Durchflusszytometrische Zellsortierung für verschiedene zirkulatorische B-Zellpopulationen

Basierend auf ihren Zelloberflächenrezeptoren werden zirkulierende menschliche B-Zellen in CD19-positive naive B-Zellen, CD19- und CD27-positive Gedächtnis-B-Zellen und CD19-, CD27- und CD38-positive Plasmablasten-Plasmazellen eingeteilt.

Um diese Zellpopulationen zu sortieren, nehmen Sie eine gereinigte B-Zell-Suspension. Inkubieren Sie mit humanen Immunglobulin-G-Antikörpern. Die Antikörper blockieren die Fc-Rezeptoren der B-Zellen und verhindern so eine unspezifische Antikörperbindung.

Fügen Sie fluoreszenzmarkierte Antikörper hinzu, die auf CD19, CD27 und CD38 abzielen.

Die Anti-CD19-Antikörper binden an die CD19-Rezeptoren, die ubiquitär auf B-Zellen exprimiert werden.

Die Anti-CD27-Antikörper binden an die CD27-Rezeptoren, die auf Gedächtnis-B-Zellen und Plasmablasten-Plasmazellen exprimiert werden.

Die Anti-CD38-Antikörper binden an die CD38-Rezeptoren, die auf Plasmablasten-Plasmazellen exprimiert werden.

Fügen Sie einen fluoreszierenden DNA-bindenden Farbstoff als Marker für tote Zellen hinzu.

Tote Zellen weisen einen Verlust der Membranintegrität auf, was den zellulären Eintritt des Farbstoffs und die Bindung an die doppelsträngige DNA ermöglicht; lebende Zellen bleiben ungefärbt.

Zentrifugieren, um ungebundene Antikörper und Farbstoffe zu entfernen und die Zellen in FACS-Puffer zu resuspendieren. Filtern Sie die Zellen durch ein Sieb, um eine homogene Suspension zu erhalten und Klumpen zu entfernen.

Trennen Sie mit einem Durchflusszytometer die abgestorbenen Zellen von den lebenden. Innerhalb der lebenden Zellen unterscheiden die CD19-, CD27- und CD38-Expression naive B-Zellen, Gedächtnis-B-Zellen und Plasmablasten-Plasmazellen.

Nach Durchführung einer unspezifischen Blockierung 1 Mikrogramm jedes Selektionsantikörpers pro 1 x 10⁶ Zellen in das Röhrchen unter sanftem Mischen für eine 30-minütige Inkubation auf Eis geben. Während der letzten fünf Minuten der Inkubation geben Sie 5 Mikroliter 7-AAD in die Zellen. Geben Sie dann 2 Milliliter frisches PBS in die Zellen und wirbeln Sie sie vor dem Zentrifugieren ein.

Resuspendieren Sie das Pellet in frischem Sortierpuffer bei einer Konzentration von 1 bis 5 x 10 7 Zellen pro Milliliter und filtrieren Sie die Zellen durch ein 40-Mikron-Zellsieb in ein neues 5-Milliliter-Polystyrolröhrchen. Sortieren Sie dann die Zellen durch Durchflusszytometrie in drei 15-Milliliter-Röhrchen mit 5 Millilitern frischem RPMI-Medium, um die naiven B-Zellen, Gedächtnis-B-Zellen und Plasmablasten-Plasmazellen zu sammeln.