Name: Der Nachweis von modifizierte Formen von Cytosin Mit Sensitive Immunhistochemie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Lernen Sie die empfindliche Immunhistochemie zur Kartierung modifizierter Cytosinformen in Mausgeweben. Diese Methode nutzt Tyramid-Signalverstärkung für präzise räumliche Analysen epigenetischer Veränderungen.

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Wir danken der Advanced Microscopy Unit (School of Life Sciences, University of Nottingham) und dem Histologie-Team der MRC Human Reproductive Sciences Unit (Edinburgh), dem Institut für Neurowissenschaften an der ULB und dem FNRS für Hilfe und Unterstützung. Diese Arbeit wurde unterstützt von MRC (MR/L001047/1 bis A.D.J.).

Alle Tier verbundenen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit der University of Nottingham ethischen Review Board durchgeführt. 1. Auswahl geeigneter Gewebepräparation für Immunostaining <ol><li> Generieren Sie in Paraffin eingebetteten Abschnitt von Wildtyp - CD1 Maus - Embryonen und erwachsenen Gehirn Gewebe wie zuvor 25 beschrieben. Verwenden Sie Abschnitte Hirngewebe fixiert mit entweder 4% Formaldehyd (FA) oder 4% Paraformaldehyd (PFA) für 25 Verfahren immunostaining. HINWEIS: Die Verwendung von in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten erfordert Entparaffinierung vor der Antikörpermarkierung. Da die Behandlung mit 2 bis 4 M Salzsäure (HCl) in das Protokoll für die DNA-Denaturierung eingesetzt ist nicht kompatibel mit den meisten Antigen-Retrieval-Strategien, empfehlen wir die Verwendung von entweder Kryo- oder Mikrotomschnitten für die Co-Detektion von 5mC Oxidationsderivate mit Protein Marker. </li></ol> 2. Entwachsen Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten &lt;<html> / P&gt; <ol><li> In einer laufenden Klasse II Sicherheitsschrank, waschen Sie die in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten in einem Glas Coplin mit Xylol gefüllt, 2-mal für jeweils 10 Minuten bei RT. HINWEIS: Es ist wichtig , frisches Xylol zu verwenden , da unvollständige Paraffin Entfernung zu inkonsistenten Färbemustern führen kann. </li><li> Nach Entparaffinierung, Rehydrierung schnell die Gewebeschnitte durch Waschen nacheinander in 95, 75 und 50% Ethanol für jeweils 10 min bei RT. </li></ol> 3. Fixierung und Permeabilisierung von Kryo- und Mikrotomschnitten <ol><li> Befestigen Sie die rehydratisierten Gewebeschnitte von ihnen in entweder eiskalt 4% PFA oder 4% FA für 15 min bei RT platzieren. </li><li> (Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung) für 5 min bei RT Entfernung von überschüssigem Fixativ indem die Sektionen in PBS gewaschen. </li><li> Permeabilisierung die Gewebeschnitte von in einer Glasküvette mit PBX (0,5% Triton X-100 in PBS) bei RT für 30 min gefüllt platzieren. Überschüssiges PBX durch die Abschnitte kurz in PBT Waschen (0,01% Tween 20 in PBS). </li></ol>jove_title &quot;&gt; 4. Immunostaining für Oxi-5mC Derivate <ol><li> Platzieren Sie die permeabilisierten Schnitte in 2 N HCl für 60 min bei RT Depurinierung der DNA. Hinweis: Obwohl höhere Konzentrationen von HCl (beispielsweise 4 N) führen zu einer effizienteren DNA denaturierenden, sie sind nicht kompatibel für die Co-Detektion von oxi-mCs mit DAPI. </li><li> Platzieren Sie die Abschnitte in 10 mM Tris-HCl (pH 8,5) für 30 min bei RT, um das HCl zu neutralisieren. Alternativ waschen Sie die Abschnitte dreimal für 5 Minuten jeweils in PBS. Inkubieren der Abschnitte in PBT für 5 min bei RT. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Flüssigkeit aus dem Bereich der Gewebeschnitt umgibt, ohne den Gewebeschnitt zu lassen Sie die Folie vollständig in jedem Schritt zum Trocknen durch leichtes Schütteln. Verwenden Sie eine hydrophobe Barriere Stift, um den Abschnitt zu umgeben, ohne den Abschnitt zu berühren. HINWEIS: Die hydrophobe Barriere Stift das Volumen der Antikörper reduziert erforderlich , um das Gewebe zu färben und mehrere Abschnitte werden gefärbt mit differen zulassent-Antikörper auf derselben Folie. </li><li> Inkubieren Abschnitte in 100 &amp; mgr; l-Lösung (10% Rinderserumalbumin in PBS) für 1 Stunde bei RT in einer feuchten Kammer blockiert. HINWEIS: die Effizienz der Färbung der modifizierten Cytosin - Basen beeinflussen würde diesen Schritt überspringen. </li><li> Inkubieren der Gewebeschnitte in 100 ul einer 1: 5.000-Verdünnung von monoklonalem Maus-anti-5hmC und einer 1: 1.000-Verdünnung von polyklonalem Kaninchen-anti-5caC primäre Antikörper in Lösung für 1 h bei RT in einer feuchten Kammer blockiert. Alternativ führen die Inkubation über Nacht bei 4 ° C, wenn nötig. HINWEIS: Abschnitte ohne primären Antikörper verarbeitet als geeignete Negativkontrollen für das Färbeverfahren dienen. 12,5 Tage post coitum murinen embryonalen Hirnschnitten angereichert in 5caC, 5FC und 5hmC 20 kann als positive Kontrolle verwendet werden. </li><li> Entfernen Sie überschüssige Antikörper durch die Abschnitte in einer Glasküvette mit PBT dreimal für jeweils 5 min in einem Cop gefüllt Waschenlin Glas bei RT. HINWEIS: das Volumen der Waschlösungen Erhöhung kann die Hintergrundfärbung zu reduzieren. </li><li> Überschüssiges PBT und, falls erforderlich, umkreisen die Abschnitte wieder mit dem hydrophoben Barriere Stift als PBT Reinigungsmittel enthalten, die die hydrophobe Barriere schwächen können. </li><li> Machen Sie eine 1: 400-Verdünnung von Ziegen-Anti-Kaninchen-HRP-konjugierte Antikörper und eine 1: 400-Verdünnung von Esel-anti-Maus-555-konjugierte Antikörper in Lösung zu blockieren. </li><li> Inkubieren der Gewebeschnitte in 100 &amp; mgr; l sekundärem Antikörper Mischung aus Schritt 4.9 für 1 h bei RT in einer feuchten Kammer. </li><li> Waschen Sie die Gewebeschnitte in eine Coplin-Gefäß gefüllt mit PBT dreimal für jeweils 5 Minuten bei RT. </li><li> Platzieren Sie die Gewebeschnitte in 100 ul einer 1: 200 Verdünnung von Tyramid in dem Tyramid Signalverstärkungspuffer für 2 min bei RT. </li><li> Sofort entfernen überschüssige Tyramidesters Lösung durch die Dias dreimal für jeweils 5 Minuten in PBT Waschen. </li><li> vorsichty entfernen überschüssiges PBT und sofort , die Abschnitte mit einem Tropfen einer Mounting Medium (siehe Materialliste). </li><li> Sanft legen Sie ein Deckglas auf den Gewebeschnitten und sofort das Deckglas mit Nagellack versiegeln. </li><li> Speichern der Gewebeschnitte bei 4 ° C für mehrere Stunden vor der mikroskopischen Untersuchung. Untersuchen unter einem Fluoreszenzmikroskop bei 405, 488 und / oder 555 nm (10 - 40-facher Vergrößerung). </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Obwohl der gemeldete geringe Häufigkeit von 5mC Oxidationsderivate, 5FC und 5caC in einigen Geweben erhebliche Einschränkungen für ein Standard - Immunochemie Protokoll darstellen würde der Einbau von Peroxidase-konjugiertem Sekundärantikörper erlaubt den Nachweis dieser Cytosin Modifikationen in festen Geweben und Zellen (Figur 2) . Jedoch sollte die optimale Inkubationszeit mit dem Tyramid Lösung optimiert werden experimentell für jede einzelne Charge von Tyramid Signalverstärkungs Kit , wo eine lineare Beziehung zwischen der Signalintensität und die Dauer der Tyramid basierten Signalverstärkung beobachtet wird, für Details siehe Almeida et al. 2012 26 . Zusätzlich kann das Signal / Hintergrund-Verhältnis signifikant durch die Durchführung der Waschungen in einem Coplin jar verbessert werden effiziente Entfernung von überschüssigem Antikörper zu ermöglichen. Nach der Inkubation mit Tyramidesters Lösung ist es wichtig, die Reaktion durch Waschen in PBT-Lösung d sofort zu beendenecrease Hintergrundfärbung. Es ist wichtig, nicht die Abschnitte zu erlauben, an jedem beliebigen Punkt während des Verfahrens, um zu trocknen. Die Effizienz der DNA Depurinierung kann durch Ausführen der Depurinierung Reaktion bei 37 ° C verbessert werden. Bei der Verwendung von 4 N HCl anstelle von 2 N verstärkt die Färbung der modifizierten Formen von 5mC unter Verwendung von 4 N HCl für DNA Depurinierung würde mit DAPI nicht zulassen Co-Färbung, wie sie ausschließlich mit doppelsträngiger DNA interagiert. Obwohl diese Technik robust semi-quantitative Beurteilung der modifizierten Formen von Cytosin-Basen in dem detektierbaren bereitstellen kann, kann sie nicht für die Bewertung der absoluten Niveaus der 5mC oder dessen Oxidationsderivaten verwendet werden. Daher empfehlen wir die Verwendung von anderen ergänzenden , aber quantitative Ansätze 16, 19 -24. Seit der Entdeckung von 5mC Oxidationsderivate in Säugergenomen wurden mehrere Ansätze entwickelt worden , deren biologische Rollen zu studieren 16, 19-24. Obwohl diese approaCHES kann bei der Bestimmung der absoluten Mengen an 5mC Oxidationsderivate wertvoll sein, bieten sie keine Informationen über ihre räumliche Verteilung 20, 26. Wir haben erfolgreich die hier beschriebenen Verfahren verwendet , um die räumliche Verteilung und Lokalisierung von 5mC Oxidationsderivate in verschiedenen Zelltypen zu kartieren der entwickelnden und adulten Gehirn 20 Durch die Offenbarung ihrer räumlichen Verteilung 20 kann diese Technik entscheidend sein , um die biologischen Implikationen für das Verständnis und das Schicksal von oxidierten Derivaten 5mC in verschiedenen biologischen Kontexten , in denen diese modifizierten Derivaten von 5mC können einschließlich zelluläre Differenzierung, Entwicklung und Krankheit nachgewiesen werden. Darüber hinaus kann die Methode, die wir hier beschreiben, geben semi-quantitative Abschätzungen der oxidierten Derivaten 5mC in verschiedenen Geweben durch die Kinetik der Peroxidase-Reaktion Beurteilung (die der Färbungsintensität proportional ist) bei unterschiedlichen Inkubationszeiten mit tyramide 26.

Die Methylierung von Cytosin - Basen in der DNA (5mC) stellt einen großen in Wirbeltiere Genome gefunden epigenetische Markierung im Zusammenhang mit Transkriptions 1 zum Schweigen zu bringen. 5mC wird von DNA - Methyltransferasen 2-5 eingeführt und gehalten, und wurde in einer Reihe von biologischen Prozessen einschließlich genomische Imprinting, X-Chromosom Inaktivierung zellulärer Differenzierung und Entwicklung 3, 6. Folglich wichtige Rollen spielen gezeigt, die Störung der 5mC genomische Muster mit einer Reihe von Krankheiten assoziiert 7, 8-11. Trotz der Fortschritte im Verständnis 5mC Rolle bei der Entwicklung und Krankheit, ist es immer noch weitgehend unbekannt bleiben, wie diese Marke bei der Entwicklung und adulten Geweben entfernt wird. Mehrere mögliche Mechanismen der DNA - Demethylierung aktiven und passiven Demethylierung Mechanismen vor kurzem vorgeschlagen wurden , 12, 13, 14, 15. Entdeckung der Produkte von 5mC sequenzielle Oxidation vermittelt durch 10 bis 11 Translokation enzymES (TET1 / 2/3), wie 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5FC) und 5-carboxylcytosine (5caC) in eukaryotischen DNA 16, 17, 18, ​​19 veranlasst Spekulationen , ob sie als Zwischenprodukte dienen können , DNA - Demethylierung Prozesse oder als stabile epigenetische Markierungen in ihrem eigenen Recht 13. Während der Demonstration , dass die Komponente der Reparatur Basis Exzision, Thymin-DNA - Glycosylase (TDG) binden können und beide 5FC und 5caC von DNA 19 zu entfernen, schlägt vor , 20 eine Rolle für die modifizierten 5mC Derivate in einer aktiven DNA - Demethylierung. Neuere Erkenntnisse zeigen , dass 5FC / 5caC die Rate der RNA II processivity Punkte auf mögliche Beteiligung dieser Marken in der Transkriptionsregulation 29 modulieren können. Aufgrund dieses potentielle biologische Bedeutung von oxidierten Formen von 5mC, eine Reihe von biochemischen und Antikörper - basierte Techniken zur Untersuchung ihrer genomischen Verteilung und globale Inhalte wurden 19-24 16, eingesetzt. Da die meisten ter wirbel Organen verschiedener Zelltypen bestehen und daß die Verteilung der modifizierten Cytosin - Basen Gewebe- und Zelltyp - spezifische 16-18, 20, 23, 25-27, in verschiedenen Geweben , die räumliche Verteilung von oxidiertem 5mC Derivate Bestimmung wird zu einem wichtigen experimentellen Aufgabe erforderlich für ihre biologischen Funktionen enthüllt. Die meisten der biochemischen und Antikörper-basierte Ansätze bieten keine räumlichen Informationen bezüglich der Verteilung der modifizierten Formen von 5mC in verschiedenen Geweben und Zelltypen. Im Gegensatz dazu Immunochemie basierte Techniken kann die räumliche Verteilung und Kernlokalisation von 5mC 28 und dessen oxidierter Derivate 20 ein schnelles Werkzeug für die Beurteilung. Das heißt, der berichtete sehr geringe Häufigkeit von 5FC (20 in jedem 10 6 Cytosin) und 5caC (3 in je 10 6 Cytosin) in das Mausgenom 18 eine große Herausforderung für Standard Immunochemie darstellt. Hier,Wir beschreiben eine hochempfindliche immunochemischen Methode, die von oxidierten Form von Cytosin in Säugetierhirngewebe robust und eine schnelle Erkennung bietet. Durch die Integration von Peroxidase-konjugierten sekundären mit einem Signalverstärkungsschritt gekoppelten Antikörpern, umgeht diese Methode für die Herausforderungen der sehr geringe Mengen an 5FC und 5caC zu erkennen. zusammen detektieren die modifizierten Formen von Cytosin mit linienspezifischen Markern, effektiv ergänzt andere Ansätze bei der Aufklärung der biologischen Funktion dieser epigenetische Markierungen Zusätzlich kann diese Technik verwendet werden.

<table><tbody><tr><td>Coplin Glas</td><td>Cole-Parmer</td><td>UY-48585-30</td><td>Glas hergestellt</td></tr><tr><td>Xylol</td><td></td><td></td><td>Nur in Sicherheitswerkbank der Klasse II verwenden</td></tr><tr><td>Phosphatpuffer Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12821680</td><td>pH 7,5, vor Gebrauch gefiltert</td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>Nach der Herstellung kann bei -20 & deg gelagert werden; C in Aliquoten für mehrere Monate</td></tr><tr><td>4% Formaldehyd&nbsp; (FA) Herr Präsident!</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775</td><td>Einmal hergestellt kann bei -20 & Grad gelagert werden; C in Aliquoten für mehrere Monate</td></tr><tr><td>Ethanol, wasserfrei denaturiert, histologische Qualität</td><td>Sigma Aldrich</td><td>64-17-5</td><td>95, 75, 50% in PBS</td></tr><tr><td>0,01% Tween 20 in PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td>PBT</td></tr><tr><td>0,5% Triton X-100 in PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>PBX</td></tr><tr><td>2 N HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71826</td><td>Vorsicht extrem giftig</td></tr><tr><td>100 mM Tris-HCl&nbsp;</td><td>Promega</td><td>H5121</td><td>pH-Wert angepasst an 8,5</td></tr><tr><td>hydrophobe Barriere Stift</td><td>Abcam</td><td>ab2601</td><td>für Immunhistochemie</td></tr><tr><td>Objektträger Feuchtigkeitskammer</td><td>Scientific Device Laboratory</td><td>197-BL</td><td></td></tr><tr><td>Anti-5mC-Maus-Antikörper</td><td>Diagenode</td><td>C15200081</td><td>monoklonaler primärer Antikörper</td></tr><tr><td>Anti-5hmC-Antikörper</td><td>Aktiver Motif</td><td>39791</td><td>Kaninchen polyklonal Primärantikörper</td></tr><tr><td>Anti-5caC-Antikörper</td><td>Aktives Motiv</td><td>61225</td><td>polyklonaler Kaninchen-Primärantikörper</td></tr><tr><td>Peroxidase-konjugierter Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper</td><td>Dako</td><td>K1497</td><td></td></tr><tr><td>555-kongjuierter Ziegen-Anti-Maus-Antikörper</td><td>Molekulare Sonden</td><td>A-11005</td><td>&nbsp; Sekundärantikörper</td></tr><tr><td>10% BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9418</td><td>Blockierungslösung</td></tr><tr><td>22 x 32 mm Deckgläser</td><td>BDH</td><td>406/0188/24</td><td></td></tr><tr><td>Tyramide Signal Amplification System</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEL741001KT</td><td>Andere Fluorochom-konjugierte Sekundärantikörper können für den Co-Nachweis von Oxi-5mC&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp; Eindeckmedium mit DAPI</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Farbloser Nagellack</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Huhn polyklonaler Anti-GFAP-Antikörper</td><td>Thermo Scientific</td><td>PA5-18598</td> 1<td>:400 Verdünnung</td></tr><tr><td>anti-NeuN Maus monoklonaler Antikörper</td><td>Merck Milipore</td><td>MAB377B</td><td>1:400 Verdünnung</td></tr></tbody></table>

der nachweis von modifizierte formen von cytosin mit sensitive immunhistochemie

Detection of Modified Forms of Cytosine Using Sensitive Immunohistochemistry

Die Methylierung von Cytosinbasen (5-Methylcytosin, 5mC), die in Wirbeltiergenomen auftritt, ist normalerweise mit transkriptionellem Silencing verbunden. 5-Hydroxylmethylcytosin (5hmC), 5-Formylcytosin (5fC) und 5-Carboxylcytosin (5caC) sind die kürzlich entdeckten modifizierten Cytosinbasen, die durch enzymatische Oxidation von 5mC hergestellt werden und deren biologische Funktionen relativ unklar bleiben. Eine Reihe von Ansätzen, die von biochemischen bis hin zu antikörperbasierten Techniken reichen, wurden eingesetzt, um die genomische Verteilung und den globalen Gehalt dieser Modifikationen in verschiedenen biologischen Systemen zu untersuchen. Obwohl einige dieser Ansätze für die quantitative Bewertung dieser modifizierten Formen von 5mC nützlich sein können, liefern die meisten dieser Methoden keine räumlichen Informationen über die Verteilung dieser DNA-Modifikationen in verschiedenen Zelltypen, die für ein korrektes Verständnis ihrer funktionellen Rollen erforderlich sind. Hier stellen wir eine hochempfindliche Methode zum immunchemischen Nachweis der modifizierten Formen von Cytosin vor. Diese Methode ermöglicht die gemeinsame Detektion dieser epigenetischen Markierungen mit Markern der Proteinlinie und kann zur Untersuchung ihrer nukleären Lokalisation eingesetzt werden, wodurch sie zur Entschlüsselung ihrer potenziellen biologischen Rollen in verschiedenen experimentellen Kontexten beiträgt.

Um die Verteilung der 5hmC in Hirngewebeschnitten bestimmen, führten wir co-Detektion dieser epigenetischen Modifikation mit einem Marker für die post-mitotischen Neuronen, NeuN, kommerziellen anti-5hmC Antikörper verwendet wird, der spezifisch mit dieser Markierung in Wechselwirkung tritt, aber nicht mit anderen Formen von modifiziertem Cytosin 20, 25. Immunhistochemische Analyse von 5hmC und 5caC Verteilungen im erwachsenen Gehirn zeigten , dass während der prominente 5hmC Färbung co-lokalisiert mit NeuN - positiven Zellen, NeuN-negativen Gliazellen besitzen geringere Mengen genomischer 5hmC (Abbildung 1) 20. Wir haben kürzlich gezeigt , dass Tet-abhängige 5mC Oxidation während der Abstammungslinie Spezifikation von neuralen Stammzellen (NSCs) 20 in Betrieb ist. Trotz in NSCs immunochemisch nicht nachweisbar ist, zeigen 5FC und 5caC prominente Immunfärbung in frühen Stadien der NSCs Differenzierung zu neuronalen ein<html> nd Glia-Abstammungslinien. Diese beiden Marken transient akkumulieren gleichzeitig mit dem Erscheinen der Marker der frühen neuronalen und glialen Differenzierung 20. Zur Bestimmung der Verteilung von 5caC bei der Differenzierung von NSCs wir Co-Färbung dieser Marke mit einem Glia Marker GFAP auf den festen Kulturen von NSCs an 3 Tagen nach der Induktion von Glia-Differenzierung durchgeführt. Anders als in NSC oder reifen Astrozyten (Daten nicht gezeigt), beobachteten wir starke 5caC Signal in relativ großen Anteil der Zellen, die GFAP in diesen Kulturen (Figur 2) 20. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54416/54416fig1.jpg" /> Abbildung 1. Co-Immunfärbung von 5hmC (grün) mit NeuN (rot) im Gewebe erwachsenen Gehirn counterstained mit DAPI (blau). Einzelne Kanäle und die fusionierte Ansicht gezeigt. Maßstabsbalken sind 25 &amp; mgr; m.blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54416/54416fig2.jpg" /> Abbildung 2. Co-Immunfärbung von 5caC mit GFAP in der Kultur von NSC an Tag 3 von Gliazellen Differenzierung. Einzelne Kanäle und die fusionierte Ansicht gezeigt. Maßstabsbalken sind 20 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54416/54416fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54416/54416fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Hierin beschreiben wir eine empfindliche immunchemische Methode zur Kartierung der räumlichen Verteilung von 5mC-Oxidationsderivaten, die auf der Verwendung von Peroxidase-konjugierten Sekundärantikörpern und Tyramid-Signalamplifikation basiert.

Der Nachweis von modifizierte Formen von Cytosin Mit Sensitive Immunhistochemie

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. ...

Das allgemeine Ziel dieses immunochemischen Protokolls besteht darin, die räumliche Verteilung modifizierter Formen von Cytosin in verschiedenen Gewebe- und zellulären Kontexten basierend auf der Verwendung von mit Peroxidase konjugierten sekundären Antikörpern und der Tyramid-Signalverstärkung zu bewerten. Diese Methode überwindet die Einschränkungen anderer Techniken, die nicht die räumlichen Informationen liefern, die notwendig sind, um die biologische Funktion modifizierter Cytosin-Formen zu verstehen. Außerdem ermöglicht diese Methode die gleichzeitige Detektion modifizierter Cytosin-Formen zusammen mit proteinbasierten Linienmarkern und kann zur Untersuchung ihrer nukleären Lokalisation eingesetzt werden.Um dieses Verfahren zu beginnen, fixieren Sie rehydrierte Gewebeschnitte von Wildtyp-CD1-Maus-Embryonen und adulten Hirngeweben, indem Sie sie für 15 Minuten bei Raumtemperatur entweder in eiskalter 4 % PFA oder 4 % FA platzieren. Entfernen Sie anschließend das überschüssige Fixativ, indem Sie die Schnitte bei Raumtemperatur fünf Minuten lang mit PBS waschen. Permeabilisieren Sie danach die Gewebeschnitte, indem Sie sie für 30 Minuten bei Raumtemperatur in ein Coplin-Gefäß mit PBX geben.Anschließend entfernen Sie das überschüssige PBX durch kurzes Waschen der Schnitte in PBT. Danach geben Sie die permeabilisierten Schnitte zur DNA-Depurinierung für 60 Minuten bei Raumtemperatur in 2 N HCl. Überführen Sie anschließend die Schnitte zur Neutralisierung der HCl für 30 Minuten bei Raumtemperatur in 10 Millimolar Tris-HCl.Alternativ die Schnitte dreimal für jeweils fünf Minuten in PBS waschen. Die Schnitte anschließend für fünf Minuten bei Raumtemperatur in PBT inkubieren. Danach die Flüssigkeit vorsichtig aus dem Bereich um die Gewebeschnitte herum entfernen.Halten Sie die Gewebeschnitte derweil feucht. Umgeben Sie die Schnitte mit einem hydrophoben Barrierestift, ohne sie zu berühren. Anschließend inkubieren Sie die Schnitte für eine Stunde bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer mit 100 Mikrolitern Blockierungslösung.Anschließend inkubieren Sie die Gewebeschnitte für eine Stunde bei Raumtemperatur in 100 Mikrolitern einer 1:5000-Verdünnung eines mausmonoklonalen primären Anti-5hmC-Antikörpers und einer 1:1000-Verdünnung eines kaninchpolyklonalen primären Anti-5caC-Antikörpers in Blockierungslösung. Alternativ kann die Inkubation über Nacht bei vier Grad Celsius durchgeführt werden. Entfernen Sie anschließend überschüssige Antikörper, indem Sie die Schnitte dreimal für jeweils fünf Minuten bei Raumtemperatur in einem Coplin-Behälter mit PBT waschen.Entfernen Sie anschließend überschüssiges PBT und umkreisen Sie die Schnitte gegebenenfalls erneut mit einem hydrophoben Barrierestift, da PBT ein Detergens enthält, das die hydrophobe Barriere schwächen kann. Danach stellen Sie eine 1:400-Verdünnung des mit HRP konjugierten Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörpers und eine 1:400-Verdünnung des mit 555 konjugierten Esel-Anti-Maus-Antikörpers in der Blockierungslösung her. Inkubieren Sie die Gewebeschnitte dann für eine Stunde bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer mit 100 Mikrolitern der sekundären Antikörpermischung.Anschließend die Gewebeschnitte in einem mit PBT gefüllten Coplin-Behälter dreimal je fünf Minuten bei Raumtemperatur waschen. Danach die Gewebeschnitte in 100 Mikroliter Tyramid in einer 1:200-Verdünnung im Tyramid-Signalverstärkungspuffer für zwei Minuten bei Raumtemperatur überführen. Die Inkubationszeit im Tyramid-Reagenz sollte experimentell für jede einzelne Charge des Tyramid-Signalverstärkungskits optimiert werden, bei dem ein linearer Zusammenhang zwischen der Signalintensität und der Dauer der tyramidbasierten Signalverstärkung beobachtet wird.Entfernen Sie unmittelbar danach überschüssige Tyramid-Lösung, indem Sie die Objektträger dreimal für jeweils fünf Minuten in PBT waschen. Entfernen Sie vorsichtig überschüssiges PBT und bedecken Sie die Schnitte sofort mit einem Tropfen Eindeckmedium. Legen Sie vorsichtig ein Deckglas auf die Gewebeschnitte und verschließen Sie das Deckglas mit Nagellack.Anschließend die Gewebeschnitte vor der mikroskopischen Untersuchung mehrere Stunden bei vier Grad Celsius lagern. Um die Verteilung von 5hmC in Gehirngewebeschnitten zu bestimmen, wurde die gleichzeitige Nachweisung dieser epigenetischen Modifikation mit einem Marker für postmitotische Neuronen, NeuN, durchgeführt. Die immunhistochemische Analyse zeigte, dass die ausgeprägte 5hmC-Färbung zwar mit NeuN-positiven Zellen colokalisierte, NeuN-negative Gliazellen jedoch geringere Mengen an genomischem 5hmC aufwiesen.Um die Verteilung von 5caC in differenzierenden neuronalen Stammzellen zu bestimmen, wurde eine Doppelfärbung dieses Markers mit einem glialen Marker, GFAP, an fixierten Kulturen neuronaler Stammzellen drei Tage nach der Induktion der glialen Differenzierung durchgeführt. Im Gegensatz zu neuronalen Stammzellen oder reifen Astrozyten wurde ein starkes 5caC-Signal in einem großen Anteil der GFAP-exprimierenden Zellen beobachtet. Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von etwa acht Stunden durchgeführt werden.Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, alle Reagenzien und Materialien zusammen mit Ihren Proben bereitzuhalten. Nach diesem Verfahren kann eine konfokale Bildgebung durchgeführt werden, um weitere Fragen zur nukleären Verteilung modifizierter Formen von Cytosin zu beantworten. Dies kann zur Aufklärung ihrer potenziellen biologischen Funktion beitragen.Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit 2 N HCl äußerst gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie die Nutzung eines Sicherheitsschranks sowie der Trage von Schutzkleidung stets beachtet werden sollten, während dieses Verfahren durchgeführt wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Die EpiMark 5-HMC und 5-mC Analysis Kit kann verwendet werden, um zu analysieren und zu quantifizieren 5-Methylcytosin und 5-Hydroxymethylcytosin innerhalb einer spe cific locus werden. Das Kit unterscheidet 5-mC von 5-HMC von der Zugabe von Glucose an die Hydroxylgruppe von 5-HMC über eine enzymatische Reaktion unter Verwendung von β-glucosyltransferase (T4-BGT). Als 5-HMC im Rahmen der CCGG auftritt, wandelt diese Modifikation eines spaltbaren MspI Ort zu einer nicht-spaltbare Website.

Hohe Empfindlichkeit 5-Hydroxymethylcytosin Erkennung in Balb / C Gehirngewebe

Beschrieben wird ein zweistufiges Verfahren unter Verwendung Kennzeichnung β-Glucosyltransferase (β-GT), um ein Azid-Glukose zu 5-HMC übertragen, gefolgt von Klickchemie einen Linker Biotin für die einfache und dichteunabhängigen Anreicherung zu übertragen. Dieses effiziente und spezifische Kennzeichnung Methode ermöglicht die Anreicherung von 5-HMC mit extrem niedrigen Hintergrund und hohem Durchsatz epigenomischen Mapping über Next-Generation-Sequenzierung.

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Dieses Video stellt das Protokoll für die Signaldetektion während der chromogenen RNA-in-situ-Hybridisierung vor. Mit dieser Technik kann eine aktive onkogene Infektion visuell in einer intakten Gewebeprobe diagnostiziert werden.

RNA-CISH-Signaldetektion: Eine Technik zum Nachweis chromogener Signale während der RNA-In-situ-Hybridisierung in intakten Gewebeproben

Dieses Video beschreibt die Technik des Dot-Blots zur Bestimmung des Grades der DNA-Methylierung in menschlichen Chondrozyten in vitro durch das Blotten von DNA-Proben auf einer Nylonmembran und die anschließende Visualisierung mit monoklonalen Antikörpern. Dies hilft, den Phänotyp der Chondrozyten in verschiedenen Stadien der Kultur zu bestimmen.

5-Methylcytosin-Dot-Blot zur Bestimmung des Ausmaßes der DNA-Methylierung

Dieses Protokoll beschreibt den qPCR-Nachweis von Cytomegalievirus in formalinfixiertem, in Paraffin eingebettetem Biopsiegewebe, der schnell, sensitiv, spezifisch und nützlich für die Interpretation von mehrdeutigen Hämatoxylin- und Eosin- oder immunhistochemischen Färbemustern ist.

qPCR ist eine empfindliche und schnelle Methode zur Detektion von DNA Zytomegalieviren in Formalin-fixierte, in Paraffin eingebettete Gewebebiopsie

Hier präsentieren wir ein Protokoll, das auf der immunhistologischen Detektion von c-FOS-Proteinen basiert, einer klassischen Technik, die zur Identifizierung von neuronalen Populationen verwendet wird, die an spezifischen physiologischen Reaktionen in vivo und ex vivo beteiligt sind.

Die c-fos-Protein Immunohistologische Nachweis: Ein nützliches Werkzeug als Marker der Mittelwegen beteiligt sind in spezifischen physiologischen Antworten<em&gt; In Vivo</em&gt; und<em&gt; Ex Vivo</em

Neu entdeckte oxidierte Formen von 5-Methylcytosine (Oxi-mCs), 5-Hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-Formylcytosine (5-Fu) und 5-Carboxylcytosine (5caC) kann verschiedene DNA-Modifikationen mit einzigartigen funktionellen Rollen vertreten. Hier ist ein semi-quantitative Workflow zur Visualisierung der räumlichen Verteilung Oxi-mCs, Signal Intensität Profilierung und NS1 beschrieben.

Immunostaining für DNA-Modifikationen: computergestützte Analyse der konfokalen Bilder

Das Ziel dieses Berichts ist es, das Protokoll für robuste immunhistochemischen Nachweis von epigenetischen Markierungen beschreiben, 5-Methylcytosine (5mC) und 5-Hydroxymethylcytosine (5hmC) bei der Entwicklung und postmitotischen Maus Netzhaut.

Immunhistochemische Nachweis von 5 Methylcytosine und 5-Hydroxymethylcytosine bei der Entwicklung und der postmitotischen Maus Retina

Hier stellen wir ein Protokoll zum Nachweis von 5-Hydroxymethylcytosin in Zellen und Hirngeweben vor, wobei Immunfluoreszenzfärbungundungen und DNA-Dot-Blot-Methoden verwendet werden.

Der Nachweis von 5-Hydroxymethylcytosin in neuralen Stammzellen und Gehirnen von Mäusen

Das vorliegende Protokoll zeigt eine modifizierte Methode zum Nachweis und zur Quantifizierung von DNA-Protein-Crosslinks (DPCs) und deren posttranslationalen Modifikationen (PTMs), einschließlich Ubiquitylierung, SUMOylierung und ADP-Ribosylierung, die durch Topoisomerase-Inhibitoren und Formaldehyd induziert werden, wodurch die Bildung und Reparatur von DPCs und ihren PTMs untersucht werden kann.

Quantitativer Nachweis von DNA-Protein-Vernetzungen und deren posttranslationale Modifikationen

Das Protokoll beschreibt einen Tandem-Immunfluoreszenz-Hybridisierungsassay mit formalinfixiertem, paraffineingebettetem Gewebe zum gleichzeitigen Nachweis und zur Quantifizierung von microRNA und Multiplexproteinen.

MicroRNA-Amplifikation und -Erkennung durch In-situ-Hybridisierung mit gesperrten Nukleinsäuren als neuartige Detektions- und Quantifizierungsmethode

Lernen Sie die empfindliche Immunhistochemie zur Kartierung modifizierter Cytosinformen in Mausgeweben. Diese Methode nutzt Tyramid-Signalverstärkung für präzise räumliche Analysen epigenetischer Veränderungen.

Der Nachweis von modifizierte Formen von Cytosin Mit Sensitive Immunhistochemie

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