Methodologien für das Studium B. subtilis Biofilme als Modell für kleine Molekül-Inhibitoren Biofilm Charakterisieren

Bakterielle Biofilme sind wichtig für die menschliche Gesundheit, da sie ihre bakteriellen Bewohner vor Umwelteinflüssen und antimikrobiellen Wirkstoffen schützen. Ziel dieses Verfahrens war es, ein Modellsystem zu entwickeln, um die Auswirkungen von niedermolekularen Inhibitoren auf die Biofilmbildung zu bewerten. Diese Methoden können dazu beitragen, ein für das Biofilmfeld unerlässliches Instrumentarium zu etablieren, um niedermolekulare Inhibitoren auszuwählen, die spezifisch auf die Biofilmbildung abzielen.

Der Hauptvorteil dieser Methoden besteht darin, dass sie von einem konsistenten, robusten experimentellen Rahmen ausgehen und quantitative und qualitative Einblicke in den Wirkmechanismus von Biofilm-spezifischen Inhibitoren geben. Diese Methoden können zwar Einblicke in die Biofilme von Bacillus subtilis geben, aber auch auf andere biofilmbildende Bakterien, wie Pseudomonas aeruginosa oder den Pflanzenpathogen Xanthomonas citri, angewendet werden. Die Rasterelektronenmikroskopie kann unerlässlich sein, um die Wirkung kleiner Moleküle auf die Biofilmbildung zu analysieren, da sie die Beobachtung der extrazellulären Matrix ermöglicht und eine Einzelzellauflösung ermöglicht.

Wählen Sie zunächst eine geeignete einzelne Kolonie aus und geben Sie sie in drei Milliliter LB-Brühe. Legen Sie diese Starterkultur für vier Stunden bei 37 Grad Celsius in einen Schüttelinkubator. Nach der Inkubation 1,5 Milliliter der Starterkultur entnehmen und vier Minuten lang zentrifugieren.

Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und suspendieren Sie das Pellet wieder in 1,5 Millilitern MSgg-Medium. Um Pellicles zu züchten, bereiten Sie eine 12-Well-Zellkulturplatte vor, indem Sie drei Milliliter MSgg in jede Vertiefung geben. Geben Sie in einige dieser Vertiefungen MSgg mit einem niedermolekularen Inhibitor in einem Konzentrationsbereich, wobei Sie die Position der verschiedenen Konzentrationen um die Schale herum verteilen, um Kanteneffekte zu vermeiden.

Messen Sie die optische Dichte bei 600 Nanometern der resuspendierten Starterkultur. Die Kultur sollte zwischen 0,6 und eins liegen. Dies ist entscheidend für die Robustheit des Systems.

Innokulieren Sie jede Vertiefung der Kulturplatte mit 3 Mikrolitern der resuspendierten Starterkultur. Dann inkubieren Sie die Platte drei Tage lang bei 23 Grad Celsius unter statischen Bedingungen. Nehmen Sie anschließend die Platte aus dem Inkubator und beobachten Sie die Pellikel.

Um Biofilme zu züchten, verwenden Sie eine Schablone und geben Sie symmetrisch vier separate Tropfen mit 1,5 Mikrolitern ungewaschener Starterkultur auf eine 8,5 Zentimeter große getrocknete 1,5%ige Agar MSgg-Platte. Lassen Sie die Tropfen in das Medium einziehen, bevor Sie die Platte bewegen. Inkubieren Sie die Platten drei Tage lang bei 30 Grad Celsius.

Überprüfen Sie mit einem Fernglas mit homogener Lichteinwirkung, ob sich Biofilmkolonien entwickelt und eine dreidimensionale Faltenstruktur gebildet haben. Nimm zunächst eine saubere Rasierklinge und schneide die Biofilmkolonien mit Hilfe der Schablone in zwei gleich große Teile. Heben Sie vorsichtig eine Hälfte der Kolonie mit einem sauberen Spatel an und geben Sie sie in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, das 500 Mikroliter PBS enthält.

Nehmen Sie die zweite Hälfte der Kolonie und geben Sie sie in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 500 Mikrolitern 50% Ethanol. Diese sollen zur Beurteilung der Beständigkeit gegen Sterilisationsmittel herangezogen werden. Nehmen Sie anschließend auf ähnliche Weise die erste Hälfte der mit D-Lysin behandelten Kolonie und legen Sie sie in PBS.

Nehmen Sie dann die zweite Hälfte dieser Kolonie und übertragen Sie sie auf Ethanol. Inkubieren Sie alle Röhrchen mit den Biofilmhälften 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Und dann zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei 18.000 mal g.

Entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette. Fügen Sie 300 Mikroliter PBS hinzu und beschallen Sie die Zellen dann bei niedriger Einstellung mit einem Mikrospitzen-Ultraschallgerät. Fügen Sie weitere 700 Mikroliter PBS hinzu, um ein Endvolumen von einem Milliliter zu erhalten.

Führen Sie als Nächstes eine serielle Verdünnung von 10 auf die negative Sieben in PBS durch. Nehmen Sie 100 Mikroliter einer der Verdünnungen und innokulieren Sie eine 1,5%ige Agar LB-Platte. Wiederholen Sie diesen Schritt für zwei weitere Verdünnungen pro Probe.

Verteilen Sie das Innoculum mit Glasperlen und inkubieren Sie die Platten dann über Nacht bei 30 Grad Celsius. Untersuchen Sie die Platten und zählen Sie die koloniebildenden Einheiten (KBE). Nach der Berechnung des KBE-Wertes pro Milliliter ist der Prozentsatz der Überlebenden in der PBS-Behandlung im Vergleich zu Ethanolbehandlungen zu berechnen.

Um mit der Probenfixierung zu beginnen, bereiten Sie zunächst genügend frische Fixierlösung für die gewünschte Anzahl von Biofilmkolonien vor. Geben Sie vorsichtig fünf Milliliter Fixiermittel in jede Petrischale und vermeiden Sie es, direkt auf die Kolonien zu pipettieren. Die Kolonien beginnen, sich vom Agar zu lösen und zu schwimmen.

Verschließen Sie die Platten vorsichtig mit Parafilm und inkubieren Sie sie zwei Stunden lang bei Raumtemperatur auf einem Rotationsschüttler. Übertragen Sie die Platten über Nacht in eine bei vier Grad Celsius gelagerte Platte. Entfernen Sie die Fixierflüssigkeit vorsichtig mit einer Pasteur-Pipette, die an ein Vakuum angeschlossen ist.

Fügen Sie 10 Milliliter 100 nanomolare Natriumcacodylat und fünf millimolare Calciumchloridpuffer hinzu, um den Biofilm zu waschen, und inkubieren Sie fünf Minuten lang. Lösen Sie vorsichtig die Mitte der Biofilmkolonie mit einer Pasteurpipette von der Agarplatte. Um die Kolonien an der Luft zu trocknen, schneiden Sie Zellulosefilterpapier in Viertel und tauchen Sie dann einen Abschnitt in 100 % Ethanol.

Übertragen Sie vorsichtig eine schwimmende Biofilmkolonie auf das Papier. Lege das Papier in eine Petrischale, die mit trockenem Filterpapier ausgelegt ist. Decken Sie dann die Schüssel ab und lassen Sie sie über Nacht in einer chemischen Haube trocknen.

Um die Morphologie der Biofilmkolonie zu erhalten, ist es wichtig, den schwimmenden Biofilm vollständig mit dem Zellulosepapier zu unterlegen. Einmal auf dem Papier, kann der Biofilm nicht mehr nachjustiert werden. Bestreichen Sie einen Elektronenmikroskopie-Stummel mit Kohleband und übertragen Sie dann mit einer Pinzette die Biofilmkolonien vorsichtig auf den Stummel.

Nachdem Sie jede Kolonie mit dem Stummel verbunden haben, lagern Sie die Stummel durch Hinzufügen einer dünnen Brücke aus Kohleband 24 Stunden lang oder bis zur Verwendung in einem Exsikkator. Dieser Schritt erfordert eine ruhige und präzise Hand, da die Biofilme in diesem Stadium sehr zerbrechlich sind und leicht aufbrechen. Die Herausforderung besteht darin, einen wesentlichen Teil des Biofilms rissfrei zu montieren.

Am Tag der Untersuchung werden die Kolonien in einen Gold-Palladium-Sputter-Coater gegeben. Beschichten Sie die Proben zwei Minuten lang in einem 60-Grad-Winkel. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal, wobei Sie die Proben dazwischen um 120 Grad drehen.

Zum Schluss beschichten Sie die Proben einmal drei Minuten lang von oben. Die Proben sind nun bereit für die Bildgebung auf dem REM. Diese Bilder zeigen die pellische Bildung von B.subtilis, das in Biofilm-induzierendem MSgg-Medium gezüchtet wurde.

Durch die Zugabe des niedermolekularen Inhibitors D-Lysin wird die Pellikelentwicklung reduziert. Und wenn die Konzentration des Inhibitors zunimmt, zeigt die Pellikelbildung eine korrelierende Abnahme. Diese Grafik zeigt die Auswirkungen der Exposition gegenüber Ethanol auf das Überleben von Zellen in Biofilmkolonien, die mit einem D-Lysin-Hemmer behandelt oder unbehandelt gelassen wurden.

Kolonien, die mit D-Lysin behandelt und 10 Minuten lang 50 % Ethanol ausgesetzt waren, zeigten eine dramatische Verringerung des Überlebens im Vergleich zur unbehandelten Fraktion. Binokularaufnahmen von oben nach unten zeigen, dass die in Gegenwart von D-Lysin gewachsenen Kolonien insgesamt kleiner waren und weniger ausgeprägte Falten bildeten als die unbehandelten. Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von kritisch punktgetrockneten Biofilmkolonien zeigen die veränderte Biofilmentwicklung.

Die Matrix der extrazellulären polymeren Substanzen (EPS) wirkte in unbehandelten Proben eher wie ein Spinnennetz, wobei die behandelten Proben eine geringere Organisation aufwiesen. Schließlich zeigt die Untersuchung mit Auflösung einzelner Bakterienzellen, dass behandelte Zellen länglich aussehen, weniger mit EPS bedeckt und nicht so eng mit ihren Nachbarn verbunden sind wie die unbehandelten Zellen. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Schaffung eines konsistenten Rahmens für die Untersuchung von Biofilm-Inhibitoren für reproduzierbare Ergebnisse unerlässlich ist.

Einmal gemeistert, kann ein Screening kleiner Moleküle zur Hemmung von Biofilmen in weniger als einer Woche durchgeführt werden, wenn es richtig durchgeführt wird. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden, wie z.B. die Untersuchung der Genexpression in einzelnen Biofilmzellen, durchgeführt werden, um zusätzliche Einblicke in das Ziel des niedermolekularen Inhibitors zu erhalten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Gesamtwirkung bestimmter Biofilminhibitoren auf die Biofilmentwicklung und die Antibiotikaresistenz analysieren können.