Name: Visualisierung und Quantifizierung der zellfreien Schicht in Arteriolen der Ratte Cremaster Muscle (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Lernen Sie die Visualisierung und Quantifizierung der zellfreien Schicht in Arteriolen der Ratte Cremaster Muscle. Diese Methode ermöglicht präzise Messungen der Mikrohämodynamik in vivo.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch den National Medical Research Council (NMRC)/Cooperative Basic Research Grant (CBRG)/0078/2014.

Diese Studie ist in Übereinstimmung mit der National University of Singapore Institutional Animal Care und Use Committee (genehmigten Protokoll Nr. R15-0225). 1. Chirurgische Vorbereitung des Tiermodells <ol><li> Vessel Kanülierungen <ol><li> Anästhesieren eine männliche Sprague-Dawley-Ratten (6 bis 7 Wochen alt) mit einem Gewicht von (203 ± 20) g mit Ketamin (37,5 mg / ml) und Xylazin (5 mg / ml) Cocktail durch intraperitoneale (ip) Injektion (2 ml / kg) . Nicht an die Nadel rekapitulieren oder aus der Spritze nach der Injektion entfernen. </li><li> Sobald das Tier (bestätigt durch Zeh kneifen) anästhesiert wurde, legen Sie es auf einem Heizkissen auf seine Körpertemperatur auf 37 ° C halten. rasieren das Haar sanft auf den Schulterblättern, vorderen Gebärmutterhals, Unterbauch, medialen Hinterbein und Hodensack. zurückhalten Sie vorsichtig die Beine Papierklebebändern verwendet wird. </li><li> Führen Sie alle chirurgischen Eingriffe microdissection Schere und Pinzette abgewinkelt, während Sie durchein Stereomikroskop. Legen Sie alle scharfen chirurgischen Werkzeuge auf einem stichfesten Tablett Verletzung während der Operation zu verhindern. </li><li> Schrubben Sie alle Operationsstellen 3-mal mit wechselnden Jod und 70% Alkohol, bevor der Schnitt durchgeführt wird. Spülen Sie alle Katheter mit 30 IU / ml Heparin-Kochsalzlösung. </li><li> Machen Sie mit 1 - 1,5 cm Mittellinie Hautschnitt auf den Schulterblättern ein Paar chirurgische Scheren über die rechte Halsvene verwenden. Trennen Sie die Blende durch stumpfe Dissektion die Halsvene zu entlarven und kanülieren es mit einem Polyethylenrohr (PE-50), gefüllt mit Heparin-Kochsalzlösung unter Verwendung von 5-0 Seidennähten. Infundieren zusätzliche Anästhesie bei Bedarf (1/3 bis 1/2 der Anfangsdosierung, intravenös (iv)), im Verlauf der Operation und Experiment. </li><li> Führen Sie Tracheotomie Atemwegsdurchgängigkeit zu halten. Machen Sie mit 1 - 1,5 cm Schnitt im vorderen Halsbereich. Kanülieren die Trachea ein Polyethylenrohr (PE-205) mit 2-0 Seidenfäden mit dem Katheter an Ort und Stelle zu sichern. </li><li> Überwachen Sie den Blutdruckdurch Kanülierung in der Arteria femoralis. Machen Sie mit 1 - 1,5 cm Schnitt an der linken medialen Oberfläche des Hinterbein. Trennen Sie die Oberschenkelarterie durch stumpfe Präparation. Kanülieren die Femoralarterie mit einem Polyethylenschlauch (PE-10), gefüllt mit Heparin-Salzlösung 5-0 Seidennähten verwendet wird. </li></ol></li><li> Cremaster Muscle Vorbereitung und Strömungsvisualisierung <ol><li> Legen Sie eine 5-0-Seidenfaden durch die Spitze des Hodensack, sie zu verlängern. Einen Einschnitt entlang der ventralen Oberfläche des Hodensack. gelten regelmäßig Warm isotonischen Lösung (37 ° C; pH 7,4) mit dem freiliegenden Muskel. </li><li> Entfernen Sie umgebende Bindegewebe sorgfältig und gründlich mit einem Wattestäbchen auftragen. </li><li> Legen Sie eine 5-0-Seidenfaden durch die Spitze des M. cremaster. Schneiden Sie die Naht in zwei Stücke von gleicher Länge und einen Knoten auf jeder Seite zu binden. Schneiden Sie den Muskel zwischen den beiden Knoten und dehnen sie auf eine maßgeschneiderte transparente Plexiglas-Plattform, indem Sie vorsichtig die Naht ziehen. Fixdas Ende des Fadens auf die Plattform mit blauem tack. HINWEIS: Eine gründliche Entfernung von Bindegewebe umgeben ist von entscheidender Bedeutung bei der Beschaffung von optimalen Bildkontrast. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 1.2.3 bis 5 bis 6 Fixierungen vorgenommen werden. die Cremaster Muskel aus dem Nebenhoden mit hoher Temperatur Kauter vorsichtig entfernen. Superfuse warme isotonischen Lösung mit dem freiliegenden Muskel Dehydratisierung des Gewebes zu verhindern. <ol><li> Umgeben den Cremaster Muskel mit gefalteten Stücke aus Gaze. Decken Sie die freiliegenden Muskel mit einem Polyvinylfilm. Die Gaze Stück mit dem Film bilden ein flaches Becken warme isotonischen Lösung für die Wassereintmikroskopobjektiv (1A) zu halten. </li></ol></li><li> Übertragen Sie das Tier auf die Tierstufe eines intravital Mikroskop (Abbildung 1C). Schließen Sie den arteriellen Kanülierung auf einen physiologischen Daten-Erfassungssystem für die kontinuierliche Drucküberwachung (Abbildung 1E). </li><li> Pflegen Sie den Muskel temperature bei 35 ° C mit einem Heizelement unterhalb der Tier Plattform (1B) angebracht ist . Legen Sie eine Temperatursonde neben dem Muskel negative Rückkopplung zu den Leistungsregler des Heizelementes (1D) zur Verfügung zu stellen. </li><li> Verlassen das Tier auf der Bühne für 15 min mit der Umgebung zu äquilibrieren. </li><li> Visualisieren Blutfluss unter einem intravital Mikroskop mit einem 40x Wasser Immersionsobjektiv und einem langen Arbeitstag Kondensator. </li><li> Wählen Sie einen unverzweigten arteriole (&lt;60 &amp; mgr; m) auf der Grundlage einer klaren Bildschärfe und Kontrast zwischen der RBC-Kern, CFL und Gefäßwänden, um das Mikroskop auf der diametralen Ebene des Blutgefäßes zu konzentrieren. Drehen Sie die Kamera auf das Mikroskop angebracht vertikal, um die Gefäßwand auszurichten. </li><li> Aufzeichnen der Blutfluss unter Verwendung eines Hochgeschwindigkeits-Videokamera mit einer Bildrate von 3000 / sec für 1 sec. Speichern Sie das aufgenommene Video als unkomprimiertes 8-Bit-Graustufen-AVI-Format die Bildqualität zu erhalten. HINWEIS:<html> Eine minimale Aufzeichnungsbildrate von 3000 Bildern / sec wird empfohlen, um sicherzustellen, dass die CFL Messung mindestens einmal pro RBC unter Strömungsbedingungen physiologischen arteriolar durchgeführt werden kann. </li><li> Verwenden, um ein Blaufilter mit einer Spitzendurchlässigkeit bei einer Wellenlänge von 394 nm und der spektralen Bandpass bei 310 bis 510 nm den Kontrast zwischen den RBCs und Plasma zu verbessern. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Lichtspektrum von der mikroskopischen Lichtquelle durch den blauen Filter passiert (100 W-Halogenlampe) mit niedriger Lichtintensität ist eine mögliche Gewebeschäden zu verhindern. </li><li> Am Ende des Experiments euthanize das Tier mit einer Überdosis Pentobarbital-Natrium. </li></ol></li></ol> 2. Bildanalyse <ol><li> Vorverarbeitung für die Messung CFL Breite <ol><li> Öffnen Sie MATLAB und führen Sie die &#39;CFL_pre.m&#39; Datei. (Diese und andere MATLAB-Dateien können im Verzeichnisip &quot;&gt; Supplemental MATLAB - Archiv.) </li><li> Klicken Sie auf &quot;Datei öffnen&quot;, um die Videodatei auszuwählen zu analysieren. </li><li> Stellen Sie die &quot;Rotation&quot; Schieber die Gefäßwände vertikal auszurichten. HINWEIS: Die Anwender können durch die Auswahl der &quot;Grid On &#39;Radio-Button, und stellen Sie die Zoomstufe des Bildes durch Verschieben des&quot; Zoom &quot;Schieber, um die Unterstützung der Gitterlinien für das Schiff Ausrichtung anzuzeigen. </li><li> Klicken Sie auf die &quot;Eingabe bestätigen&quot;, um die Gefäß Ausrichtung zu bestätigen. </li><li> Klicken Sie auf die &#39;Set-ROI Ernte &quot;, um die Region von Interesse (ROI) zu definieren. Das ausgerichtete Bild wird in einem Popup-Fenster angezeigt werden. Stellen Sie den rechteckigen Ziel auf das Bild, und klicken Sie doppelt auf den ROI zu bestätigen. Überspringen Sie diesen Schritt, wenn das Zuschneiden des Bildes ist nicht erforderlich. HINWEIS: Nur umfassen ein einziges Schiff in der ROI der CFL Breite aus dem Behälter zu analysieren. Klicken Sie auf die &quot;Bild zurücksetzen&quot;, um das Bild in seiner ursprünglichen Form wieder herzustellen, falls erforderlich. </li><li> Drücke den9; Extrahieren von Bildern &quot;, um alle bearbeiteten Video-Frames in aufeinanderfolgende Bitmap-Bildern zu extrahieren (8-Bit-Graustufen &#39;bmp&#39; Format). Die extrahierten Bilder können in den Ordner mit dem gleichen Namen wie die ausgewählte Videodatei zu finden. </li></ol></li><li> Die Messung der CFL Breite <ol><li> Öffnen Sie MATLAB und führen Sie die &#39;CFL_measure.m&#39; Datei. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Ordner auswählen&quot; den Ordner auszuwählen, die extrahierten Bilder enthält. </li><li> Klicken Sie auf den Ordner, um die Bilder und klicken Sie auf &quot;Ordner auswählen&quot; enthält. Der erste Bildrahmen in dem Ordner werden in der &quot;Graustufenbild&quot; Platte, zusammen mit seiner grauen Intensität Histogramm in der &quot;Bild-Histogramm&quot; Platte geladen und angezeigt werden. </li><li> Wählen Sie die gewünschte Bildrahmen aus dem Listenfeld die Analyse durchzuführen, andernfalls wird der erste Bildrahmen ausgewählt. </li><li> Klicken Sie auf &#39;Suchen Gefäßwände&#39; die innere Gefäßwand in dem Bild zu identifizieren, die an der Stelle bestimmt, wo dieLichtintensitätsprofil Spitzen Transite von dunkel über zwei Pixel zu beleuchten. </li><li> Prüfen &quot;Median-Filter &#39;ein Medianfilter auf das Bild anzuwenden, um das&quot; Salz und Pfeffer &quot;Lärm zu reduzieren. </li><li> Prüfen &quot;Auto-Kontrast&quot;, um die Bildintensitäten anzupassen digital den Bildkontrast zu erhöhen. </li><li> Wählen Sie eine Schwellwertbildung Algorithmus in der Liste, die automatisch eine Schwellenwert bestimmt (τ), die die Graustufen in zwei Klassen unterteilt - weiße Pixel mit Graustufen über τ (CFL) und schwarze Pixel mit Graustufen unter τ (RBC-Kern). HINWEIS: Als alternatives Verfahren, verwenden Sie die manuelle Schwellwertbildung, wenn keiner der automatisierten-Thresholding-Algorithmus ein entsprechendes Bild Thresholding zur Verfügung stellt. Klicken Sie auf das &quot;Manual&quot; Radio-Button und stellen Sie den Regler, um die manuelle Schwellenwert zu definieren. </li><li> Um die räumliche Variation der CFL Breiten messen, geben Sie die Pixelauflösung in der &quot;Pixel-Auflösung &#39;Box (die AuflösungMit diesem Versuchsaufbau betrug 0,42 &amp; mgr; m / Pixel). </li><li> Klicken Sie auf den &quot;Berechnen&quot;, um die räumliche Variation der CFL Breiten zu erhalten. Klicken Sie auf &quot;Export CSV&quot; die CFL Breitendaten in Tabellenformat zu exportieren. </li><li> Um die zeitliche Variation der CFL Breiten messen bei einer bestimmten Analyse Linie entlang des Gefäßes, klicken Sie auf den &quot;Temporal Variation&quot; Radio-Button und geben Sie die Frame-Rate-Informationen (die Framerate in diesem Versuchsaufbau verwendet wurde, war 3000 Frames / sec). </li><li> Geben Sie den ersten Frame und letzten Frame der Bilder für die Analyse in den &quot;Start Frame &#39;und&#39; Last Frame &#39;Boxen sind. </li><li> Wählen Sie die Position der Analyse Linie entlang des Gefäßes durch die &quot;Analyse Line &#39;Gleitschiene gleitet. Bestätigen Sie die Position der Analyse-Linie, die sowohl auf der &quot;Graustufenbild&quot; dargestellt ist und &#39;Binary Bild&#39;. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Berechnen&quot; die zeitliche Variation der CFL Breiten zu erhalten. click &quot;Export CSV&quot; die CFL Breitendaten in Tabellenformat zu exportieren. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Die Messung der CFL Breite ist für ein besseres Verständnis der Hämodynamik in der Mikrozirkulation wesentlich. Insbesondere wurde die Messung der CFL Breiten in mesenterischen 6 durchgeführt wurde, spinotrapezius 24 und cerebral 25 microcirculations. Herkömmliche Messung der in vivo CFL Breiten wurde durch manuelle Inspektion der aufgezeichneten Video - Frames Schätzungen beschränkt. Die manuelle Messungen erforderlich , um die Mittelung von mehreren aufeinanderfolgenden Videob...

In vivo Tierversuche sind entscheidend für die Grundlagenforschung zum Verständnis der menschlichen Physiologie und Pathologie. Insbesondere können mikrohämodynamische In-vivo-Studien die mögliche Beeinträchtigung der Mikrozirkulationsfunktionen aufklären, die durch abnormale rheologische Bedingungen des Blutes verändert werden. In einer Reihe früherer mikrohämodynamischer Studien1 wurde das Cremaster-Muskelmodell der Ratte zur Visualisierung des mikrovaskulären Blutflusses verwendet. Der Cremaster-Muskel ist eine dünne Schicht quergestreifter Muskeln, die die Hoden umgibt. So kann der Blutfluss im Muskel mit einem Durchlichtmikroskop mittels chirurgischer Belichtung sichtbar gemacht werden. Dies ermöglicht es uns, die in vivo Blutflussbilder ohne den Einsatz von Fluoreszenz- oder Kontrastmitteln zu erfassen. Darüber hinaus kann die gesamte Durchblutung des Muskelnetzes gesteuert werden, indem bei einem Bauchaortenverschluss der vorgelagerte Blutflussreduziert wird 2. Aufgrund dieser Vorteile wurde das Cremaster-Muskelmodell häufig verwendet, um die Bildung der zellfreien Schicht (CFL) in Mikrogefäßenzu untersuchen 1,3. 
Die CFL-Breite ist ein wichtiger hämodynamischer Parameter in der Mikrozirkulation, der aufgrund seiner wichtigen Rolle bei der Regulierung der Mikrozirkulationsfunktionen von großem Interesse ist. Die CFL wird durch die scherinduzierte transversale Einwanderung der roten Blutkörperchen (RBCs) in Richtung des Flusszentrumsgebildet 4. Folglich führt diese Migration zu einem Abbau der Erythrozyten in der Nähe der Gefäßwände, was schließlich zu einer zellfreien Plasmaschicht führt. Dementsprechend wird die parietale CFL auf natürliche Weise zu einer Diffusionsbarriere für die Abgabe von Sauerstoff (O2) aus dem Erythrozytenkern an das Gewebe und für das Abfangen von Stickstoffmonoxid (NO) durch die Erythrozyten5,6. Darüber hinaus kann die Produktion von NO auch durch die dynamischen Schwankungen der CFL-Breite7,8 moduliert werden. Daher muss die Rolle der CFL sowohl beim Gastransport als auch bei der Regulation der Homöostase in der Mikrozirkulation vollständig geklärt werden, um den Blutfluss in der Mikrozirkulation besser zu verstehen. Neuere Studien haben sich auf die Überbrückung der Hämodynamik und der Gastransportfunktionen des CFL in der Mikrozirkulation9-12 konzentriert. Darüber hinaus wurde in einer separaten Reihe von Studien untersucht, wie die pathologische Erhöhung der Erythrozytenaggregation die CFL-Bildung moduliert und wie sie sich auf die Bioverfügbarkeit von O2 und NO in Geweben auswirkt13,14. 
Die Rolle der CFL wird in der Mikrozirkulation wichtiger, wo die relative Größe der CFL-Breite zum Gefäßdurchmesser im Vordergrund steht. Dies erfordert einen effektiven Ansatz zur Quantifizierung der CFL im in vivo Blutfluss. Insbesondere die Bildaufnahme und die Bildanalyse sind die beiden Schlüsselkomponenten, die die Genauigkeit der CFL-Breitenmessung bestimmen. Einer erfolgreichen Visualisierung des Gewebeblutflusses sollte eine geeignete chirurgische Präparation des Tiermodells vorausgehen. Darüber hinaus ist eine geeignete Bildanalysetechnik erforderlich, um die Einschränkungen herkömmlicher manueller Messungen zu überwinden, die meist durch menschliche Fehler verursacht werden15,16. Mit Fortschritten bei optischen Instrumenten und Rechenleistung für die digitale Bildverarbeitung ist es jetzt möglich, eine genauere und konsistentere Messung derCFL-Breite 17-19 zu erreichen. Nichtsdestotrotz hängt die Genauigkeit dieser Messungen, da sie bildbasiert sind, letztendlich immer noch von der Qualität der Bilder ab.
Daher untersucht diese Studie die Faktoren, die die Messung der in vivo CFL-Breite beeinflussen. Wir konzentrierten uns insbesondere auf die Demonstration der chirurgischen Vorbereitung und der digitalen Bildanalyse für Messungen der CFL-Breite in Arteriolen des Cremaster-Muskels der Ratte.

<table><tbody><tr><td>Intravitalmikroskop</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td>Ausrüstung</td></tr><tr><td>Hochgeschwindigkeitskamera</td><td>Photron</td><td>1024PCI</td><td>Ausrüstung</td></tr><tr><td>Blaufilter</td><td>HOYA</td><td>B390</td><td>Ausrüstung</td></tr><tr><td>Drucksensor & Biopac-System</td><td>Biopac-System TSD104A</td><td>, MP100</td><td>Ausrüstung</td></tr><tr><td>Temperaturregler</td><td>Shimaden</td><td>SR 1</td><td>Ausrüstung</td></tr><tr><td>Plasma Lyte A</td><td>Baxter</td><td>NDC:0338-0221</td><td>Warm in 37 > C Wasserbad vor Gebrauch</td></tr><tr><td>Kochsalzlösung 0,9%</td><td>Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heparin (5.000 I.E./ml)</td><td>LEO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE-10 Polyethylen Tube</td><td>Becton Dickinson</td><td>427400.024</td><td>" OD x .011" ID&nbsp;</td></tr><tr><td>PE-50 Polyethylen-Schlauch</td><td>Becton Dickinson</td><td></td> <td>427411.038" OD x .023" ID</td></tr><tr><td>PE-205 Polyethylen-Schlauch</td><td>Becton Dickinson</td><td></td> <td>427446.082" OD x .062" ID</td></tr><tr><td>2-0 nicht resorbierbares Seidennaht</td><td>Deknatel</td><td>113-S</td><td></td></tr><tr><td>5-0 nicht resorbierbares Seidennaht</td><td>Deknatel</td><td>106-S</td> Wasserzirkulierendes Heizkissen <td></td></tr><tr><td></td><td>Gaymar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>Fisher Scientific</td><td>Isotemp 205</td><td>Ausrüstung</td></tr><tr><td>Sterile Baumwollgaze&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-415-468</td><td></td></tr><tr><td>Applikatoren mit Wattespitze</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-124</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Pinzetten</td><td>Kent Scientific</td><td>INS14188</td><td>Chirurgisches Instrument</td></tr><tr><td>Mikrodisparierzange</td><td>Kent Scientific</td><td>INS15915</td><td>Chirurgisches Instrument</td></tr><tr><td>Iriszange 1 x 2 Zähne</td><td>Kent Scientific</td><td>INS15917</td><td>Surgical Instrument</td></tr><tr><td>Kanülenzange</td><td>Kent Scientific</td><td>INS500377</td><td>Chirurgisches Instrument</td></tr><tr><td>Mikroschere</td><td>Kent Scientific</td><td>INS14177</td><td>Chirurgisches Instrument</td></tr><tr><td>Irisschere</td><td>Kent Scientific</td><td>INS14225</td><td>Chirurgisches Instrument</td></tr><tr><td>Gefäßclip</td><td>Kent Scientific</td><td>INS14120</td><td>Chirurgisches Instrument</td></tr><tr><td>Gemini Kautersystem</td><td>Braintree Scientific</td><td>GEM 5917</td><td>Chirurgisches Instrument</td></tr></tbody></table>

visualisierung und quantifizierung der zellfreien schicht in arteriolen der ratte cremaster muscle

Visualization and Quantification of the Cell-free Layer in Arterioles of the Rat Cremaster Muscle

Die zellfreie Schicht ist definiert als die parietale Plasmaschicht in der Mikrogefäßströmung, die frei von roten Blutkörperchen ist. Die Messung der in vivo zellfreien Schichtbreite und ihrer räumlich-zeitlichen Variationen kann ein umfassendes Verständnis der Hämodynamik in der Mikrozirkulation liefern. In dieser Studie verwendeten wir ein intravitales mikroskopisches System, gekoppelt mit einer Hochgeschwindigkeits-Videokamera, um die zellfreien Schichtbreiten in Arteriolen in vivo zu quantifizieren. Der Cremaster-Muskel von Sprague-Dawley-Ratten wurde chirurgisch exteriorisiert, um den Blutfluss sichtbar zu machen. Außerdem wurde ein eigens entwickeltes Bildgebungsskript entwickelt, um die Bildverarbeitung und Analyse der zellfreien Schichtbreite zu automatisieren. Dieser Ansatz ermöglicht die Quantifizierung raumzeitlicher Variationen konsistenter als bisherige manuelle Messungen. Die Genauigkeit der Messung hängt jedoch zum Teil von der Verwendung eines Blaufilters und der Auswahl eines geeigneten Schwellenwertalgorithmus ab. Insbesondere bewerteten wir den Kontrast und die Qualität von Bildern, die mit und ohne Verwendung eines Blaufilters aufgenommen wurden. Darüber hinaus haben wir fünf verschiedene Bildhistogramm-basierte Schwellenwertalgorithmen (Otsu, Minimum, Intermode, iterative Auswahl und fuzzy entropic thresholding) verglichen und die Unterschiede bei der Bestimmung der zellfreien Schichtbreite veranschaulicht.

Die Visualisierung der CFL in vivo ist weitgehend abhängig von den chirurgischen Vorbereitungen des Tieres. Übermäßige Blutverlust oder längere Operationsdauer kann das Tier auch keinen Erschütterungen und den Blutfluss Verirrungen. Aufrechterhaltung der Gewebetemperatur ein Heizkissen sowie eine angepasste Plattform während der Operation und Experiment unter Verwendung ist auch entscheidend die physiologischen Bedingungen der Ratte zu halten. Unter Verwendung einer 100-W-Halogenlampe im Mikroskopsystem, keine ...

Diese Studie demonstriert die chirurgische Vorbereitung des Cremaster-Muskels der Ratte für die Visualisierung der in vivo zellfreien Schicht. In dieser Studie werden wesentliche Faktoren diskutiert, die die Genauigkeit der zellfreien Schichtbreitenmessung beeinflussen.

Visualisierung und Quantifizierung der zellfreien Schicht in Arteriolen der Ratte Cremaster Muscle

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die räumlich-zeitlichen Variationen der Breite der zellfreien Schicht in vivo zu quantifizieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Mikrohämodynamik zu beantworten und die Rolle der Zellphilia in der Mikrozirkulation besser zu verstehen. Der Hauptvorteil dieser Methode liegt darin, dass die Breite der zellfreien Schicht in vivo konsistenter und bequemer quantifiziert werden kann als mit früheren manuellen Messverfahren, die sehr zeitaufwendig waren.Bevor Sie die Messung der zellfreien Schichtbreite beginnen, führen Sie die vorab erstellte MatLab-Skriptdatei für die zellfreie Schicht aus. Klicken Sie anschließend auf „Datei öffnen“, um die Videodatei für die Analyse auszuwählen, und stellen Sie mithilfe des Drehreglers die Wände des einzelnen Gefäßes vertikal ausgerichtet dar, wobei Sie gegebenenfalls den Zoomregler verwenden, um den Zoomebene anzupassen. Sobald sich das Gefäß in der geeigneten Position befindet, klicken Sie auf „Bearbeitung bestätigen“ und danach auf „ROI festlegen“, um den interessierenden Bereich (Region of Interest) durch Zuschneiden zu definieren.Das ausgerichtete Bild wird in einem Popup-Fenster angezeigt. Passen Sie das rechteckige Objektiv auf dem Bild nach Bedarf an und doppelklicken Sie darauf, um den interessierenden Bereich zu bestätigen. Klicken Sie anschließend auf „Bilder extrahieren“, um alle bearbeiteten Videobilder in aufeinanderfolgende Bitmap-Bilder zu extrahieren, die sich im Ordner mit dem gleichen Namen wie die ausgewählte Videodatei befinden.Um die Breite der zellfreien Schicht zu messen, klicken Sie auf „Ordner auswählen“ und anschließend auf den Ordner mit den Bildern. Der erste Bildrahmen wird im Graustufenbildbereich zusammen mit dem entsprechenden Grauwert-Intensitätshistogramm im Histogrammbereich angezeigt. Wählen Sie den gewünschten Bildrahmen aus der Listenbox aus, um die Analyse durchzuführen, und klicken Sie auf „Gefäßwände finden“, um die innere Gefäßwand im Bild zu identifizieren, die als der Ort bestimmt wird, an dem der Lichtintensitätsprofilverlauf über zwei Pixel von dunkel zu hell wechselt.Aktivieren Sie den Medianfilter, um dem Bild einen Medianfilter zur Reduzierung von Salt-and-Pepper-Rauschen anzuwenden. Aktivieren Sie die automatische Kontrastanpassung, um die Bildintensitäten digital anzupassen und den Bildkontrast zu verbessern. Wählen Sie anschließend einen Schwellwertalgorithmus in der Auswahlliste aus, um automatisch den Schwellwert zu bestimmen, der die Graustufen in zwei Klassen unterteilt: weiße Pixel mit Graustufen oberhalb des Schwellwerts und schwarze Pixel mit Graustufen unterhalb des Schwellwerts.Um die räumliche Variation der breitenfreien Zellschichten zu messen, geben Sie die Pixelauflösung in das Feld „Pixelauflösung“ ein. Klicken Sie dann auf „Berechnen“, um die räumliche Variation der breitenfreien Zellschichten zu erhalten, und klicken Sie auf „Exportieren. csv“, um die Daten zur Schichtbreite der zellfreien Schicht im tabellarischen Format zu exportieren.Um die zeitliche Variation der breiten der zellfreien Schicht an einer bestimmten Analyselinie entlang des Gefäßes zu messen, klicken Sie auf „Temporal Variation“ und geben Sie die Informationen zur Bildfrequenz ein. Geben Sie die erste und letzte Bildnummer der Bilder für die Analyse in die Felder „start frame“ und „last frame“ ein. Passen Sie mithilfe des Schiebereglers für die Analyselinie die Position der Analyselinie entlang des Gefäßes an und bestätigen Sie die Position der Analyselinie, wie auf den Graustufen- und Binärbildern veranschaulicht.Klicken Sie anschließend auf Berechnen, um die zeitliche Variation der breiten der zellfreien Schicht zu erhalten, und auf Exportieren. csv, um die Daten der zellfreien Schichtbreite im tabellarischen Format zu exportieren. Hier ist ein typischer roter Blutkörperchenstrom durch eine unverzweigte Arterie im Ratten-Kremastermuskel dargestellt, bei dem die zellfreie Schicht zwischen dem Erythrozytenkern und der inneren Gefäßwand sichtbar ist.Ein guter Kontrast zwischen diesen Komponenten ist entscheidend, um die Genauigkeit der Messungen der zellfreien Schichtbreite sicherzustellen. Die erste Phase der Bildanalyse umfasste die Detektion der inneren Gefäßwand. Durch die Aufnahme des Lichtintensitätsprofils entlang der Analysezeile senkrecht zum Gefäß wird die Position an dem Peak angenähert, der sich über zwei Pixel von dunkel nach hell verändert.Anschließend werden die Grenzen des roten Blutkörperchen-Kerns mithilfe des Bildschwellwertalgorithmus erkannt, und die CFL-Breiten können dann berechnet werden. Da rote Blutkörperchen in der zellfreien Schicht unterschiedliche Lichtdurchlässigkeiten aufweisen, kann der Unterschied in den Graustufen in zwei Klassen unterteilt werden. Die Bestimmung eines genauen Schwellenwerts zwischen den beiden Peaks im Bildhistogramm kann jedoch durch schlechte Bildqualität und geringen Kontrast eingeschränkt sein.Um den Kontrast zwischen den roten Blutkörperchen und der zellfreien Schicht zu verbessern, kann ein blauer Filter verwendet werden. Dies zeigt sich besonders deutlich in diesen Aufnahmen, bei denen die Grenzen der Kerne der roten Blutkörperchen mit einem blauen Filter genauer identifiziert wurden. Der Schwellwertalgorithmus kann ebenfalls die Messung der Dicke der zellfreien Schicht beeinflussen, wie in diesen Bildern ersichtlich ist, in denen unterschiedliche Schwellwertalgorithmen zur Identifizierung verschiedener Grenzen der Kerne der roten Blutkörperchen und somit zu unterschiedlichen Breiten der zellfreien Schicht führten.Die Messung der Breite der zellfreien Schicht in vivo ist sehr empfindlich gegenüber der Bildqualität. Daher ist darauf zu achten, die Operation sorgfältig durchzuführen und eine geeignete optische Hilfsvorrichtung zu verwenden, um eine gute Bildqualität zu erzielen. Darüber hinaus ist die Auswahl eines geeigneten Schwellwert-Algorithmus für die Bildsegmentierung entscheidend, um eine genaue und konsistente Messung der Breite der zellfreien Schicht sicherzustellen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ein Gewebe Vorbereitung ist für die Visualisierung und experimentelle Manipulation des Lebendigen Mikrozirkulation beschrieben. In narkotisierten männlichen Mäusen ist die dünne, stark vaskularisierten M. cremaster für Intravitalmikroskopie zu mikrovaskulären Netzwerken, einschließlich Arteriolen, Kapillaren und Venolen Studie vorbereitet. Die Zubereitung ist leicht für Ratten und Hamstern angepasst.

Die Maus Cremaster Muscle Vorbereitung Intravital Imaging der Mikrozirkulation

Das Ziel dieses Artikels ist es, ein Verfahren zu demonstrieren Immunfluoreszenz Detektion von Östrogen-Rezeptor-α (ERa) in Ratten Pia arteriellen Scheiben mit einem digitalen Immunfluoreszenz-Mikroskop zu optimieren.

Imaging von Estrogen Receptor-α in Rat Pial Arteriolen mit einem Digital-Immunfluoreszenz-Mikroskop

Digitale intravitalen Epifluoreszenzmikroskopie von postkapillären Venolen in der cremasterica Mikrozirkulation ist eine bequeme Methode, um Einblicke in die Leukozyten-Endothel Interaktion zu...

Real-time Digital Imaging von Leukozyten-Endothel-Interaktion in der Ischämie-Reperfusionsschaden (IRI) der Ratte Cremastermuskel

Wir demonstrieren eine neuartige arteriellen Ligation Modell in murinen spinotrapezius Muskel, einschließlich eines Schritt-für-Schritt-Verfahren und der Beschreibung der erforderlichen Instrumente. Wir beschreiben die Chirurgie und relevante Outcome-Messungen in Bezug auf Gefäßnetz Umbau und funktionalen Gefäßerweiterung mittels intravitaler und konfokale Mikroskopie.

Murine Spinotrapezius Modell, um die Auswirkungen der Arteriolen Ligation auf mikrovaskuläre Funktion und Remodeling beurteilen

Hier berichten wir über eine experimentelle Technik der Fluoreszenz-Intravitalmikroskopie um heterotypische Thrombozyten-Neutrophilen-Interaktionen auf dem aktivierten Endothel während der vaskulären Entzündungen und Thrombusbildung in lebenden Mäusen sichtbar zu machen. Diese mikroskopische Technik wird wertvoll sein, um die molekularen Mechanismen der vaskulären Erkrankungen zu studieren und pharmakologische Mittel unter pathophysiologischen Bedingungen zu testen.

Real-time Imaging der heterotypische Platelet-Neutrophilen-Interaktionen auf aktiviertem Endothel Während Vascular Entzündung und Thrombusbildung in lebenden Mäusen

Intravitalmikroskopie der Maus M. cremaster Mikrozirkulation bietet eine einzigartige und in-vivo-Modell für die Analyse von peripheren Knochenmark-Stammzellen Migration gut standardisiert.

Intravitalmikroskopie der Mikrozirkulation in der Maus Cremaster-Muskel für die Analyse der peripheren Stammzell Migration

Dieses Manuskript beschreibt in Vitro Videomikroskopie Protokolle für die Bewertung der Gefäßfunktion in Ratte zerebralen Widerstand Arterien. Das Manuskript beschreibt auch Techniken für die Bewertung der kapilläre Dichte mit Gewebekulturen beschrifteten Lektine und Gewebe Perfusion mit Laser-Doppler-Flowmetry.

Bewertung der vaskulären Kontrollmechanismen Nutzung Videomikroskopie der isolierten Widerstand Arterien von Ratten

Dieses Manuskript beschreibt eine einfache Protokoll für die Isolierung von Arteriolen von der Netzhaut der Ratte, die in elektrophysiologische, Kalzium Imaging und Druck Myographie Studien verwendet werden können.

Isolierung der retinalen Arteriolen für Ex Vivo Zelle Physiologie Studien

Hier zeigen wir, wie man eine intravitale Mikroskopie auf postkapillaren Venulen des Maus-Cremaster-Muskels durchführt. Häufig angewendet auf verschiedene Modelle von Entzündungen und Sepsis, insbesondere solche, die durch Chemokine und Zytokine induziert werden, heben wir ihre Relevanz in der Untersuchung von Muskopathien mit übertriebener Muskel-Leukozyten-Infiltration hervor.

Leukozyten-Infiltration von Cremaster-Muskeln bei Mäusen bewertet durch Intravital-Mikroskopie

Präsentiert wird hier ein Protokoll zur Untersuchung der koronaren Mikrozirkulation im lebenden murinen Herzgewebe durch ex vivo-Überwachung des arteriellen Perfusionsdrucks und -flusses, der den Druck aufrechterhält, sowie gefäßvaskulärer Baumbestandteile, einschließlich der Kapillarbetten und Pericyten, da die Septalarterie kanüliert und unter Druck steht.

Dynamische Messung und Bildgebung von Kapillaren, Arteriolen und Pericyten im Mausherz

Die intensive Vorbereitung intakter zerebraler endothelialer "Röhrchen" der Maus aus den zerebralen parenchymalen Arteriolen wird für die Untersuchung der zerebralen Blutflussregulation veranschaulicht. Darüber hinaus demonstrieren wir die experimentellen Stärken dieses endothelialen Studienmodells für die Fluoreszenzbildgebung und die elektrophysiologische Messung wichtiger zellulärer Signalwege, einschließlich Änderungen des intrazellulären [Ca2+] und des Membranpotentials.

Isolierung und funktionelle Analyse des arteriolären Endothels des Hirnparenchyms der Maus

Lernen Sie die Visualisierung und Quantifizierung der zellfreien Schicht in Arteriolen der Ratte Cremaster Muscle. Diese Methode ermöglicht präzise Messungen der Mikrohämodynamik in vivo.

Visualisierung und Quantifizierung der zellfreien Schicht in Arteriolen der Ratte Cremaster Muscle

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