Verfahren für Adaptive Labor Entwicklung von Mikroorganismen Mit einem Chemostat

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Evolution eines Mikroorganismus unter Laborbedingungen zu ermöglichen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Mikrobiologie zu beantworten, wie z. B. Beziehungen zwischen Nebennierenfunktion, Stressreaktionen, Metabolic Engineering und natürlich die Evolution. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die kontinuierliche Selektion der am stärksten untersuchten Nachkommen unter bestimmten Laborbedingungen.

Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Vorbereitung der Ausrüstung sowie des anfänglichen mittleren, mittleren und hohen Stressmediums, wie im Textprotokoll beschrieben. Beimpfen Sie eine einzelne Kolonie oder einen Wildtyp von E. coli in einem 15-Milliliter-Reagenzglas mit vier Millilitern Ausgangsmedium. Inkubieren Sie das Reagenzglas in einem Schüttelinkubator für 12 Stunden bei 37 Grad Celsius und 220 U/min.

Inkubieren Sie das Chemostat-Glas für Belüftung und Rühren bei 37 Grad Celsius für sechs Stunden. Verbinden Sie nach der Inkubation das Ende des Silikonschlauchs von den Pumpen aseptisch mit dem Chemostat-Glas. Übertragen Sie einen Milliliter der Vorkultur aseptisch in das Chemostatglas.

Starten Sie die Auslasspumpe und sammeln Sie die Kultur in der exponentiellen Phase. Überprüfen Sie die optische Dichte bei 600 Nanometern der Kultur anhand des Auslassschlauchs. Starten Sie dann die Einlasspumpe.

Überprüfen Sie alle 24 Stunden die optische Dichte der Kultur in 600 Nanometern Entfernung vom Auslassschlauch. Nachdem Sie den Chemostat 96 Stunden lang betrieben haben, was einem vollen Umsatz von 9,6 entspricht, tauschen Sie das Reservoir gegen die niedrigste Konzentration des Mediums mit hoher Belastung aus. Wenn Sie das Reservoir gegen ein Medium mit höherer Belastung austauschen, können die Zellen einen Schock erleiden.

Wenn die Zelldichte zu niedrig ist, hören Sie für einige Zeit auf, das Medium mit höherem Stress zu füttern, um die Zelldichte wiederherzustellen. Wenn die optische Dichte kleiner als 0,2 ist, stoppen Sie die Einlasspumpe für sechs Stunden. Starten Sie die Einlasspumpe neu und prüfen Sie, ob die optische Dichte über 0,2 liegt.

Erhöhen Sie allmählich die Konzentration des Stressors, indem Sie schrittweise zu einem Reservoir mit einer höheren Stressorkonzentration wechseln. Entnahme von Proben der angepassten Kultur, wenn sie einen Meilenstein der Stressoranpassung erreicht, und Lagerung für weitere genomische Analysen. Mischen Sie für die Probenlagerung die 0,5-Milliliter-Kulturprobe mit 0,5 Millilitern einer sterilisierten 80%igen Glycerinlösung und lagern Sie sie bei 80 Grad Celsius.

Bereiten Sie ein Medium mit einer Platte von 1,6 % vor, das den gleichen Stressor in der gleichen Konzentration wie das Medium enthält. 0,1 Milliliter der Auslasskultur aus dem Chemostat abfüllen und 16 Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation werden einzelne Kolonien mit einem sterilen Zahnstocher aus der Platte entnommen und in 15-Milliliter-Reagenzgläser geimpft, die den gleichen Stressor und die gleiche mittlere Konzentration wie im Chemostaten enthalten.

Sechs Stunden lang inkubieren. Ein Milliliter der Kulturbrühe wird in einen 250-Milliliter-Erlenmeyerkolben mit 50 Millilitern Medium überführt. Ernten Sie stündlich 0,5 Milliliter der Kulturbrühe und messen Sie die optische Dichte bei 600 Nanometern.

Vergleichen Sie die Wachstumsrate des angepassten Stammes mit der des Wildtyp-Stammes unter Berücksichtigung des Stressors. Der Wildtyp-E.coli-Stamm wurde 270 Tage lang in einem hochsuccinatgestressten Zustand entwickelt, was fast 930 Generationen entspricht. Immer wenn eine höhere Succinatbelastung hinzugefügt wurde, wurde die Biomassekonzentration sofort gesenkt und dann wieder hergestellt.

Hier ist ein schematisches Diagramm des Chemostat mit einer Mutante dargestellt, die gegenüber dem hohen Succinatstress tolerant ist. Die meisten Wildtyp-Zellen werden unter den Stressbedingungen ausgewaschen und die Mutante wächst stärker. Schließlich wird die Population des mutierten Nachkommen erhöht.

Die zweite und dritte Mutation werden kontinuierlich für das Chemostatat selektiert und dominieren es schließlich. Diese Abbildung zeigt, dass der angepasste Stamm unter Bedingungen mit hohem Succinat-Stress ohne Verzögerung wuchs, während dies bei dem Wildtyp-Stamm nicht der Fall war. Eine ähnliche Strategie kann auf die adaptive Laborevolution angewendet werden, indem ein Chemostat mit einer Variation von Stressoren verwendet wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie den Mikroorganismus unter bestimmten Bedingungen erwerben und weiterentwickeln können. Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie in ein paar Monaten durchgeführt werden. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Chemostatzellen nicht auszuwaschen, indem Sie zu viel Stress auf einmal hinzufügen, und daran zu denken, die optische Dichte jeden Tag zu überprüfen.

Im Anschluss an dieses Verfahren können Methoden wie eine Genomanalyse und eine Transkriptomanalyse durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. welche Mutation trägt zur stresstoleranten Evolution bei?