Visualisierung und Quantifizierung der zellfreien Schicht in Arteriolen der Ratte Cremaster Muscle
19. Oktober 2016
Diese Studie demonstriert die chirurgische Vorbereitung des Cremaster-Muskels der Ratte für die Visualisierung der in vivo zellfreien Schicht. In dieser Studie werden wesentliche Faktoren diskutiert, die die Genauigkeit der zellfreien Schichtbreitenmessung beeinflussen.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die räumlich-zeitlichen Variationen der Breite der zellfreien Schicht in vivo zu quantifizieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Mikrohämodynamik zu beantworten und die Rolle der Zellphilia in der Mikrozirkulation besser zu verstehen. Der Hauptvorteil dieser Methode liegt darin, dass die Breite der zellfreien Schicht in vivo konsistenter und bequemer quantifiziert werden kann als mit früheren manuellen Messverfahren, die sehr zeitaufwendig waren.
Bevor Sie die Messung der zellfreien Schichtbreite beginnen, führen Sie die vorab erstellte MatLab-Skriptdatei für die zellfreie Schicht aus. Klicken Sie anschließend auf „Datei öffnen“, um die Videodatei für die Analyse auszuwählen, und stellen Sie mithilfe des Drehreglers die Wände des einzelnen Gefäßes vertikal ausgerichtet dar, wobei Sie gegebenenfalls den Zoomregler verwenden, um den Zoomebene anzupassen. Sobald sich das Gefäß in der geeigneten Position befindet, klicken Sie auf „Bearbeitung bestätigen“ und danach auf „ROI festlegen“, um den interessierenden Bereich (Region of Interest) durch Zuschneiden zu definieren.
Das ausgerichtete Bild wird in einem Popup-Fenster angezeigt. Passen Sie das rechteckige Objektiv auf dem Bild nach Bedarf an und doppelklicken Sie darauf, um den interessierenden Bereich zu bestätigen. Klicken Sie anschließend auf „Bilder extrahieren“, um alle bearbeiteten Videobilder in aufeinanderfolgende Bitmap-Bilder zu extrahieren, die sich im Ordner mit dem gleichen Namen wie die ausgewählte Videodatei befinden.
Um die Breite der zellfreien Schicht zu messen, klicken Sie auf „Ordner auswählen“ und anschließend auf den Ordner mit den Bildern. Der erste Bildrahmen wird im Graustufenbildbereich zusammen mit dem entsprechenden Grauwert-Intensitätshistogramm im Histogrammbereich angezeigt. Wählen Sie den gewünschten Bildrahmen aus der Listenbox aus, um die Analyse durchzuführen, und klicken Sie auf „Gefäßwände finden“, um die innere Gefäßwand im Bild zu identifizieren, die als der Ort bestimmt wird, an dem der Lichtintensitätsprofilverlauf über zwei Pixel von dunkel zu hell wechselt.
Aktivieren Sie den Medianfilter, um dem Bild einen Medianfilter zur Reduzierung von Salt-and-Pepper-Rauschen anzuwenden. Aktivieren Sie die automatische Kontrastanpassung, um die Bildintensitäten digital anzupassen und den Bildkontrast zu verbessern. Wählen Sie anschließend einen Schwellwertalgorithmus in der Auswahlliste aus, um automatisch den Schwellwert zu bestimmen, der die Graustufen in zwei Klassen unterteilt: weiße Pixel mit Graustufen oberhalb des Schwellwerts und schwarze Pixel mit Graustufen unterhalb des Schwellwerts.
Um die räumliche Variation der breitenfreien Zellschichten zu messen, geben Sie die Pixelauflösung in das Feld „Pixelauflösung“ ein. Klicken Sie dann auf „Berechnen“, um die räumliche Variation der breitenfreien Zellschichten zu erhalten, und klicken Sie auf „Exportieren. csv“, um die Daten zur Schichtbreite der zellfreien Schicht im tabellarischen Format zu exportieren.
Um die zeitliche Variation der breiten der zellfreien Schicht an einer bestimmten Analyselinie entlang des Gefäßes zu messen, klicken Sie auf „Temporal Variation“ und geben Sie die Informationen zur Bildfrequenz ein. Geben Sie die erste und letzte Bildnummer der Bilder für die Analyse in die Felder „start frame“ und „last frame“ ein. Passen Sie mithilfe des Schiebereglers für die Analyselinie die Position der Analyselinie entlang des Gefäßes an und bestätigen Sie die Position der Analyselinie, wie auf den Graustufen- und Binärbildern veranschaulicht.
Klicken Sie anschließend auf Berechnen, um die zeitliche Variation der breiten der zellfreien Schicht zu erhalten, und auf Exportieren. csv, um die Daten der zellfreien Schichtbreite im tabellarischen Format zu exportieren. Hier ist ein typischer roter Blutkörperchenstrom durch eine unverzweigte Arterie im Ratten-Kremastermuskel dargestellt, bei dem die zellfreie Schicht zwischen dem Erythrozytenkern und der inneren Gefäßwand sichtbar ist.
Ein guter Kontrast zwischen diesen Komponenten ist entscheidend, um die Genauigkeit der Messungen der zellfreien Schichtbreite sicherzustellen. Die erste Phase der Bildanalyse umfasste die Detektion der inneren Gefäßwand. Durch die Aufnahme des Lichtintensitätsprofils entlang der Analysezeile senkrecht zum Gefäß wird die Position an dem Peak angenähert, der sich über zwei Pixel von dunkel nach hell verändert.
Anschließend werden die Grenzen des roten Blutkörperchen-Kerns mithilfe des Bildschwellwertalgorithmus erkannt, und die CFL-Breiten können dann berechnet werden. Da rote Blutkörperchen in der zellfreien Schicht unterschiedliche Lichtdurchlässigkeiten aufweisen, kann der Unterschied in den Graustufen in zwei Klassen unterteilt werden. Die Bestimmung eines genauen Schwellenwerts zwischen den beiden Peaks im Bildhistogramm kann jedoch durch schlechte Bildqualität und geringen Kontrast eingeschränkt sein.
Um den Kontrast zwischen den roten Blutkörperchen und der zellfreien Schicht zu verbessern, kann ein blauer Filter verwendet werden. Dies zeigt sich besonders deutlich in diesen Aufnahmen, bei denen die Grenzen der Kerne der roten Blutkörperchen mit einem blauen Filter genauer identifiziert wurden. Der Schwellwertalgorithmus kann ebenfalls die Messung der Dicke der zellfreien Schicht beeinflussen, wie in diesen Bildern ersichtlich ist, in denen unterschiedliche Schwellwertalgorithmen zur Identifizierung verschiedener Grenzen der Kerne der roten Blutkörperchen und somit zu unterschiedlichen Breiten der zellfreien Schicht führten.
Die Messung der Breite der zellfreien Schicht in vivo ist sehr empfindlich gegenüber der Bildqualität. Daher ist darauf zu achten, die Operation sorgfältig durchzuführen und eine geeignete optische Hilfsvorrichtung zu verwenden, um eine gute Bildqualität zu erzielen. Darüber hinaus ist die Auswahl eines geeigneten Schwellwert-Algorithmus für die Bildsegmentierung entscheidend, um eine genaue und konsistente Messung der Breite der zellfreien Schicht sicherzustellen.
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Übersicht
Diese Studie demonstriert die chirurgische Präparation des Ratten-Cremastermuskels zur Visualisierung der in-vivo zellfreien Schicht. Die Methode ermöglicht eine konsistente und praktische Quantifizierung der Breite der zellfreien Schicht und trägt zur Beantwortung zentraler Fragen der Mikrohämodynamik bei.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Mikro-Hämodynamik
- Zellaffinität in der Mikrozirkulation
Hintergrund
- Die zellfreie Schicht ist entscheidend für das Verständnis der Dynamik des Blutflusses.
- Frühere Messtechniken waren zeitaufwendig und weniger genau.
- In-vivo-Visualisierungstechniken verbessern die Zuverlässigkeit der Messung.
Zweck der Studie
- Um räumlich-zeitliche Variationen der in-vivo-freien Zellschichtbreite zu quantifizieren.
- Um das Verständnis der Rolle der Zellphilie in der Mikrozirkulation zu verbessern.
Verwendete Methoden
- Chirurgische Präparation des Ratten-Cremastermuskels.
- Verwendung eines vorab in MatLab erstellten Skripts zur Analyse.
- Videobasierte Analyse zur Messung der breitenfrei Schicht.
- Ausschneiden eines interessierenden Bereichs (ROI) für fokussierte Messungen.
Hauptergebnisse
- Die Breite der zellfreien Schicht in vivo kann genauer gemessen werden.
- Die Methode bietet eine effizientere Alternative zu manuellen Techniken.
Schlussfolgerungen
- Die chirurgische Vorbereitungstechnik ist wirksam zur Visualisierung.
- Diese Methode verbessert das Verständnis der Mikrohämodynamik.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die quantitative Visualisierung der zellfreien Schicht in Mikrogefäßen ermöglicht eine präzise Untersuchung der mikrozirkulatorischen Hämodynamik und unterstützt die mechanistische Risikominderung in der Gefäßbiologie und Arzneimittelforschung. Die automatisierte, reproduzierbare Messung der Breite der zellfreien Schicht erhöht die Vorhersagesicherheit für die Validierung von Zielstrukturen in frühen Entwicklungsstadien und liefert Daten für translationsrelevante Modelle des Blutflusses. Diese Fähigkeit ist strategisch bedeutsam für Biopharma-Teams, die robuste, quantitative Endpunkte in ihren Forschungspipelines zu Mikrogefäßen anstreben.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die quantitative Beurteilung der mikrovaskulären Flussdynamik zur hypothesenbasierten Zielvalidierung.
- Unterstützt die mechanistische Risikominimierung, indem die Rolle der zellfreien Schicht in der Mikrozirkulation geklärt wird.
- Liefert reproduzierbare, automatisierte Messungen zur Unterstützung der Frühphasen-Portfoliobewertung.
Screening und Assay-Entwicklung
- Liefert validierte Workflows für die Bildanalyse zur konsistenten Quantifizierung von Gefäßparametern.
- Unterstützt die Standardisierung und Reproduzierbarkeit von Assays durch automatisierte Schwellwertalgorithmen.
- Erzeugt quantitative Ergebnisse, die für nachgeschaltete Screening- und Vergleichsstudien geeignet sind.
Translationale und präklinische Forschung
- Stimmt mikrovaskuläre Messendpunkte mit krankheitsrelevanten Modellen in der präklinischen Forschung ab.
- Ermöglicht Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem robuste hämodynamische Messgrößen bereitgestellt werden.
- Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung auf Grundlage quantitativer mikrozirkulatorischer Daten.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode integriert sich in den Übergang von der Entdeckung zur präklinischen Forschung, indem sie standardisierte, quantitative Messungen der Mikrozirkulation bereitstellt, die sowohl die frühe Entdeckung als auch die translationale Forschung unterstützen.
- Entdeckungsbasierte Biologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen in der Mikrozirkulationsforschung.
- Screening: Ermöglicht reproduzierbare, quantitative Gefäßmessungen für die Bereitschaft von Assays.
- Analytik: Liefert räumliche und zeitliche Daten zur breitenfreiheitlichen Zellschicht für robuste statistische Vergleiche.
- Translationale Forschung: Verbindet Entdeckungen und präklinische Modelle durch konsistente hämodynamische Endpunkte.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet eine wiederverwendbare, automatisierte Bildanalyse-Pipeline für vielfältige Gefäßstudien.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten in mikrovaskulären Studien.
- Operationaler Wert: Verbessert die Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit von Gefäßmessungen.
- Strategischer Wert: Verbessert Go/No-Go-Entscheidungen und die Kapitalnutzungseffizienz, indem robuste quantitative Endpunkte bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung vaskulärer Zielstrukturen und Modelle.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der intravitale Mikroskopie und Bildanalyse.
- Hängt von hochwertigen Abbildungssystemen und einer leistungsfähigen Recheninfrastruktur für die automatisierte Analyse ab.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen hinsichtlich der Bildaufnahmeprotokolle und Schwellwertalgorithmen.
- Möglicherweise ist eine Anpassung für verschiedene Gefäßtypen oder Tiermodelle notwendig.
- Die Genauigkeit der Messungen ist empfindlich gegenüber Bildqualität, Filterauswahl und Schwellwertmethode.
