Verfahren für Adaptive Labor Entwicklung von Mikroorganismen Mit einem Chemostat

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einem Mikroorganismus die Evolution unter Laborbedingungen zu ermöglichen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Mikrobiologie zu beantworten, wie beispielsweise Beziehungen der Nebennierenfunktion, Stressantworten, metabolische Ingenieurtechnik und natürlich die Evolution. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt in der kontinuierlichen Selektion des am besten angepassten Nachkommen unter bestimmten Laborbedingungen.

Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Vorbereitung der Ausrüstung sowie des initialen Mediums, des Stressmediums und des Hochstressmediums, wie im Textprotokoll beschrieben. Impfen Sie eine einzelne Kolonie oder einen Wildtyp von E. coli in ein 15-Milliliter-Reagenzglas, das vier Milliliter initiales Medium enthält. Inkubieren Sie das Reagenzglas 12 Stunden lang in einem schüttelnden Inkubator bei 37 Grad Celsius und 220 U/min.

Die Chemostatflasche unter Belüftung und Rühren bei 37 Grad Celsius sechs Stunden lang inkubieren. Nach der Inkubation das Ende des Silikonschlauchs der Pumpen aseptisch mit der Chemostatflasche verbinden. Ein Milliliter der Vorkultur aseptisch in die Chemostatflasche überführen.

Schalten Sie die Auslasspumpe ein und sammeln Sie die Kultur in der exponentiellen Phase. Überprüfen Sie die optische Dichte der Kultur aus der Auslassleitung bei 600 Nanometern. Schalten Sie dann die Einlasspumpe ein.

Überprüfen Sie alle 24 Stunden die optische Dichte der Kultur bei 600 Nanometern an der Auslassleitung. Nach 96 Stunden Betrieb des Chemostaten, was einer vollständigen Umschichtung von 9,6 entspricht, wechseln Sie das Reservoir auf das Medium mit der niedrigsten Konzentration bei hoher Belastung. Wenn Sie das Reservoir auf ein Medium mit höherer Belastung umstellen, können die Zellen einen Schock erleiden.

Wenn die Zelldichte zu niedrig ist, stellen Sie die Zufuhr des Mediums mit höherer Belastung für einige Zeit ein, um die Zelldichte wiederherzustellen. Wenn die optische Dichte unter 0,2 liegt, stellen Sie die Zulaufpumpe sechs Stunden lang ab. Starten Sie die Zulaufpumpe erneut und überprüfen Sie, ob die optische Dichte über 0,2 liegt.

Erhöhen Sie die Konzentration des Stressors schrittweise, indem Sie nacheinander auf ein Reservoir mit höherer Stressorkonzentration umsteigen. Entnehmen Sie Proben der angepassten Kultur, sobald diese einen Meilenstein der Stressoranpassung erreicht hat, und lagern Sie diese zur weiteren genomischen Analyse. Zum Probeneinsatz mischen Sie 0,5 Milliliter Kulturprobe mit 0,5 Milliliter einer sterilisierten 80 %igen Glycerinlösung und lagern Sie bei 80 Grad Celsius.

Bereiten Sie ein 1,6 %iges Agar-Plattenmedium vor, das den gleichen Stressor in derselben Konzentration wie im Medium enthält. Pipettieren Sie 0,1 Milliliter der Ausflusskultur aus dem Chemostaten auf die Platte und inkubieren Sie diese 16 Stunden bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation werden einzelne Kolonien mit einem sterilen Zahnstocher von der Platte entnommen und in 15-Milliliter-Reagenzgläser mit demselben Stressor und in derselben Mediumkonzentration wie im Chemostaten eingeseht.

Sechs Stunden inkubieren. Ein Milliliter der Kulturbrühe in einen 250-Milliliter-Erlenmeyerkolben mit 50 Milliliter Medium überführen. Jede Stunde 0,5 Milliliter der Kulturbrühe gewinnen und die optische Dichte bei 600 Nanometern messen.

Vergleichen Sie die Wachstumsrate des angepassten Stammes mit der des Wildtyp-Stammes unter Zugabe des Stressors. Der Wildtyp-Stamm von E.coli wurde über einen Zeitraum von 270 Tagen unter hohem Succinat-Stress kultiviert, was nahezu 930 Generationen entspricht. Wann immer ein höherer Succinat-Stress hinzugefügt wurde, sank die Biomassekonzentration unmittelbar und wurde anschließend wiederhergestellt.

Hier ist ein schematisches Diagramm des Chemostaten mit einem Mutanten, der gegenüber dem hohen Succinat-Stress tolerant ist. Die meisten Zellen vom Wildtyp werden unter den Stressbedingungen ausgewaschen, während der Mutant stärker wächst. Letztendlich nimmt die Population des mutierten Nachkommen zu.

Die zweite und dritte Mutation werden kontinuierlich selektiert und dominieren schließlich den Chemostaten. Diese Abbildung zeigt, dass der angepasste Stamm unter starkem Succinat-Stress ohne Verzögerung wuchs, während der Wildtyp-Stamm dies nicht tat. Eine ähnliche Strategie kann bei der adaptiven Laborevolution unter Verwendung eines Chemostaten mit variierenden Stressoren angewendet werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man das Mikroorganismus unter einer bestimmten Bedingung gewinnt und weiterentwickelt. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie innerhalb weniger Monate durchgeführt werden. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Zellen im Chemostaten nicht auszuwaschen, indem man zu viel Stress auf einmal hinzufügt, und daran, jeden Tag die optische Dichte zu überprüfen.

Nach Durchführung dieses Verfahrens können Methoden wie eine Genom- und Transkriptomanalyse durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise welche Mutation zur Entstehung der Stressresistenz beiträgt.