fixierten Kulturen neuronaler Stammzellen drei Tage nach der Induktion der glialen Differenzierung durchgeführt. Im Gegensatz zu neuronalen Stammzellen oder reifen Astrozyten wurde ein starkes 5caC-Signal in einem großen Anteil der GFAP-exprimierenden Zellen beobachtet. Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von etwa acht Stunden durchgeführt werden.
Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, alle Reagenzien und Materialien zusammen mit Ihren Proben bereitzuhalten. Nach diesem Verfahren kann eine konfokale Bildgebung durchgeführt werden, um weitere Fragen zur nukleären Verteilung modifizierter Formen von Cytosin zu beantworten. Dies kann zur Aufklärung ihrer potenziellen biologischen Funktion beitragen.
Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit 2 N HCl äußerst gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie die Nutzung eines Sicherheitsschranks sowie der Trage von Schutzkleidung stets beachtet werden sollten, während dieses Verfahren durchgeführt wird.
Übersicht
Dieser Artikel stellt eine empfindliche immunochemische Methode zur Kartierung der räumlichen Verteilung von 5mC-Oxidationsderivaten unter Verwendung peroxidasekonjugierter sekundärer Antikörper und Tyramid-Signalverstärkung vor. Die Methode ermöglicht die Bewertung modifizierter Formen von Cytosin in verschiedenen Gewebe- und zellulären Kontexten.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Biochemie
- Zellbiologie
Hintergrund
- Das Verständnis der räumlichen Verteilung modifizierter Cytosine ist entscheidend, um ihre biologischen Funktionen aufzuklären.
- Aktuelle Methoden weisen häufig eine unzureichende räumliche Auflösung auf, was ihre Wirksamkeit einschränkt.
- Diese Methode ermöglicht die gleichzeitige Detektion mit Protein-Linienmarkern.
- Sie kann zur Untersuchung der nukleären Lokalisation von Cytosinmodifikationen angewendet werden.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer Methode zur Kartierung der Verteilung von 5mC-Oxidationsderivaten.
- Bereitstellung räumlicher Informationen, die für das Verständnis der biologischen Funktionen dieser Modifikationen erforderlich sind.
- Erleichterung der Untersuchung modifizierter Cytosine in verschiedenen Geweben.
Verwendete Methoden
- Fixierung von Gewebeschnitten aus Maus-Embryonen und adulten Gehirnen.
- Permeabilisierung und DNA-Depurinierung von Gewebeschnitten.
- Inkubation mit primären Antikörpern, die spezifisch für modifiziertes Cytosin sind.
- Verwendung der Tyramid-Signalverstärkung zur verbesserten Detektion.
Hauptergebnisse
- Die 5hmC-Färbung kolokalisierte mit NeuN-positiven Neuronen.
- Im Genom von NeuN-negativen Gliazellen wurden geringere Mengen an 5hmC gefunden.
- Starke 5caC-Signale wurden in differenzierenden neuralen Stammzellen beobachtet, die GFAP exprimieren.
- Die Methode kann in etwa acht Stunden abgeschlossen werden.
Schlussfolgerungen
- Diese immunochemische Methode bietet einen robusten Ansatz zur Untersuchung von Cytosinmodifikationen.
- Sie vertieft das Verständnis der biologischen Funktionen dieser Modifikationen in neuronalen Kontexten.
- Sicherheitsvorkehrungen sind unerlässlich beim Umgang mit Reagenzien wie 2 N HCl.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Das Verständnis der räumlichen Verteilung von Cytosin-Modifikationen ist entscheidend, um die epigenetische Regulation in krankheitsrelevanten Systemen zu entschlüsseln. Diese Methode ermöglicht die gleichzeitige Detektion mit Linienmarkern und unterstützt so die Zielvalidierung sowie die mechanistische Risikominderung in der Neurowissenschaft und Onkologie. Sie liefert eine vorhersagbare Zuverlässigkeit, indem sie DNA-Modifikationen mit zellulären Phänotypen in präklinischen Modellen verknüpft.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Untersucht therapeutische Hypothesen, indem die Lokalisation von 5hmC und 5caC in spezifischen Zelltypen kartiert wird.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die funktionelle Zielvalidierung durch gleichzeitige Detektion mit den Markern NeuN und GFAP.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung, indem epigenetische Markierungen mit Zuständen neuronaler oder glialer Differenzierung korreliert werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Bereitet validierte biologische Systeme für nachgeschaltete epigenetische Screening-Workflows vor.
- Quantitative Ergebnisse: Die Tyramid-Signalverstärkung ermöglicht einen empfindlichen und reproduzierbaren Nachweis seltener Modifikationen.
- Plattform-Wiederverwendung: Ein standardisierter Protokollablauf erlaubt die Skalierbarkeit über verschiedene Gewebetypen und Antikörpansets hinweg.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Wird in embryonalen und adulten Gehirngeweben untersucht und ist relevant für neurodevelopmentelle und neurodegenerative Erkrankungen.
- Translationale Kontinuität: Daten zur nukleären Lokalisation unterstützen die Biomarker-Ausrichtung von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Die räumliche Auflösung verringert mechanistische Unschärfen in Studien zur Target-Bindung.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Hypothesenprüfung eines Targets bis zur präklinischen Biomarker-Bewertung ein und ermöglicht eine iterative Verfeinerung epigenetischer Zielstrukturen.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung durch Aufdeckung der zelltypspezifischen Verteilung von 5mC-Oxidationsderivaten.
- Screening: Stellt Bereitschaft für Assays sicher durch standardisierte Fixierungs-, Permeabilisierungs- und Amplifikationsschritte.
- Analytik: Erzeugt quantitative Fluoreszenzsignale, die den Vergleich von Modifikationsgraden unter verschiedenen Bedingungen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verbindet epigenetische Markierungen mit Zellidentitätsmarkern und unterstützt so biomarkerbasierte präklinische Kontinuität.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Das Protokoll ist an verschiedene Gewebetypen und Antikörperkombinationen anpassbar und fördert die Standardisierung über Projekte hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unschärfen, indem cytosinbasierte Modifikationen spezifischen zellulären Linien zugeordnet werden.
- Operativer Wert: Die Tyramid-Signalverstärkung gewährleistet Standardisierung und Reproduzierbarkeit über verschiedene Labore hinweg.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch durch räumliche Kontextualisierung der epigenetischen Target-Validierung.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Targets basierend auf epigenetischer Aktivität in krankheitsrelevanten Zellen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in Immunhistochemie und Epitop-Retrieval-Techniken.
- Abhängig von Hydrolyseschritten (2 N HCl), die spezielle Sicherheitsausrüstung und Schulung erfordern.
- Benötigt standardisierte Blockier- und Waschprotokolle, um das Hintergrundsignal zu minimieren.
- Die Anpassung an verschiedene Modellsysteme erfordert die Validierung der Antikörperspezifität und der Permeabilisierungseffizienz.
- Praktische Einschränkung: Die HCl-Behandlung kann die Epitopintegrität für bestimmte Proteinziele beeinträchtigen und erfordert eine Optimierung.
