Visualisierung und Quantifizierung der zellfreien Schicht in Arteriolen der Ratte Cremaster Muscle
19. Oktober 2016
Diese Studie demonstriert die chirurgische Vorbereitung des Cremaster-Muskels der Ratte für die Visualisierung der in vivo zellfreien Schicht. In dieser Studie werden wesentliche Faktoren diskutiert, die die Genauigkeit der zellfreien Schichtbreitenmessung beeinflussen.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die räumlich-zeitlichen Variationen der in vivo zellfreien Schichtbreite zu quantifizieren. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Mikrohämodynamik zu beantworten, um die Rolle der Zellphilie bei der Mikrozirkulation besser zu verstehen. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass die in vivo Zell-Philia-Breite konsistenter und bequemer quantifiziert werden kann als bei früheren manuellen Messtechniken, die sehr zeitaufwändig waren.
Bevor Sie mit der Messung der zellfreien Schichtbreite beginnen, führen Sie die Skriptdatei für zellfreie Schichten vor MatLab aus. Klicken Sie anschließend auf Datei öffnen, um die Videodatei für die Analyse auszuwählen, und passen Sie den Rotationsschieberegler an, um die Wände des einzelnen Schiffes vertikal auszurichten, indem Sie den Zoomschieberegler verwenden, um den Zoomfaktor nach Bedarf anzupassen. Wenn sich das Schiff in der richtigen Position befindet, klicken Sie auf Bearbeitung bestätigen und dann auf ROI auf Zuschneiden festlegen, um den Interessenbereich zu definieren.
Das ausgerichtete Bild wird in einem Popup-Fenster angezeigt. Passen Sie das rechteckige Objektiv im Bild nach Bedarf an und doppelklicken Sie auf das Objektiv, um den gewünschten Bereich zu bestätigen. Klicken Sie dann auf Bilder extrahieren, um alle bearbeiteten Videoframes in aufeinanderfolgende Bitmap-Bilder zu extrahieren, die sich in dem Ordner mit demselben Namen wie die ausgewählte Videodatei befinden.
Um die zellenfreie Layerbreite zu messen, klicken Sie auf Ordner auswählen und dann auf den Ordner mit den Bildern. Der erste Bildrahmen wird im Graustufen-Bildfenster zusammen mit dem entsprechenden Grauintensitätshistogramm im Bildhistogramm-Bedienfeld angezeigt. Wählen Sie den gewünschten Bildrahmen aus dem Listenfeld aus, um die Analyse durchzuführen, und klicken Sie auf Gefäßwände suchen, um die innere Gefäßwand im Bild zu identifizieren, die als die Position bestimmt wurde, an der die Spitze des Lichtintensitätsprofils über zwei Pixel von dunkel nach hell übergeht.
Aktivieren Sie Medianfilter, um einen Medianfilter auf das Bild anzuwenden und das Salz- und Pfefferrauschen zu reduzieren. Aktivieren Sie den Autokontrast für die digitale Anpassung der Bildintensitäten, um den Bildkontrast zu verbessern. Wählen Sie dann im Listenfeld einen Schwellenwertalgorithmus aus, um automatisch den Schwellenwert zu bestimmen, der die Graustufen in zwei Klassen unterteilt: weiße Pixel mit Grauwerten über dem Schwellenwert und schwarze Pixel mit Grauwerten unterhalb des Schwellenwerts.
Um die räumliche Variation der zellenfreien Layerbreiten zu messen, geben Sie die Pixelauflösung in das Feld Pixelauflösung ein. Klicken Sie dann auf Berechnen, um die räumliche Variation der zellenfreien Layer-Breiten zu erhalten, und klicken Sie auf Exportieren. csv, um die zellenfreien Schichtbreitendaten in einem tabellarischen Format zu exportieren.
Um die zeitliche Variation der zellfreien Layerbreiten an einer bestimmten Analyselinie entlang des Gefäßes zu messen, klicken Sie auf Zeitliche Variation, und geben Sie die Informationen zur Bildrate ein. Geben Sie das erste und das letzte Bild der Bilder für die Analyse in das Feld Startbild bzw. letztes Bild ein. Passen Sie den Schieberegler der Analyselinie an, um die Position der Analyselinie entlang des Behälters auszuwählen und die Position der Analyselinie zu bestätigen, wie sie sowohl auf den Graustufen- als auch auf den Binärbildern dargestellt ist.
Klicken Sie dann auf Berechnen, um die zeitliche Variation der zellenfreien Layerbreiten zu erhalten, und klicken Sie auf Export. csv, um die Daten zur zellenfreien Layerbreite in einem tabellarischen Format zu exportieren. Hier ist ein typischer Fluss roter Blutkörperchen durch eine unverzweigte Arterie im Cremaster-Muskel der Ratte zu sehen, wobei die zellfreie Schicht zwischen dem Erythrozytenkern und der inneren Gefäßwand zu sehen ist.
Ein guter Kontrast zwischen diesen Komponenten ist entscheidend, um die Genauigkeit der zellfreien Schichtbreitenmessungen zu gewährleisten. In der Anfangsphase der Bildanalyse ging es um die Detektion der inneren Gefäßwand. Durch die Erfassung des Lichtintensitätsprofils entlang der Analyselinie senkrecht zum Gefäß wird die Position an der Spitze angenähert, die über zwei Pixel von dunkel nach hell übergeht.
Anschließend werden die RBC-Kerngrenzen mit dem Bildschwellenwertalgorithmus erkannt und die CFL-Breiten können dann berechnet werden. Da die roten Blutkörperchen in der zellfreien Schicht unterschiedliche Lichtdurchlässigkeiten besitzen, kann der Unterschied in den Graustufen in zwei Klassen unterteilt werden. Die Identifizierung eines genauen Schwellenwerts zwischen den beiden Peaks im Bildhistogramm kann jedoch durch schlechte Bildqualität und Kontrast eingeschränkt werden.
Um den Kontrast zwischen den roten Blutkörperchen und der zellfreien Schicht zu verbessern, kann ein Blaufilter verwendet werden. Dies wird in diesen Bildern noch deutlicher, wo die Grenzen der Kerne der roten Blutkörperchen mit einem Blaufilter genauer identifiziert wurden. Der Schwellenwertalgorithmus kann auch die Messung der zellfreien Schichtbreite beeinflussen, wie in diesen Bildern zu sehen ist, in denen die verschiedenen Schwellenwertalgorithmen zur Identifizierung unterschiedlicher Kerngrenzen der roten Blutkörperchen und damit unterschiedlicher zellfreier Schichtbreiten führten.
Die Messung der in vivo zellfreien Schichtbreite ist sehr empfindlich gegenüber der Bildqualität. Achten Sie daher darauf, die Operation sorgfältig durchzuführen und einen geeigneten optischen Assistenten zu verwenden, um eine gute Bildqualität zu erhalten. Darüber hinaus ist es wichtig, den geeigneten Bildschwellenwertalgorithmus auszuwählen, um eine genaue und konsistente zellfreie Schichtbreitenmessung zu gewährleisten.
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Überblick
Diese Studie demonstriert die chirurgische Vorbereitung des Cremaster-Muskels der Ratte für die Visualisierung der in vivo zellfreien Schicht. Die Methode ermöglicht eine konsistente und bequeme Quantifizierung der Breite der zellfreien Schicht und beantwortet wichtige Fragen zur Mikrohämodynamik.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Mikrohämodynamik
- Zell-Philie in der Mikrozirkulation
Hintergrund
- Die zellfreie Schicht ist entscheidend für das Verständnis der Blutflussdynamik.
- Frühere Messtechniken waren zeitaufwändig und weniger genau.
- In-vivo-Visualisierungstechniken verbessern die Messzuverlässigkeit.
Ziel der Studie
- Quantifizierung raum-zeitlicher Variationen in der Breite der in vivo zellfreien Schicht.
- Verbesserung des Verständnisses der Rolle der Zell-Philie in der Mikrozirkulation.
Verwendete Methoden
- Chirurgische Vorbereitung des Cremaster-Muskels der Ratte.
- Verwendung eines vorgefertigten MatLab-Skripts für die Analyse.
- Videoanalyse zur Messung der Breite der zellfreien Schicht.
- Ausschneiden des Bereichs von Interesse (ROI) für fokussierte Messung.
Hauptergebnisse
- Die Breite der in vivo zellfreien Schicht kann genauer gemessen werden.
- Die Methode bietet eine effizientere Alternative zu manuellen Techniken.
Schlussfolgerungen
- Die chirurgische Vorbereitungstechnik ist effektiv für die Visualisierung.
- Diese Methode verbessert das Verständnis der Mikrohämodynamik.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Quantitative visualization of the cell-free layer in microvessels enables precise interrogation of microcirculatory hemodynamics, supporting mechanistic de-risking in vascular biology and drug discovery. Automated, reproducible measurement of cell-free layer width enhances predictive confidence for early-stage target validation and informs translational models of blood flow. This capability is strategically relevant for biopharma teams seeking robust, quantitative endpoints in microvascular research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative assessment of microvascular flow dynamics for hypothesis-driven target validation.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying the role of the cell-free layer in microcirculation.
- Provides reproducible, automated measurements to inform early-stage portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Delivers validated image analysis workflows for consistent quantification of vessel parameters.
- Facilitates assay standardization and reproducibility through automated thresholding algorithms.
- Generates quantitative outputs suitable for downstream screening and comparative studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns microvascular measurement endpoints with disease-relevant models in preclinical research.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by providing robust hemodynamic readouts.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on quantitative microcirculatory data.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by providing standardized, quantitative microvascular measurements that inform both early discovery and translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in microcirculatory research.
- Screening: Provides reproducible, quantitative vessel measurements for assay readiness.
- Analytics: Outputs spatial and temporal cell-free layer width data for robust statistical comparison.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical models with consistent hemodynamic endpoints.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, automated image analysis pipeline for diverse vascular studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in microvascular studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of vessel measurements.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust quantitative endpoints.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of vascular targets and models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in intravital microscopy and image analysis.
- Depends on high-quality imaging systems and computational infrastructure for automated analysis.
- Necessitates cross-team standardization of imaging protocols and thresholding algorithms.
- Adaptation may be needed for different vessel types or animal models.
- Measurement accuracy is sensitive to image quality, filter selection, and thresholding method.
