Definieren von Substratspezifität für Lipase und Phospholipase-Kandidaten

Viele vorhergesagte (Phospho)lipasen sind hinsichtlich ihrer Substratspezifitäten und physiologischen Funktionen schlecht charakterisiert. Hier stellen wir ein Protokoll zur Verfügung, um die Enzymaktivitäten zu optimieren, nach natürlichen Substraten zu suchen und physiologische Funktionen für diese Enzyme vorzuschlagen.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Detektion physiologischer Substrate für potentielle Lipasen und Phosopholipasen zu beschleunigen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Entomologie zu beantworten, z. B. wie Phospholipasen zum Lipidumbau in biologischen Membranen beitragen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Optimierung der enzymatischen Aktivität und die Suche nach dem natürlichen Substrat für das Enzym unabhängig voneinander durchgeführt werden können.

Obwohl diese Methode einen Einblick in die Substratspezifität von bakteriellen Lipasen und Phospholipasen geben kann, kann sie auch modifiziert werden, um Hydrolasen anderer Modellorganismen zu untersuchen. Die Idee zu dieser Methode hatten wir erstmals, als wir nach einer Enzymaktivität suchten, die das intrinsische Membranlipid Phosphatidylcholin Inorhizobium meliloti abbauen kann. Um zellfreie Proteinextrakte herzustellen, tauen Sie bakterielle Zellsuspensionen auf und lagern Sie sie auf Eis.

Führen Sie dann die Zellsuspensionen dreimal mit 20.000 Pfund pro Quadratzoll durch eine Kaltdruckzelle. Entfernen Sie die intakten Zellen und Zelltrümmer durch Zentrifugation bei 5.000 g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Nach der Zentrifugation werden Aliquots von 100 und 500 Mikrolitern aus dem Überstand für die anschließende Analyse vorbereitet.

Richten Sie den zuvor optimierten Enzymassay unter Verwendung der Pipettierschemata ein, die im Textprotokoll tabellarisch aufgeführt sind. Für eine erste Abdeckung unterschiedlicher Enzymaktivitäten verwenden Sie künstliche Substrate, die bei der Hydrolyse ein farbiges Produkt ergeben, wie z. B. para-Nitrophenol oder PNP-Derivate. Verfolgen Sie den Zeitverlauf für eine Erhöhung der Absorption bei 405 Nanometern, die durch die Bildung von PNP in einem Spektralphotometer bei 30 Grad Celsius über einen Zeitraum von fünf Minuten entsteht.

Führen Sie abschließend Berechnungen durch, wie im Textprotokoll beschrieben. Für die Radiomarkierung von Lipiden wird eine Vorkultur eines Organismus von Interesse über Nacht in fünf Millilitern des gewünschten Kulturmediums vorbereitet und bei 30 Grad Celsius gezüchtet. Aus der Vorkultur wird in einem 100-Millimeter-Kulturkolben in 20 Millimeter frisches Medium eingeimpft, um eine anfängliche optische Dichte bei 620 Nanometern von 0,3 für die Kultur zu erhalten.

Als nächstes wird ein Ein-Milliliter-Aliquot der Kultur unter sterilen Bedingungen in ein steriles 14-Milliliter-Polystyrol-Rundbodenröhrchen überführt. Geben Sie eine Mikrocurie 114 c Acetat in die Ein-Milliliter-Kultur. Dann inkubieren Sie die Flüssigkultur unter Rühren bei 30 Grad Celsius für einen Zeitraum von 24 Stunden.

Am Ende der Inkubationszeit wird die Kultur in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt und fünf Minuten lang bei 12.000 g bei Raumtemperatur zentrifugiert. Suspendieren Sie das Pellet in 100 Mikrolitern Wasser. Lagern Sie die Zellsuspension zu diesem Zeitpunkt bei minus 20 Grad Celsius oder fahren Sie sofort mit der Extraktion der polaren Lipide fort.

Um die Extraktion polarer Lipide durchzuführen, fügen Sie 375 Mikroliter eines zwei zu eins Methanols in Chloroformlösung zu den 100 Mikrolitern wässriger Zellsuspension hinzu. Die Probe wird 30 Sekunden lang vortexiert, bevor sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert wird. Nach der Inkubation fünf Minuten lang bei 12.000 g bei Raumtemperatur zentrifugieren.

Übertragen Sie dann den Überstand in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie anschließend 125 Mikroliter Chloroform und 125 Mikroliter Wasser in den Überstand. Nach 30 Sekunden Vortexen wird die Probe eine Minute lang bei 12.000 g bei Raumtemperatur zentrifugiert.

Übertragen Sie die untere Chloroformphase in ein frisches Röhrchen. Trocknen Sie dann die Lösung mit einem Strom Stickstoffgas. Löse die getrockneten Lipide in 100 Mikrolitern Chloroform in Methanollösung auf.

Für die Trennung von neutralen polaren Lipiden durch Dünnschichtchromatographie tragen Sie drei Mikroliter-Aliquots der Lipidproben auf ein Hochleistungs-Dünnschichtchromatographie-Kieselgel-Aluminiumblech auf, beginnend zwei Zentimeter von den Rändern der Platte. Werden mehrere Proben in der eindimensionalen Chromatographie analysiert, ist ein Abstand von mindestens 1,5 Zentimetern zwischen den verschiedenen Probenapplikationspunkten einzuhalten. Übertragen Sie die mobile Phase in eine DC-Entwicklungskammer, die innen mit Chromatographiepapier beschichtet ist.

Mit einer Glasplatte abdecken, um die Kammer 30 Minuten lang sättigen zu lassen. Übertragen Sie das HPTLC Silica Gel Aluminiumblech mit den getrockneten Lipidproben in die Kammer. Lassen Sie die Platte 30 Minuten in einer geschlossenen Kammer entstehen, bevor Sie die Platte entfernen.

Lassen Sie dann die Lösungsmittel zwei Stunden lang in einer Strömungshaube trocknen. Sobald das entwickelte DC-Blatt trocken ist, inkubieren Sie es mit einem photostimulierenden Lumineszenzsieb in einer geschlossenen Kassette für drei Tage. Setzen Sie dann den inkubierten Bildschirm einem PSL-Scanner aus und nehmen Sie ein virtuelles Bild der abgetrennten radioaktiv markierten Lipide auf.

Um die Lipaseaktivität von Diacylglycerin oder DAG zu bestimmen, geben Sie zunächst 5.000 CPM 14 C-markiertes DAG in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie außerdem eine Lösung von Triton X-100 in das Röhrchen und mischen Sie es durch Vortex. Trocknen Sie die Lösung unter einem Stickstoffstrahl.

Für einen abschließenden 100-Mikroliter-Assay fügen Sie Tris-HCl-Puffer, eine Natriumchloridlösung und bi-destilliertes Wasser hinzu. Vortex für fünf Sekunden. Initiieren Sie die Reaktion, indem Sie der Lösung fünf Mikroliter Enzym hinzufügen.

Inkubieren Sie die Lösung vier Stunden lang bei 30 Grad Celsius. Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 250 Mikrolitern Methanol und 125 Mikrolitern Chloroform, bevor Sie Lipide extrahieren, wie weiter oben in diesem Video beschrieben. Fahren Sie mit der Analyse neutraler polarer Lipide durch 1DTLC und anschließender PSL-Bildgebung wie zuvor fort.

Obwohl die vorhergesagte Phosopholipase SMc01003 eine Aktivität mit künstlichen para-Nitrophenol-Acylestern zeigt, ist die Aktivität nur doppelt oder dreimal so hoch wie die Hintergrundaktivität in zellfreien Extrakten von Escherichia coli, in denen kein fremdes Gen exprimiert wurde. Dies deutet darauf hin, dass para-Nitrophenylacylester keine guten Substrate für SMc01003 zu sein scheinen. Während zellfreie Extrakte aus E.Coli Diacylglycerin nicht abbauen können, führten Extrakte aus Stämmen, in denen die vorhergesagte Phospholipase, SMc01003, exprimiert wurde, zu einem Abbau von Diacylglycerin.

Obwohl SMc01003 als Phospholipase vorhergesagt wurde, handelt es sich tatsächlich um eine Diacylglycerin-Lipase, die Diacylglycerin zu Monoacylglycerin und einer Fettsäure abbaut. Anschließend baut es Monoacylglycerin weiter zu Glycerin und einer weiteren Fettsäure ab. Einmal gemeistert, kann diese Technik in ein paar Wochen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Enzymaktivitäten von Lipasen und Phospholipasen optimieren und wie Sie mit der Suche nach ihren physiologischen Substraten fortfahren können. Ein entscheidender Vorteil dieses Verfahrens besteht darin, dass die Optimierung der Enzymaktivität von der Suche nach dem natürlichen Enzymsubstrat getrennt werden kann. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit organischen Lösungsmitteln oder radioaktiven Substanzen äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer die erforderlichen Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten.