High-Throughput und umfassende Droge-Überwachung mittels Massenspektrometrie Multisegment-Injektion-Kapillar-Elektrophorese

Hier beschreiben wir eine Hochdurchsatz-Verfahren zur umfassenden Droge-Überwachung, die für die verbesserte Auflösung und Erkennung von großen Platten von Medikamenten, Missbrauch und deren Metabolite mit Qualitätskontrolle auf multisegment-Injektion-Kapillare ermöglicht Elektrophorese-Massenspektrometrie.

Aktuelle Strategien für ein Urin-Drogen-Screening sind teuer für die routinemäßige Analyse von immer größeren Panels von Missbrauchsmedikamenten durchzuführen, wie es für Arbeitsplatztests erforderlich ist, sowie für therapeutische Drogenüberwachungsanwendungen. Darüber hinaus sind Methoden, die auf Amino-Assays basieren, anfällig für Verzerrungen und sind letztlich auf die Zielanalyse bekannter Arzneimittelpanels beschränkt. Der Hauptvorteil unserer Methode, die als MSI-CE-MS bezeichnet wird, ist, dass sie das schnelle Screening eines unbegrenzten Medikamentenpanels und ihrer Metaboliten mit hoher Genauigkeit und minimalem Probenaufbau ermöglicht.

Es besteht ein dringender Bedarf an einem hohen Durchsatz und erschwinglichen Screening-Methode, um die Patientenergebnisse zu verbessern, indem die Einhaltung bestätigt und die Dosierungssysteme für Medikamente optimiert werden, während illegaler Drogenkonsum aufgedeckt wird. Diese Multiplex-Trennplattform kann auf eine Vielzahl anderer Forschungsbereiche angewendet werden, die sich auf gezielte oder nicht zielgerichtete Metabolitenprofile in komplexen biologischen Proben beziehen. Beginnen Sie mit dem Auftauen de-identifizierten morgendlichen Urinproben von Patienten mit einem bekannten verschreibungspflichtigen Medikament Geschichte für minus 80 Grad Celsius Lagerung auf Eis und Wirbel nusdien die aufgetauten Proben für 30 Sekunden.

Als nächstes die Proben durch Zentrifugation zu sedimentieren und drei 10 Mikroliter Aliquots jeder Probe mit 10 Mikroliteren deuterated internal standards, fünf Mikroliter eines 4-Fluor-L-Phenylalanins und 3-Chlor-L-Tyrosin-Lösung und 25 Mikroliter entionisiertes Wasser zu kombinieren. Zentrifugieren Sie dann die Mischungen für eine Minute und übertragen Sie 20 Mikroliter jeder Probe in einzelne Polypropylen-Fläschchen. Um die unbeschichteten Kopillarkonditionierungsparameter für geschmolzene Kieselsäure-Kapillare einzustellen, schneiden Sie eine 135 Zentimeter lange, 50 Mikrometer Innendurchmesser und 360 Mikrometer Außendurchmesser Kapillare aus einer Spule.

Verwenden Sie einen Kapillarfenstermacher, um etwa 7 Millimeter Polyamidbeschichtung von beiden Enden jeder Kapillare zu entfernen. Als nächstes installieren Sie die Kapillareinlässe in die Kapillarelektrophorese oder CE-Patrone, indem Sie jede Kapillare für zwei 360-Grad-Drehungen schleifen und dabei darauf achten, etwa zwei Millimeter der Kapillarauslässe aus der CE-Sprühnadel herauszuragen. Wenn alle Kapillaren installiert sind, laden Sie die CE-Patrone vorsichtig in das CE-System und lagern Sie den CE-Sprüher aus der Ionenquelle.

Legen Sie die Flüssigkeitschromatographie oder LC-Sprüher in die Ionenquelle und wählen Sie Bündig in der Systemsoftware aus, um die Kapillarkonditionierung einzurichten. Stellen Sie die Dauer von Methanol, einem mollaren Natriumhydroxid, entionisiertem Wasser und Hintergrundelektrolytspülung auf 30 Minuten pro Spülung ein und legen Sie die isotrattische Pumpe während der kapillaren Konditionierungsphase in den Standby-Zustand. Reinigen Sie nach der letzten Spülung das Kapillarelektrophorese-Massenspektrometer oder CE-MS-Sprühgerät und die CE-Elektrode mit methanolgetränkten Tüchern.

Reinigen Sie die CE-MS-Schnittstelle mit einer Eins-zu-Eins-Isopropanol-Wasserlösung, um Restsalzablagerungen zu entfernen. Ersetzen Sie den LC-Sprüher durch den gereinigten CE-MS-Sprüher und eine neu konditionierte Kapillare in die koaxiale Mantelflüssigkeitsschnittstelle. Schalten Sie dann die isotratische Pumpe ein und wenden Sie eine Spannung von 30 Kilovolt für 15 Minuten an, um sicherzustellen, dass vor der Urinanalyse ein stabiles CE-Stromprofil erreicht wird.

Wählen Sie in der Systemsoftware die Vorbedingung aus, stellen Sie die Leerung auf 600 Sekunden ein, und geben Sie eine Position der Hintergrundelektrolytdatei an. Stellen Sie die Injektion ein, um die Proben fünf Sekunden lang hydrodynamisch auf 100 Millibar zu injizieren und die Elektrolyt-Abstandshalter im Hintergrund für 75 Sekunden mit 30 Kilovolt elektrokinetisch zu injizieren. Stellen Sie die angelegte Spannung auf 30 Kilovolt, die Patronentemperatur auf 25 Grad Celsius und die Gesamtlaufzeit auf 40 Minuten ein.

Wenden Sie dann nach dem Zeitplan während der Trennung einen Druckgradienten von zwei Millibar pro Minute von null bis 40 Minuten an. Wenn die Probenaufnahme abgeschlossen ist, spülen Sie die Kapillare mit 50 Millibar Druck mit den Hintergrundelektrolyten über Nacht, während sich die Kapillare im CE-Sprühgerät in der Ionenquelle befindet. Legen Sie die TOF-MS-Positivionenerkennung so fest, dass sie ein Massen-Zu-Lade-Verhältnis von 50 bis 1 700 mit einer Datenerfassungsrate von 500 Millisekunden pro Spektrum umfasst, und bestätigen Sie, dass sowohl das Profil als auch die Schwerpunktdaten im D-Dateiformat gespeichert sind.

Stellen Sie die Elektrospray-Ionisationsbedingungen auf Kapillare und Düsenspannungen von jeweils 2000 Volt, das Verneblergas auf 10 Pfund pro Quadratzoll und die Trocknungsgaszufuhr auf acht Liter pro Minute bei 300 Grad Celsius bei einem Mantelgasstrom von 3,5 Litern pro Minute bei 195 Grad Celsius während der Erfassung. Stellen Sie dann die MS-Spannungseinstellungen des Fragmenters, Skimmers und Octapols eine Hochfrequenz auf 120, 65 und 750 Volt, und legen Sie die Gerätesteuerungs- und Datenerfassungsparameter entsprechend dem Design des Experiments fest. Öffnen Sie zur Datenanalyse die multisegmentierenden CE-MS-Daten in der Systemsoftware.

Legen Sie unter Chromatogramme die Extraktionsdaten und die Chromatogramm- und Massenspektraldatenformate in den Profilmodus. Wählen Sie unter Glättung quadratischekubische Savitzky-Golay aus und stellen Sie die Funktionsbreite auf 15 Punkte ein. Klicken Sie dann auf MS integrieren, und legen Sie den Integrator auf agil fest.

Legen Sie unter Spitzenfiltern die maximale Anzahl von Spitzen auf 11 fest. Klicken Sie in der Ansicht auf Integrationsspitzenliste, und wählen Sie Spitzenzahl, Aufbewahrungszeit, Spitzenfläche, Spitzenhöhe und Signal-Rausch-Verhältnis aus. Speichern Sie dann die Parameter unter einem eindeutigen Methodennamen, und wenden Sie die Methode für die Interpretation jedes Datensatzes auf den Prozess an.

In dieser repräsentativen Analyse verschiedener isobareric isomerischer Missbrauchsmedikamente und ihrer Metaboliten wurden 30 gelöste Spitzen aus 10 unabhängigen Proben einer Arzneimittelmischung ohne Probenübertragung nachgewiesen. Zwei weitere isobarische Opioide könnten als 20 verschiedene Spitzen mit der vollständigen Scan-Datenerfassung vollständig aufgelöst werden. In ähnlicher Weise wurden zwei Amphetamin-Positions-Isomere in dieser multisegmentierten CE-MS-Analyse vollständig gelöst, um illegalen Methamphetamin-Missbrauch vom potenziellen Missbrauch von Phentermine zu unterscheiden, einem vorgeschriebenen Stimulans, das als Appetitzügler zur Gewichtsabnahme verwendet wird.

In dieser repräsentativen Arzneimittel-Screening-Analyse wurde ein positives Screening-Testergebnis für Methadon durch den Nachweis eines großen Signalspitzen abgeleitet, der mit dem Methadon-d3-Peak mit einem geringen Massenfehler kodukiert. In anderen Urinproben innerhalb desselben Laufs wurden keine anderen Signale nachgewiesen, und die nachgewiesene Methadonkonzentration überstieg das 13-fache des empfohlenen Grenzwerts im Vergleich zu dem gemessenen Ionenansprechverhältnis in der Probe und wurde durch einen vierfachen Urinverdünnungsfaktor korrigiert, was die Einhaltung der Methadon-Erhaltungstherapie durch die Patienten bestätigte. Hierbei wurde eine serielle Injektionskonfiguration in Multisegment CE-MS, bestehend aus fünf verschiedenen Wirkstoffkalibrazianten, in einem einzigen Durchlauf zusammen mit dem synthetischen Urinrohling doppelt analysiert.

Die Wirkstoffmetaboliten wurden als ihre potenierten molekularen Ionen über ihre Screening-Grenzwerte nachgewiesen. Nach diesem Verfahren kann eine große Anzahl von polaren und ionischen Metaboliten im Urin auch von MSI CMS zur Unterstützung der auf Entdeckungen basierenden Stoffwechselforschung analysiert werden. Darüber hinaus kann eine umfassende Überwachung einer breiten Palette von exogenen Drogen und deren Metaboliten erreicht werden, einschließlich nicht verordneter Medikamente und illegaler Drogen, die anfällig für Missbrauch sind.

Diese optimierte Methode kann auch verwendet werden, um routinemäßig andere Drogen des Missbrauchs zu überprüfen. Dies können Cannabis- oder Alkoholmetaboliten sein und unsere Methode kann auch zwischen einer synthetischen oder gefälschten Urinmatrix und einer natürlichen, echten, authentisch gespendeten Urinprobe unterscheiden. Denken Sie daran, bei der Arbeit mit biologischen Flüssigkeiten immer Vorsicht walten zu lassen.