Name: Überwachung Plasmid-Replikation in lebenden Säugerzellen über mehrere Generationen durch Fluoreszenz-Mikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 34 s
Description: Lernen Sie die Fluoreszenz-Mikroskopie zur Beobachtung von Plasmid-Replikation in lebenden Säugerzellen über mehrere Generationen. Diese Methode ermöglicht die Verfolgung einzelner DNA-Moleküle in teilenden Zellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der NIH und ACS, einschließlich T32CA009135, CA133027, CA070723 und CA022443 finanziert. Bill Sugden ist ein American Cancer Society Research Professor.

Ein. Engineering von Zellen mit Visible Plasmide <ol><li> Verwenden Standard Restriktionsverdau oder homologe Rekombination Techniken, um eine DNA-Fragment, das etwa 250 Kopien des Lactose-Operatorsequenz (lacO) in das Plasmid zu visualisierenden einzuführen. Unsere Plasmid war ein Bacmid von etwa 170 kbp und enthalten das gesamte Genom des Kaposi-Sarkom assoziierte Herpes-Virus (KSHV) und kodierte Resistenz gegen Hygromycin 12. </li><li> Einführen LacO enthaltenden Plasmid-DNA in Säugetierzellen durch Transfektion mit Lipofectamin 2000. Wir transfizierten HeLa-Zellen und SLK in 60 mm-Schalen für 4 h mit 10 ug gereinigten Plasmid-DNA mit 25 ul Lipofectamin 2000, 0,5 ml OptiMEM, und 3,5 ml DMEM. </li><li> Ändern des Kulturmediums zu 5 ml DMEM mit 10% fötalem Rinderserum und inkubieren Zellen für 48 Stunden. </li><li> Platte die Zellen bei geringer Dichte in großen Gerichten und Kultivierung von Zellen in einem Medium mit einer Antibiotika-Selektion für die Einführung plasmid, wir ausgewählten Zellen in DMEM mit 10% fötalem Rinderserum mit 300 ug / ml Hygromycin für 3 Wochen. </li><li> Verwenden Stück sterile, Trypsin-getränkten Filterpapier Hygromycin-resistente Kolonien auf neue Kulturschalen übertragen. </li><li> Wenn transfizierten Klone wurden gezüchtet, um den Teller zu füllen, Isolieren DNA für Restriktionsverdau und Southern Blotting, um sicherzustellen, dass das Polymer der LacO Plasmid homogen ist und der erwarteten Größe. </li><li> Wird das Plasmid wurde nicht ausgeführt, um eine Verschmelzung von LacI exprimieren, infizieren geeignete Klone mit einem Retrovirus Codieren des Lactose-Repressor (lacI), fusioniert an ein rot fluoreszierendes Protein, wie LacI-tdTomato. Wir verwenden tdTomato anstatt Proteine, die näher an grün zu photoxicity, die aus mehreren Belichtungen über lange Zeiten 13 auftreten würden, zu minimieren fluoreszieren. </li><li> Sobald das LacI Fusionsprotein eingeführt wird, die Zellen Kultur in Gegenwart von 200 ug / ml Isopropyl-bD-Thiogalactosid (IPTG), um die Fusionsproteine ​​aus Bindung zu blockierenDNA. </li><li> Kultur wurden die Zellen für mindestens 3 Tage, damit Ausdruck der LacI-tdTomato Protein. </li><li> Bildschirm Klone (durch Wegwaschen der IPTG und Anzeigen Zellen wie nachstehend beschrieben) für die mit optimalen Mengen an LacI-tdTomato, die unterschiedliche Signale mit minimaler offenbaren Hintergrundwerte von ungebundenen Fusionsproteins. </li></ol> 2. Entwicklung der Imaging System Unsere Imaging-System besteht aus einem Zeiss Axiovert 200M mit einem motorisierten Bühne und Plan-Aochromat 63x/1.4 Öl-Objektiv ausgestattet. Fluoreszenzanregungslichtquelle wird durch die &quot;neutral white&quot; eines Colibri System-LED zur Verfügung gestellt. Emission wird von einem CascadeII erkannt: 1024 EMCCD Kamera. Dies ist ein gekühlter, Back-ausgedünnt Kamera mit einer Verstärkung zum Verstärken von Signalen Register; der Dunkelstrom 0,061 Elektronen pro Pixel pro Sekunde, und die Quantenausbeute größer als 0,90 ist. Das System wird durch Software gesteuert Axiovision 4,8, einschließlich der SmartExperiments Modul. Zur Detektion von tdTomazu verwenden wir eine Zeiss Filtersatz 75HE, für die 85% der übergebenen Licht kann die Fluor und 95% des emittierten Lichts zu erregen passieren die Emissions-Filter. <ol><li> Montieren eines Bildgebungssystems mit einem invertierten Mikroskop und einer EMCCD Kamera zum empfindlichen Nachweis von Signalen, eine LED-Lichtquelle für spezifische Anregungs und schnelle Schalung einer motorisierten Tisch und Fokus Arm und Software-Steuerung für automatisierte Akquisitionen von Bildern über lange Zeitintervalle mit mehrfachen z-Stacks. Das System sollte auf einem Lufttisch von Vibrationen isoliert werden sitzen. </li><li> Montieren Sie eine Bühne-top Inkubator Zellen bei 37 ° C, 5-10% CO 2 in einer feuchten Kammer halten. Genügend Zeit für das System auf eine stabile Temperatur kommen, um Bewegungsartefakte während des Experiments zu minimieren. </li><li> Verwenden Sie einen beheizten Kragen für das Ziel, das Ziel von Absaugen von Wärme aus der Probe zu verhindern. </li></ol> 3. Visualisierung markierter DNA <ol><li> Platte Zellen in einer 35 mmGlasboden Schale bei einer Dichte von weniger als 10% Konfluenz, die Paare von Zellen erlauben, in Kolonien von 8-16 Zellen ohne Überlappung unterteilen wird. Tun Sie dies mindestens 24-48 Stunden vor der Belichtung, so dass die lebensfähigen Zellen Zeit zu teilen haben. </li><li> Ein bis drei Stunden vor dem Beginn der Bildgebung, Spülen Sie die Platte 3 mal mit Kulturmedium, das sowohl selektive Drogen und IPTG fehlt. Dieses Verfahren wäscht nicht lebensfähigen Zellen und ermöglicht LacI Fusionsproteine ​​LacO Plattformen mit den Plasmiden binden. </li><li> Ersetzen des Kulturmediums mit 2 ml DMEM mit 10% fötalem Rinderserum und 25 mM HEPES. </li><li> Ersetzen Sie den oberen Teil der Kulturschale mit CultFoil gestreckt in einem Befestigungsring für einen 35-mm-Schale. Diese Abdeckung wird inhibieren Verdampfen des Kulturmediums, die Salzkonzentration über die Zeit erhöhen würde und tötet die Zellen. </li><li> Verwenden differenziellen Interferenz (DIC)-Bildgebung, die Zellen anzeigen und bestimmen die Brennebene der Ober-und Unterseite der Zellen in mehreren Sichtfelder.In jedem Feld auf eine Brennebene zu bewegen etwa 1/3 des Weges nach unten von der Oberseite der Zelle. Speichern Sie die x, y, z-Koordinaten in der Liste der gespeicherten Bühne Positionen. Anmerkung: Das Plasmid Signale möglicherweise nicht durch die Okulare, wenn Zellen durch LEDs der Wellenlänge geeignet für die LacI Fusionsprotein beleuchtet werden sichtbar. Schwache Signale können nur sichtbar mit der Verwendung des EMCCD Kamera, die Integration ermöglicht des Signals über die Zeit und damit wirkungsvoll verstärkt schwache Signale. </li><li> Im Mikroskop Steuerungssoftware, definieren eine Z-Stapel von Bildern, um an jeder Stufe gespeicherten Position durchgeführt werden. Wählen az Schrittweite von 0,35-0,50 um, die Sie zur Angleichung Nyquist in z-Richtung 14 ermöglicht. Include &quot;extra&quot; Scheiben oberhalb und unterhalb der Ebenen, in denen die Zellen befinden; diese Scheiben erlauben, den folgenden Zellbewegungen während des Zellzyklus und werden auch in der Post-Akquisition-Verarbeitung (Dekonvolution) der Bildstapel verwendet. Diese Einbeziehung wirdführen in einem Stapel von 40 bis 60 Bilder je nach der Dicke der Zellen. </li><li> Im Mikroskop Steuerungssoftware, definieren eine Zeitreihe Experiment ein Hellfeldbild des z-Stacks bei 30 min-Intervallen (zum Verfolgen Zellteilungen und Migrationen über lange Zeiten) und Fluoreszenzbilder bei 10-60 min Intervallen sammeln (zur Visualisierung Plasmiden innerhalb der Zellen). Verwenden Sie keine DIC Bildgebung während des Experiments, da es mehr Licht als Standard Hellfeldabbildung, die die Zellen ausgesetzt werden können unnötig Phototoxizität im Laufe der langen Experimenten erfordert. </li><li> Starten Sie die Software-kontrolliertes Experiment. Stellen Sie sicher, dass das System nicht gestört wird (bestoßen, ausgesetzt, um überschüssige Raumlicht, etc.) während des Experiments. </li><li> Bei Bedarf füllt die Wasser in dem Befeuchtungssystem während des Experiments. </li></ol> 4. Post-Akquisition Verarbeitung von Images <ol><li> Überprüfen Sie die Bilder für jedes z-Stack und Zeitpunkt. Ernte aus alle nicht benötigten Bereichedie Bilder auf den Computer Verarbeitungszeit in dem nächsten Schritt zu verringern. </li><li> Verwenden Sie einen Dekonvolutionsalgorithmus neu zuweisen Signalintensität der Pixel des Ursprungs in jeder z-Stapel 15. Während dieser Entfaltung auf einer theoretischen Punktstreufunktion für Ihre Bildgebungssystem basieren können, ist es vorzuziehen, die Punktstreufunktion eines bestimmten Systems durch Abbilden fluoreszierenden Mikrosphären zu messen, und diese Messung in der Entfaltungs-Algorithmus. Wir maßen die Point-Spread-Funktion unserer Imaging-System und angewandte a eingeschränkt iterativen Maximum-Likelihood-Algorithmus in AxioVision Software (Software AxioVision Beschreibung, Zeiss). </li><li> Untersuchen Sie die Bilder, um die Intensität Veränderungen und Bewegungen von Plasmiden während des Zellzyklus und die Partitionierung von Plasmiden an Tochterzellen zu verfolgen. </li></ol>

<ol><li>Cesarman, E., Chang, Y., Moore, P. S., Said, J. W., Knowles, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus-like+DNA+sequences+in+AIDS-related+body-cavity-based+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-related body-cavity-based lymphomas.</a> N. Engl. J. Med. 332, 1186-1191 (1995).</li>
<li>Chang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+herpesvirus-like+DNA+sequences+in+AIDS-associated+Kaposi%27s+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi's sarcoma.</a> Science. 266, 1865-1869 (1994).</li>
<li>Knipe, D. M., Howley, P. M., Griffin, D. E., Lamb, R. A., Martin, M. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKnipe%2C+DM+%22Fields+Virology+2+volume+set%22">Fields Virology 2 volume set</a>. , Lippincott Williams & Wilkins. (2006).</li>
<li>Adams, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+latent+Epstein-Barr+virus+genomes+in+Raji+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Replication of latent Epstein-Barr virus genomes in Raji cells.</a> J. Virol. 61, 1743-1746 (1987).</li>
<li>Humme, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+EBV+nuclear+antigen+1+%28EBNA1%29+enhances+B+cell+immortalization+several+thousandfold%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The EBV nuclear antigen 1 (EBNA1) enhances B cell immortalization several thousandfold.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 10989-10994 (1073).</li>
<li>Verma, S. C., Choudhuri, T., Robertson, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+minimal+replicator+element+of+the+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus+terminal+repeat+supports+replication+in+a+semiconservative+and+cell-cycle-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">The minimal replicator element of the Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus terminal repeat supports replication in a semiconservative and cell-cycle-dependent manner.</a> J. Virol. 81, 3402-3413 (2007).</li>
<li>Yates, J. L., Guan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epstein-Barr+virus-derived+plasmids+replicate+only+once+per+cell+cycle+and+are+not+amplified+after+entry+into+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Epstein-Barr virus-derived plasmids replicate only once per cell cycle and are not amplified after entry into cells.</a> J. Virol. 65, 483-488 (1991).</li>
<li>Ye, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus+latent+nuclear+antigen+leads+to+abortive+episome+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Disruption of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus latent nuclear antigen leads to abortive episome persistence.</a> J. Virol. 78, 11121-11129 (2004).</li>
<li>Robinett, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+localization+of+DNA+sequences+and+visualization+of+large-scale+chromatin+organization+using+lac+operator%2Frepressor+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition.</a> J. Cell Biol. 135, 1685-1700 (1996).</li>
<li>Nanbo, A., Sugden, A., Sugden, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+coupling+of+synthesis+and+partitioning+of+EBV%27s+plasmid+replicon+is+revealed+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">The coupling of synthesis and partitioning of EBV's plasmid replicon is revealed in live cells.</a> Embo. J. 26, 4252-4262 (2007).</li>
<li>Herndier, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+human+Kaposi%27s+sarcoma+cell+line+that+induces+angiogenic+tumors+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Aids%22%5BJournal%5D)">Characterization of a human Kaposi's sarcoma cell line that induces angiogenic tumors in animals.</a> Aids. 8, 575-581 (1994).</li>
<li>Zhou, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+infection+by+a+recombinant+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus+cloned+in+a+bacterial+artificial+chromosome%3A+application+for+genetic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Efficient infection by a recombinant Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus cloned in a bacterial artificial chromosome: application for genetic analysis.</a> J. Virol. 76, 6185-6196 (2002).</li>
<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+monomeric+red%2C+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).</li>
<li>Pawley, J. B. Points, pixels, and gray levels: digitizing image data. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawley%2C+JB+%22Handbook+of+Biological+Confocal+Microscopy%22">Handbook of Biological Confocal Microscopy</a>. Pawley, J. B. , 3rd, Springer Science & Business Media, LLC. New York. 59-79 (2006).</li>
<li>Cannell, M. B., McMorland, A., Soeller, C. Image enhancement by deconvolution. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCannell%2C+MB+%22Handbook+of+biological+confocal+microscopy%22">Handbook of biological confocal microscopy</a>. Pawley, J. B. , 3rd, Springer Science & Business Media, LLC. New York. 488-500 (2006).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Das hier beschriebene Verfahren kann verwendet werden, um die Plasmide in lebenden Säugetierzellen zeitlich über mehrere Generationen zu folgen. Durch die Begrenzung der Exposition gegenüber Anregungslicht, haben wir diese Techniken verwendet, um Zellen aus neu eingeteilt paarweise durch Kolonien von 16-32 Zellen folgen, die mindestens 72 Stunden und 3 Zellteilungen. Diese Versuche liefern Informationen, die nicht vom statischen Assays wie quantitative PCR, Southern Blotting und FISH erhalten werden kann. <p class="...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> GIBCO </td><td> 11965 </td><td></td></tr><tr><td> OptiMEM </td><td> GIBCO </td><td> 31985 </td><td></td></tr><tr><td> Fötales Rinderserum </td><td> Hyclone </td><td> SH30910.03 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin </td><td> Sigma </td><td> P3032 </td><td></td></tr><tr><td> Streptomycinsulfat </td><td> Sigma </td><td> S9137 </td><td></td></tr><tr><td> Hygromycin </td><td> Calbiochem </td><td> 400050 </td><td> 400 ug / ml für SLK, 300 ug / ml für HeLa </td></tr><tr><td> Isopropyl-bD-Thiogalactosid (IPTG) </td><td> Roche </td><td> 10 724 815 001 </td><td> Endkonzentration 200 pg / ml </td></tr><tr&gt; <td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668-027 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> GIBCO </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> Glass-bottom Gerichten </td><td> MatTek </td><td> P35G-1.5-10-C </td><td></td></tr><tr><td> CultFoil </td><td> Pecon </td><td> 000000-1116-08 </td><td></td></tr><tr><td> Axiovert 200M </td><td> Zeiss </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Colibri </td><td> Zeiss </td><td> 423052-9500-000 </td><td></td></tr><tr><td> Neutral weiße LED </td><td> Zeiss </td><td> 423052-9120-000 </td><td></td></tr><tr><td> Filter Cube 75 HE </td><td> Zeiss </td><td> 489075-0000-000 </td><td></td></tr><tr><td> Plan-Apochromat 63x/1.4 Ziel </td><td> Zeiss </td><td> 440762-9904-000 </td><td></td></tr><tr><td> CascadeII: 1024 EMCCD-Kamera </td><td> Photometrics </td><td> B10C892007 </td><td></td></tr><tr><td> Tempcontrol mini </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 000000-1116-070 </td><td></td></tr><tr><td> Tempcontrol 37-2 digital </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 000000-1052-320 </td><td></td></tr><tr><td> CTI-Controller 3700 digitalen </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 411856-9903 </td><td></td></tr><tr><td> Ziel Heizer </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 440760-0000-000 </td><td></td></tr><tr><td> Stufe Heizeinsatz P </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 411861-9901-000 </td><td></td></tr><tr><td> Stage-top Inkubator S </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 411860-9902-000 </td><td></td></tr><tr><td> Luftbefeuchter-System </td><td> Zeiss / Pecon </td><td> 000000-1116-065 </td><td></td></tr></tbody></table>

Überwachung plasmid-replikation in lebenden säugerzellen über mehrere generationen durch fluoreszenz-mikroskopie

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Einige natürlich vorkommende Plasmide in Säuger-Zellen aufrechterhalten. Unter diesen sind Genomen von Gamma-Herpesviren, einschließlich Epstein-Barr-Virus (EBV) und Kaposi-Sarkom assoziierte Herpes-Virus (KSHV), die mehrere menschlichen Malignitäten 1-3 verursachen. Diese beiden Genomen sind in einem lizenzierten Weise jede Verwendung eines einzigen viralen Proteins und zellulären Replikationsmaschinerie repliziert und an Tochterzellen weitergegeben während der Zellteilung trotz ihrer fehlenden traditionellen Centromeren 4-8. Viel Arbeit wurde getan, um die Wiederholungen dieser Plasmid Genome Charakterisierung mit Methoden wie Southern-Blot-und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH). Diese Methoden sind beschränkt, though. Quantitative PCR und Southern-Blots geben Auskunft über die durchschnittliche Anzahl von Plasmiden pro Zelle in einer Population von Zellen. FISH ist ein Single-Zell-Assay, der sowohl die durchschnittliche Anzahl und die Verteilung von Plasmid enthüllt<html> s pro Zelle in der Population von Zellen, jedoch statisch ist, so dass keine Informationen über die Eltern oder Nachkommen des untersuchten Zelle. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Visualisierung von Plasmiden in lebenden Zellen. Dieses Verfahren basiert auf der Bindung eines fluoreszenzmarkierten Lactose Repressorproteins an mehrere Stellen des Plasmids von Interesse 9 basiert. Die DNA von Interesse wird ausgeführt, um etwa 250 Tandemwiederholungen des Lactose-Operator (LacO)-Sequenz umfassen. LacO speziell vom Lactose-Repressor-Protein (LacI), die mit einem fluoreszierenden Protein fusioniert werden kann, gebunden. Das Fusionsprotein kann entweder aus dem konstruierten Plasmids oder eingeführt durch einen retroviralen Vektor exprimiert werden. Auf diese Weise werden die DNA-Moleküle fluoreszierend markierten und damit sichtbar werden über Fluoreszenzmikroskopie. Das Fusionsprotein wird die Bindung der Plasmid-DNA durch Kultivieren von Zellen in der Gegenwart von IPTG blockiert, bis die Plasmide bereit, zu betrachten sind. nhalt &quot;&gt; Dieses System ermöglicht die Plasmide in lebenden Zellen über mehrere Generationen, offenbart Eigenschaften ihrer Synthese und Partitionierung Tochterzellen überwacht werden. Ideal Zellen haftende, leicht transfiziert und haben große Kerne. Diese Technik wurde verwendet, um festzustellen, dass 84% der EBV-abgeleitete Plasmide jede Generation synthetisiert und 88% des neu synthetisierten Plasmide Partition getreu Tochterzellen in HeLa-Zellen. Paare dieser EBV Plasmide wurden als zu angebunden werden oder damit verbunden Schwesterchromatiden nach ihrer Synthese in der S- Phase bis sie gesehen wurden, wie die Schwesterchromatiden in Anaphase 10 getrennt voneinander zu trennen. Die Methode wird derzeit verwendet, um die Replikation von KSHV Genome in HeLa-Zellen und SLK Zellen zu untersuchen. HeLa-Zellen werden immortalisierten humanen Epithelzellen und SLK Zellen immortalisierten humanen Endothelzellen Zellen. Obwohl SLK Zellen wurden ursprünglich aus einem KSHV Läsion abgeleitet, weder die HeLa noch SLK Zelllinie natürlich harbors KSHV Genome 11. Neben dem Studium Virusreplikation kann diese Visualisierungstechnik verwendet, um die Wirkungen der Zugabe, Entfernen oder Mutation der DNA-Sequenz verschiedenen Elemente auf Synthesegas-, Lokalisierungs-und Partitionierung von anderen rekombinanten Plasmid-DNAs zu untersuchen.

<html> Maximalintensität Vorsprünge von z-Stacks in einem repräsentativen Experiment erworbenen sind in Abbildung 3 dargestellt. Typische Plasmid Signale vorhanden sind in 3-8 Scheiben des Z-Stapel, je nachdem, ob sie für Einfachbindungen oder Clustern von Plasmiden. Im Fall von EBV-und KSHV abgeleitete Plasmide, bewegen sich die Signale innerhalb der Zelle langsam, bis die Zelle gelangt Mitose. Die Zellen selbst wandern über den Verlauf des Experiments. Sie werden auch sphärische und lösen sich von der ...

Verfahren zur Beobachtung der einzelnen DNA-Molekülen in lebende Zellen beschrieben. Die Technik basiert auf der Bindung eines fluoreszenzmarkierten Proteins an lac-Repressor-Bindungsstellen in die DNA von Interesse entwickelt basiert. Dieses Verfahren kann gut auf rekombinanten DNAs in lebende Zellen im Laufe der Zeit zu folgen.

Überwachung Plasmid-Replikation in lebenden Säugerzellen über mehrere Generationen durch Fluoreszenz-Mikroskopie

Nur wenige natürlich vorkommende Plasmide werden in Säugetierzellen aufrechterhalten. Dazu gehören Genome von Gamma-Herpesviren, einschließlich des Epstein-Barr-Virus (EBV) ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Verteilung viraler Genome in teilenden Zellen zu beobachten. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Plasmid hergestellt wird, das mittels Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht werden kann. Hier wird ein Plasmid so konstruiert, dass es tandemartig angeordnete Wiederholungen der Lactose-Operatorsequenz oder LAC O enthält. Der zweite Schritt besteht darin, das Plasmid in teilende Zellen einzubringen und diese anschließend mit einem Retrovirus zu infizieren, das den Lactose-Repressor oder lac eye kodiert, das mit einem fluoreszierenden Protein fusioniert ist.Die Lactose-Repressor-Fusionsproteine binden spezifisch an die Lactose-Operatorsequenzen im Plasmid-Sub. Die Zellen werden mittels Fluoreszenzmikroskopie überwacht, um einzelne Plasmide über mehrere Zellzyklen hinweg zu verfolgen. Schließlich werden die gewonnenen Bilder verarbeitet, um zu bestimmen, wie die viralen Genome in teilenden Zellen erhalten bleiben.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der quantitativen PCR, Southern-Blotting oder der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung besteht darin, dass mit dieser Technik einzelne Plasmide zu mehreren Zeitpunkten beobachtet werden können. Um die Visualisierung des Plasmids mittels Fluoreszenzmikroskopie zu ermöglichen, werden Standardmethoden der molekularen Klonierung verwendet, um ein DNA-Fragment, das etwa 250 Kopien der Lactose-Operator-Sequenz (LAC O) enthält, in das Plasmid einzubringen. In diesem Beispiel handelt es sich bei dem Plasmid um ein BAC-Konstrukt mit einer Größe von etwa 170 Kilobasenpaaren, das das komplette Genom des mit Kaposisarkom assoziierten Herpesvirus (KSHV) enthält und eine Resistenz gegen Hygromycin vermittelt. Führen Sie die LAC O enthaltende Plasmid-DNA mittels Transfektion in humane Hela- und SLK-Säugerzellen in 60-Millimeter-Kulturplatten ein, indem Sie die Zellen 4 Stunden mit 10 µg gereinigtem Plasmid-DNA, 25 µL Lipo­fect­a­min™ 2000, 0,5 mL Opti-MEM und 3,5 mL DMEM inkubieren. Ersetzen Sie danach das Medium durch DMEM mit 10 % fetalem Kälberserum und lassen Sie die Zellen 48 Stunden lang regenerieren.Im Anschluss die transfizierten Zellen in großen Petrischalen bei geringer Dichte plattieren und drei Wochen lang in DMEM mit 10 % fetalem Kälberserum und 300 Mikrogramm pro Milliliter Hygromycin kultivieren, um für das eingeführte Plasmid zu selektieren. Mit Stücken steriler Pipetten und durchtränktem Filterpapier hygromycinresistente Kolonien in neue Kulturschalen überführen. Nach ein bis zwei Wochen die Schalen in den Inkubator stellen, wenn die transfizierten Klone so weit gewachsen sind, dass sie die Schale ausfüllen, DNA isolieren und einer Restriktionsverdauung sowie Southern-Blot-Analyse unterziehen, um sicherzustellen, dass das Polymer des LAC-O-Plasmids homogen und von der erwarteten Größe ist. Dieser beispielhafte Blot zeigt, dass das LAC-O-Polymer in Klon eins homogen ist und mit dem des positiven Kontrollansatzes identisch ist.In Band sieben, wenn das Plasmid nicht so konstruiert wurde, dass es eine Fusion des Lactose-Repressors Lac Eye exprahiert, infizieren Sie geeignete Klone mit einem Retrovirus, das Lac Eye fusioniert mit einem rot fluoreszierenden Protein wie Lac Eye, TD Tomato kodiert. TD Tomato wird gegenüber Proteinen, die näher am Grünen fluoreszieren, gewählt, um die Phototoxizität zu minimieren, die bei mehrfacher Belichtung über längere Zeiträume auftreten würde. Sobald das Lac-Eye-Fusionsprotein eingeführt ist, kultivieren Sie die Zellen in Gegenwart von 200 Mikrogramm pro Milliliter IPTG, um die Bindung des Fusionsproteins an die DNA zu blockieren. Einer der kritischsten Aspekte dieses Verfahrens ist das Erhalten von Klonen mit der geeigneten Fluoreszenzintensität.Es sollte eine große Anzahl von Klonen auf optimal fluoreszierende Kulturen untersucht werden. Kultivieren Sie die Zellen mindestens drei Tage lang, um die Expression des LacI-TdTomato-Proteins zu ermöglichen. Untersuchen Sie die Klone auf optimale LacI-TdTomato-Spiegel, die deutliche Signale mit minimalem Hintergrund an ungebundenem Fusionsprotein zeigen. 24 bis 48 Stunden vor der Bildaufnahme säen Sie die LacI-TdTomato-exprimierenden Zellen in eine 35-Millimeter-Glasbodenkulturschale mit einer Dichte von weniger als 10 % Konfluenz aus. Dadurch können einzelne Zellenpaare sich zu Kolonien von acht bis 16 Zellen teilen, ohne sich zu überlappen, was eine Stunde bis drei Stunden vor Beginn der Bildaufnahme gewährleistet.Spülen Sie die Platte dreimal mit Kulturmedium, das weder selektive Wirkstoffe noch IPTG enthält. Dadurch werden nicht lebensfähige Zellen entfernt und die lac-Auge-Fusionsproteine können an LAC-Zellen in den Plasmiden binden. Ersetzen Sie das Kulturmedium durch zwei Milliliter DMEM mit 10 % fetalem Kälberserum und 25 Millimolar Hippies. Inkubieren Sie für eine bis drei Stunden, kurz vor der Bildaufnahme ersetzen Sie den Deckel der Kulturschale durch eine Kultfolie, die in einem Montagering für eine 35-Millimeter-Schale gespannt ist.Diese Abdeckung verhindert die Verdunstung des Kulturmediums, wodurch sich sonst die Salzkonzentration im Laufe der Zeit erhöhen und die Zellen abtöten würde. Das in diesem Experiment verwendete Abbildungssystem besteht aus einem umgekehrten Mikroskop Zeiss Axio 200 M, das mit einem motorisierten Probentisch und einer EM-CCD-Kamera zur empfindlichen Detektion von Signalen ausgestattet ist. Das fluoreszente Anregungslicht wird durch die neutrale weiße LED eines Collibra-Systems bereitgestellt.Das Abbildungssystem wird über eine Software gesteuert, die automatisierte Aufnahmen von Bildern über längere Zeiträume mit mehreren Z-Stapeln ermöglicht. Ein Inkubator für den Objekttisch wird verwendet, um die Zellen bei 37 Grad Celsius und fünf bis 10 % Kohlendioxid in einer befeuchteten Kammer zu halten. Verwenden Sie eine beheizte Hülse für das Öl-Objektiv, um zu verhindern, dass das Objektiv Wärme abzieht.Die Wärme der Probe ermöglicht es, ausreichend Zeit zu gewähren, damit das System eine stabile Temperatur erreicht. Um Bewegungsartefakte während des Experiments zu minimieren, sollte das Abbildungssystem auf einem Lufttisch stehen, um Vibrationen auszuschließen. Um mit der Prozedur zur Visualisierung markierter DNA zu beginnen, verwenden Sie die DIC-Abbildung, um die Zellen zu betrachten und die Fokusebene der Ober- und Unterseite der Zellen in mehreren Sichtfeldern zu bestimmen. In jedem Feld wechseln Sie zu einer Fokusebene, die ungefähr ein Drittel von der Zellspitze entfernt liegt, und speichern Sie die x-, y-, z-Koordinaten in der Liste der gespeicherten Objekttischpositionen.Jede dieser gespeicherten Positionen wird der Mittelpunkt eines Z-Stapels von Bildern sein, um die Zelle im Mikroskop-Steuerungssoftware zu erfassen; definieren Sie einen Z-Stapel von Bildern, der an jeder gespeicherten Position des Probentisches durchgeführt werden soll, und legen Sie ausreichend viele Schichten fest, sodass die gesamte Zelle erfasst wird, einschließlich zusätzlicher Schichten oberhalb und unterhalb der Ebenen, in denen sich die Zellen befinden. Wählen Sie eine Z-Schrittgröße von 0,35 bis 0,50 Mikrometern, um eine annähernde Nyquist-Abtastung in Z-Richtung zu ermöglichen. Diese Schichten ermöglichen die Nachverfolgung von Zellbewegungen während des Zellzyklus und werden zudem bei der Nachbearbeitung der Bildstapel verwendet.Dadurch ergibt sich je nach Dicke der Zellen ein Stapel von 40 bis 60 Bildern. Legen Sie ein Zeitreihen-Experiment fest, um im Abstand von 30 Minuten ein Hellfeldbild der Zacks sowie Fluoreszenzbilder im Abstand von 10 bis 60 Minuten aufzunehmen. Verwenden Sie während des Experiments keine DIC-Bildgebung, da diese mehr Licht erfordert als die Standard-Hellfeldbildgebung, was die Zellen bei langen Experimenten unnötig einer Phototoxizität aussetzen könnte.Starten Sie das softwaregesteuerte Experiment. Stellen Sie sicher, dass das System während des Experiments nicht gestört wird. Nachdem alle Bilder für das Experiment aufgenommen wurden, überprüfen Sie die Bilder für jeden Zack und jeden Zeitpunkt und beschneiden Sie unnötige Bildbereiche, um die Computer-Verarbeitungszeit zu verkürzen.Im nächsten Schritt wird die Signalintensität jedem Pixel des Ursprungs in jedem Z-Stack erneut zugeordnet. Verwenden Sie einen Entfaltungs-Algorithmus in der Axio-Vision-Software, der auf der gemessenen Punktverbreiterungsfunktion des Abbildungssystems basiert. Das Ergebnis der Entfaltung ist hier dargestellt.Untersuchen Sie die Bilder, um die Intensitätsänderungen und Bewegungen der Plasmide während des Zellzyklus sowie die Verteilung der Plasmide auf Tochterzellen zu verfolgen. Diese computergenerierten Bilder, die mehrere Z-Ebenen enthalten, in denen die verschiedenen Signale lokalisiert sind, zeigen, dass die Kerne von HELOC-Zellen, die LAC eye TD Tomato exprimieren, aufgrund des Kernlokalisierungssignals am Fusionsprotein fluoreszieren und dadurch im Kern lokalisiert werden. In Abwesenheit von I-P-T-G-K-S-H-V-Genomen rekrutieren die LAC O-Sequenzen zahlreiche Kopien des fluoreszierenden Proteins und heben sich als helle Signale gegenüber der Hintergrundintensität des Kerns ab.Im Gegensatz dazu wird in Gegenwart von IPTG die Bindung der LAC-Augen-fluoreszierenden Proteine an ihre Erkennungssequenz lacO verhindert. Maximale Intensitätsprojektionen von Zack, die während eines Zellzyklus zu fünf Zeitpunkten aufgezeichnet wurden, sind in dieser Abbildung dargestellt. Die fluoreszenzmarkierten viralen Genome in der Zelle, sichtbar in Panel A, werden in Panel B gezeigt. Die viralen Genome werden anschließend bei der Zellteilung wie in Panel C, D und E beobachtet auf Tochterzellen verteilt. Der Zellzyklus gesunder HELOC-Zellen dauert etwa 24 Stunden, und Tochterzellen lagern sich typischerweise nahe beieinander an und teilen sich im nächsten Zellzyklus gleichzeitig. Mithilfe dieses Protokolls können die viralen Genome in der Zelle über mehrere Generationen hinweg verfolgt werden. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, die Zellmorphologie im Generationszeitraum zu überwachen, um sicherzustellen, dass die Zellen während des gesamten Experiments gesund bleiben.

monitoring-plasmid-replication-live-mammalian-cells-over-multiple

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Protokoll zeigt eine einfache Einzelmolekül-Fluoreszenz-Mikroskopie-Technik zur Visualisierung der DNA-Replikation von einzelnen replisomes in Echtzeit.

Visualizing Einzel-Molekül-DNA-Replikation mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Eine Methode, um Ubiquitin-Proteasom-Aktivität in lebenden Zellen zu überwachen beschrieben. A Degron-destabilisierten GFP-(GFP-DGN) und eine stabile GFP-dgnFS Fusionsprotein erzeugt und transduziert in die Zelle mit einem lentiviralen Expressionsvektor. Diese Technik ermöglicht eine stabile GFP-dgn/GFP-dgnFS exprimierenden Zelllinie, in dem Ubiquitin-Proteasom-Aktivität leicht beurteilt werden kann, mit Epifluoreszenz oder Durchflusszytometrie generieren.

Überwachung des Ubiquitin-Proteasom-Aktivität in lebenden Zellen unter Verwendung eines Degron (DGN)-destabilisiert Green Fluorescent Protein (GFP)-basierte Reporter Protein

FRET-basierten Reporter werden immer häufiger eingesetzt, um Kinase-und Phosphatase-Aktivitäten in lebenden Zellen zu überwachen. Hier beschreiben wir eine Methode auf, wie FRET-basierten Reporter nutzen, um den Zellzyklus-abhängige Veränderungen in Ziel-Phosphorylierung zu beurteilen.

Überwachung Kinase und Phosphatase-Aktivitäten durch den Zellzyklus durch Ratiometric FRET

Quantitative Live Cell Fluoreszenz-Mikroskopie Analyse von Fission Yeast

Wir beschreiben eine Live-Cell-Imaging-Verfahren, das einen Einblick in die Dynamik Protein während der T-Zell-Aktivierung. Wir zeigen die kombinierte Nutzung des T-Zell-Ausbreitung Assay, konfokale Mikroskopie und Bildanalyse zu liefern quantitative Ergebnisse zu folgen Signalisierung Komplexbildung während T-Zell-Aktivierung.

Echtzeit-Live-Imaging von T-Zell-Signaling Complex Formation

Diese Technik stellt ein Verfahren zu ernten, normalisieren und zu quantifizieren intrazellulären Wachstum bakterieller Pathogene, die in natürlichen Protozoon-Wirtszellen vorkultiviert vor Infektionen von Säugerzellen. Dieses Verfahren kann modifiziert werden, um eine große Vielzahl von Wirtszellen für das Priming Bühne sowie Zielzelltypen unterzubringen.

Gefügig Mammalian Cell Infektionen mit Protozoen-grundiert Bakterien

Ein auf lebenden Zellen basierendes Verfahren zur Beleuchtung von zellulären Vakuolen (Einschlüssen), die Chlamydien enthalten, wird beschrieben. Diese Strategie ermöglicht eine schnelle, automatisierte Bestimmung der Infektiosität von Chlamydien in Proben und kann zur quantitativen Untersuchung der Wachstumsdynamik des Einschlusses verwendet werden.

Verwendung Fluoreszierende Proteine, zu visualisieren und zu quantifizieren<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vakuole Wachstumsdynamik in lebenden Zellen

Studien von Biomolekülen in vivo sind entscheidend für das Verständnis der molekularen Funktion in einem biologischen Kontext. Hier beschreiben wir eine neuartige Methode, die es ermöglicht, fluoreszierende Biomoleküle, wie DNA oder Proteine, in lebende Mikroorganismen zu internalisieren. Die Analyse von in vivo-Daten, die durch Fluoreszenzmikroskopie aufgenommen wurden, wird ebenfalls vorgestellt und diskutiert.

Internalisierung und Beobachtung von Fluoreszenz Biomoleküle in lebenden Mikroorganismen durch Elektroporation

Hier beschreiben wir eine Hochdurchsatz-Fluoreszenz basierende Assays, die die Plasmamembran Wiederverschließen Effizienz durch fluorometrisch und bildgebende Untersuchungen in lebenden Zellen misst. Dieser Test kann verwendet werden, für das screening von Drogen oder Zielgene, die Plasmamembran Wiederverschließen in Säugetierzellen zu regulieren.

Hochdurchsatz-Messung der Plasmamembran Wiederverschließen Effizienz in Säugerzellen

Unser experimenteller Ansatz bietet eine Strategie, um Plasmid-Fülle und Antibiotikaresistenz im Laufe der Zeit in Bakterienpopulationen zu folgen.

Quantifizierung der Plasmid-vermittelten Antibiotikaresistenz in einem experimentellen Evolutionsansatz

Es wird ein zugänglicher, quelloffener mikrofluidischer Workflow für die parallelisierte Analyse der Plasmidretention in Bakterien vorgestellt. Durch den Einsatz von Fluoreszenzmikroskopie zur Quantifizierung des Plasmidvorhandenseins in einzelligen Mikrokolonien in Gel-Mikrotröpfchen bietet diese Methode eine präzise, zugängliche und skalierbare Alternative zur herkömmlichen Plattenzählung.

Plasmidstabilitätsanalyse mit Open-Source-Tröpfchen-Mikrofluidik

Lernen Sie die Fluoreszenz-Mikroskopie zur Beobachtung von Plasmid-Replikation in lebenden Säugerzellen über mehrere Generationen. Diese Methode ermöglicht die Verfolgung einzelner DNA-Moleküle in teilenden Zellen.

Überwachung Plasmid-Replikation in lebenden Säugerzellen über mehrere Generationen durch Fluoreszenz-Mikroskopie

Weitere Videos entdecken