Überwachung Plasmid-Replikation in lebenden Säugerzellen über mehrere Generationen durch Fluoreszenz-Mikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Partitionierung viraler Genome in sich teilenden Zellen zu beobachten. Dazu wird zunächst ein Plasmid hergestellt, das durch Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht werden kann. Hier wird ein Plasmid so konstruiert, dass es Tandem-Wiederholungen der Laktose-Operator-Sequenz oder LAC O enthält.Der zweite Schritt besteht darin, das Plasmid in sich teilende Zellen einzuführen, gefolgt von einer Infektion der Zellen mit einem Retrovirus, das für den Laktose-Repressor oder das Lac-Auge kodiert, das mit einem fluoreszierenden Protein fusioniert ist.

Die Laktose-Repressor-Fusionsproteine binden spezifisch an die Laktose-Operatorsequenzen im Plasmidsub. Die Zellen werden durch Fluoreszenzmikroskopie überwacht, um einzelne Plasmide über mehrere Zellzyklen hinweg zu verfolgen. Letztendlich werden die aufgenommenen Bilder verarbeitet, um zu bestimmen, wie die viralen Genome in sich teilenden Zellen erhalten bleiben.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der quantitativen PCR, dem Southern-Blotting oder der Fluoreszenz-in-situ-You-Hybridisierung besteht darin, dass mit dieser Technik einzelne Plasmide zu mehreren Zeitpunkten beobachtet werden können. Um die Visualisierung des Plasmids durch Fluoreszenzmikroskopie zu ermöglichen, werden standardmäßige molekulare Klonierungstechniken verwendet, um ein A-DNA-Fragment mit etwa 250 Kopien der Laktose-Operator-Sequenz oder LAC O in das Plasmid einzubringen. In diesem Beispiel handelt es sich bei dem Plasmid um eine hintere Mitte von etwa 170 Kilobasenpaaren, die das gesamte Genom des Sarkom-assoziierten Herpesvirus (KSHV) enthält und für die Resistenz gegen Hygromycin kodiert.

Führen Sie die LAC O-haltige Plasmid-DNA durch Transfektion in Hela- und SLK-Säugetierzellen ein. In 60-Millimeter-Schalen inkubieren Sie Zellen mit 10 Mikrogramm gereinigtem Plasmid, DNA 25 Mikrolitern, Lipektomie, 2000 0,5 Millilitern, Optum und 3,5 Millilitern. DMEM für vier Stunden. Wechseln Sie das Medium auf DMEM mit 10 % fötalem Kälberserum und lassen Sie die Zellen 48 Stunden lang erholen.

Anschließend werden die transfizierten Zellen bei niedriger Dichte in großen Schalen plattiert und drei Wochen lang in DMEM mit 10 % fötalem Rinderserum und 300 Mikrogramm pro Milliliter Hygromycin kultiviert, um für das eingeführte Plasmid auszuwählen. Stellen Sie die Schalen nach ein bis zwei Wochen in den Inkubator, wenn transfizierte Klone gewachsen sind, um die Schale zu füllen, isolieren Sie die DNA für die Restriktionsverdauung und das Southern-Blotting, um sicherzustellen, dass das Polymer des LAC O-Plasmids homogen und von der erwarteten Größe ist. Dieser Beispiel-Blot zeigt, dass das LAC O-Polymer in Klon eins homogen und identisch mit dem der Positivkontrolle ist.

Wenn das Plasmid in Spur sieben nicht so konstruiert wurde, dass es eine Fusion des Laktoserepressors Lac Eye exprimiert, infizieren Sie geeignete Klone mit einem Retrovirus, das für Lac Eye kodiert, das mit einem rot fluoreszierenden Protein fusioniert, wie z. B. Lac Eye, TD Tomato, TD Tomate anstelle von Proteinen, die näher an Grün fluoreszieren, um die Phototoxizität zu minimieren, die bei mehrfacher Exposition über lange Zeiträume auftreten würde. Sobald das LAC-Augenfusionsprotein eingeführt ist, kultivieren Sie die Zellen in Gegenwart von 200 Mikrogramm pro Milliliter IPTG, um die Fusionsproteine daran zu hindern, DNA zu binden. Einer der kritischsten Aspekte dieses Verfahrens ist die Gewinnung von Klonen mit der entsprechenden Fluoreszenzintensität.

Eine große Anzahl von Klonen sollte gescreent werden, um diejenigen mit optimaler Fluoreszenzkultur zu identifizieren. Die Zellen für mindestens drei Tage, um die Expression des LAC eye TD-Tomatenproteins zu ermöglichen, screenen Klone für diejenigen mit optimalen Konzentrationen von lac eye, TD tomaten, die deutliche Signale mit minimalen Hintergrundmengen an ungebundenem Fusionsprotein zeigen, 24 bis 48 Stunden bevor sie die LAC I TD Tomaten exprimierenden Zellen abbilden, plattieren sie in einer 35 Millimeter Glasbodenschale bei einer Dichte von weniger als 10% Konfluenz. Auf diese Weise können sich Zellpaare in Kolonien von acht bis 16 Zellen teilen, ohne sich ein bis drei Stunden vor Beginn der Bildgebung zu überlappen.

Spülen Sie die Platte dreimal mit Kulturmedium ab, das sowohl selektive Arzneimittel als auch IPTG enthält. Dadurch werden nicht lebensfähige Zellen weggespült und die Lac-Augen-Fusionsproteine können LAC-Zyten in den Plasmiden binden. Ersetzen Sie das Nährmedium durch zwei Milliliter, DMEM durch 10 % fötales Rinderserum und 25 Millimolar Hippies inkubieren kurz vor der Bildgebung ein bis drei Stunden lang Ersetzen Sie die Oberseite der Kulturschale durch eine Kultfolie, die in einem Montagering für eine 35-Millimeter-Schale gespannt ist.

Diese Abdeckung hemmt die Verdunstung des Kulturmediums, was die Salzkonzentration im Laufe der Zeit erhöhen und die Zellen abtöten würde. Das in diesem Experiment verwendete Bildgebungssystem besteht aus einem inversen Zeiss-Mikroskop Axio 200 M, das mit einem motorisierten Tisch und einer EM-CCD-Kamera zur empfindlichen Detektion von Signalen ausgestattet ist. Das fluoreszierende Anregungslicht wird durch die neutralweiße LED eines Collibra-Systems bereitgestellt.

Das Bildgebungssystem wird von einer Software für die automatisierte Aufnahme von Bildern über lange Zeitintervalle mit mehreren Z-Stapeln gesteuert. Ein Inkubator wird verwendet, um die Zellen in einer befeuchteten Kammer bei 37 Grad Celsius und fünf bis 10 % Kohlendioxid zu halten. Verwenden Sie einen beheizten Kragen für das Ölobjektiv, um ein Absaugen des Objektivs zu verhindern.

Die Wärme aus der Probe lässt dem System genügend Zeit, um eine stabile Temperatur zu erreichen. Um Bewegungsartefakte während des Experiments zu minimieren, sollte das Bildgebungssystem auf einem Lufttisch sitzen, um von Vibrationen isoliert zu sein. Um mit dem Verfahren zur Visualisierung der markierten DNA zu beginnen, verwenden Sie die DIC-Bildgebung, um die Zellen zu betrachten und die Brennebene der Ober- und Unterseite der Zellen in mehreren Sichtfeldern zu bestimmen. In jedem Feld bewegen Sie sich zu einer Brennebene, die etwa ein Drittel des Weges von der Oberseite der Zelle nach unten verläuft, speichern Sie das x, y, Z-Koordinaten in der Liste der gespeicherten Bühnenpositionen.

Jede dieser gespeicherten Positionen ist das Zentrum eines Zack von Bildern, um die Zelle in der Mikroskopsteuerungssoftware zu erfassen, definieren Sie einen Zack von Bildern, die an jeder gespeicherten Tischposition durchgeführt werden sollen, definieren Sie genügend Schichten, so dass die gesamte Zelle zusammen mit zusätzlichen Schichten über und unter den Ebenen, in denen sich die Zellen befinden, erfasst wird. Wählen Sie eine Z-Schrittgröße von 0,35 bis 0,50 Mikrometern, um eine ungefähre Nyquist-Probenahme in der Z-Dimension zu ermöglichen. Diese Scheiben ermöglichen die Detektion der Zellbewegungen während des Zellzyklus und werden auch bei der Nachbearbeitung der Bildstapel verwendet.

Dies führt zu einem Stapel von 40 bis 60 Bildern, abhängig von der Dicke der Zellen. Definieren Sie ein Zeitreihenexperiment, um ein Hellfeldbild der Zacks in 30-Minuten-Intervallen und Fluoreszenzbilder in Intervallen von 10 bis 60 Minuten zu erfassen. Verwenden Sie während des Experiments keine DIC-Bildgebung, da sie mehr Licht benötigt als die Standard-Hellfeld-Bildgebung, die die Zellen im Laufe langer Experimente unnötig der Phototoxizität aussetzen kann.

Starten Sie das softwaregesteuerte Experiment. Stellen Sie sicher, dass das System während des Experiments nicht gestört wird. Nachdem alle Bilder für das Experiment erfasst wurden, überprüfen Sie die Bilder für jeden Zack und jeden Zeitpunkt, und schneiden Sie alle nicht benötigten Bereiche der Bilder aus, um die Verarbeitungszeit des Computers zu reduzieren.

Im nächsten Schritt, um die Signalintensität dem Ursprungspixel in jedem Z-Stack neu zuzuweisen. Verwenden Sie einen Dekonvolutionsalgorithmus in der Axio Vision Software, der auf der gemessenen Punktspreizungsfunktion des Bildgebungssystems basiert. Das Ergebnis der Dekonvolution ist hier dargestellt.

Untersuchen Sie die Bilder, um die Intensitätsänderungen und Bewegungen von Plasmiden während des Zellzyklus und die Aufteilung der Plasmide auf die Tochterzellen zu verfolgen. Diese Bilder, die rechnerisch erstellt wurden, um mehrere Z-Ebenen einzubeziehen, in denen sich die verschiedenen Signale befinden, zeigen, dass die Kerne von HELOC-Zellen, die LAC-Augen-TD-Tomate exprimieren, aufgrund des Kernlokalisierungssignals auf dem Fusionsprotein fluoreszieren und es im Zellkern lokalisieren. In Abwesenheit von I-P-T-G-K-S-H-V-Genomen, die für LAC O-Sequenzen kodieren, rekrutieren viele Kopien des fluoreszierenden Proteins und heben sich als helle Signale von der Hintergrundintensität des Zellkerns ab.

Im Gegensatz dazu werden in Gegenwart von IPTG die fluoreszierenden Proteine des LAC-Auges daran gehindert, an ihre Erkennungsmangel-O-Sequenz zu binden, maximale Intensitätsprojektionen von Zack erhalten von einem er einen Zellzyklus zum fünften Zeitpunkt. In dieser Abbildung sind Punkte in einem repräsentativen Experiment dargestellt. Die fluoreszenzmarkierten viralen Genome in der Zelle, die in Panel A zu sehen ist, werden in der in Panel B gezeigten Zelle synthetisiert.Die viralen Genome werden dann während der Zellteilung an Tochterzellen aufgeteilt, wie in Panel C, D und E beobachtet.Der Zellzyklus für gesunde HELOC-Zellen dauert etwa 24 Stunden, und Tochterzellen heften sich typischerweise nahe beieinander und teilen sich im nächsten Zellzyklus zur gleichen Zeit.

Mit diesem Protokoll können die viralen Genome in der Zelle über mehrere Generationen hinweg verfolgt werden, während dieses Verfahren versucht wird. Es ist wichtig, daran zu denken, die Zellmorphologie in der Generationszeit zu beobachten, um sicherzustellen, dass die Zellen während des gesamten Experiments gesund sind.