Name: Definieren von Substratspezifität für Lipase und Phospholipase-Kandidaten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Lernen Sie eine Methode zur Optimierung von Lipasen und Phospholipasen sowie zur Identifizierung ihrer physiologischen Substrate. Dieses Verfahren ermöglicht die unabhängige Optimierung der enzymatischen Aktivität und liefert Einblicke in die Substratspezifität bakterieller Enzyme.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus Consejo Nacional de Ciencias y Tecnología-México (CONACyT-Mexico) (82.614, 153.998, 253.549 und 178.359 in Investigación Científica Básica sowie 118 in Investigación en Fronteras de la Ciencia) und von Dirección General de unterstützt Asuntos de Personal Académico-Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM DGAPA-; PAPIIT IN202616, IN203612).

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

In den letzten 20 Jahren haben die Genome vieler Organismen sequenziert worden, und obwohl eine Fülle von Daten Genomsequenz generiert wurde, ist funktionale Auslegung Rückstand und damit behindert unser Verständnis der Genomfunktion. Genfunktionen in Genomen basieren häufig auf Ähnlichkeit mit Genen bekannter Funktion oder Auftreten von konservierten Motive zugeordnet. Jedoch ist die genaue Funktion eines bestimmten Gens häufig nicht bekannt. Insbesondere vorhergesagte strukturelle Gene für Enzyme können nicht leicht d...

Glycerol-basierten Lipiden wie Triglyceriden und (glycero) Phospholipide sind wichtige und wohl die bekanntesten Lipidklassen 1. Triacylglycerolen (TAGs) sind Fette oder Öle, die üblicherweise als Speicherlipiden funktionieren und daher als potentielle Energie und Kohlenstoffquellen. TAGs können durch Lipasen abgebaut werden, die häufig durch den produzierenden Organismus ausgeschieden werden externe TAGs zu verdauen und sie als Kohlenstoffquellen zur Verfügung zu stellen. Auch wurden Lipasen weit über die Jahre studiert aufgrund ihrer wichtigen biotechnologischen Anwendungen 2. Auf Grund ihrer amphiphilen Natur und ihrer nahezu zylindrischen Form, (glycero) Phospholipide weisen membranbildenden Eigenschaften und in der Regel die Hauptlipidkomponenten einer doppelschichtigen Membran 3 bilden. In einfachen Mikroorganismen wie dem Bakterium Escherichia coli, nur drei Hauptkopfgruppe Varianten, Phosphatidylglycerin (PG), Cardiolipin (CL) und phosphatidylethanolamine (PE) angetroffen werden , obwohl man sich bewusst sein sollte , dass jeder von ihnen kann 4 mit einer beträchtlichen Anzahl unterschiedlicher Fettacylketten an der sn - 1 oder sn - 2 - Position, die zu einer großen Anzahl von verschiedenen molekularen Spezies ersetzt werden . Andere Bakterien könnten haben andere Phospholipide zusätzlich oder statt. Zum Beispiel Sinorhizobium meliloti, ein Bodenbakterium, das mit der Leguminosen Luzerne (Medicago sativa) , um eine Stickstoff-fixierenden Knöllchen Symbiose zu bilden, enthält zusätzlich zu PE ein zweites zwitterionisches Phospholipid, Phosphatidylcholin (PC) 5 in der Lage ist. Auch Lipide nicht, die Phosphor oder Glycerin können amphiphile und bilden einen Teil der Zellmembran sein. Beispielsweise von Phosphor beschränkende Wachstumsbedingungen in S. meliloti, (glycero) Phospholipide sind weitgehend durch Membranlipide ersetzt , die nicht Phosphor enthalten, dh Sulfolipide, Ornithin Lipide und diacylglyceryl trimethylhomoserine (DGTS) 6. In Bakterien ist DGTS von Diacylglycerin (DAG) in einem zweistufigen Weg gebildet 7 , aber die Quelle für DAG Generation war nicht klar. Pulse-Chase - Experimente vorgeschlagen , dass PC ein Vorläufer für 8 DGTS sein könnte und mit Hilfe der Methodik in diesem Manuskript beschrieben wir eine Phospholipase C identifizieren konnte (PLCP, SMc00171) , die unter Phosphor einschränkenden Bedingungen gebildet wird , und die PC in DAG umwandeln und Phosphocholin 8. In einer separaten Studie entdeckten wir , dass eine Acyl-CoA - Synthetase (FADD) defizienten Mutante von S. meliloti oder von Escherichia coli freien Fettsäuren akkumuliert , wenn 9 stationären Wachstumsphase eintritt. Obwohl diese Fettsäuren schienen von Membranlipiden abgeleitet werden, die genaue Quelle für die freien Fettsäuren oder die Enzym (e) zu befreien, sie waren nicht bekannt. Auch in diesem Manuskript die Strategie skizziert den Einsatz, zwei Patatin-like 10 (phospho) Lipasen (SMc00930 und SMc01003), die zur Bildung von freien Fettsäuren in S. beigetragen meliloti 11 vorhergesagt wurden. Überraschenderweise verwendet SMc01003 DAG als Substrat Umwandlung in Monoacylglycerin und schließlich 11 Glycerin und freien Fettsäuren. Daher ist SMc01003 eine DAG-Lipase (DGLA). Obwohl eine Reihe von Algorithmen zur Vorhersage Potential (phospho) sind Lipasen 12,13, deren genaue Funktion und physiologische Rolle ist in der Regel nicht bekannt. Hier beschreiben wir ein Protokoll, zu klonen und überexprimiert vorhergesagt oder Potential (phospho) Lipasen. Diese Handschrift wird erläutert, wie Enzymassays können unter Verwendung von künstlichen chromogene Substrate für die überexprimiert (phospho) Lipase entwickelt und optimiert werden. Wir liefern Beispiele, wie mit einem optimierten Enzymtest die reale (phospho) Lipasesubstrats begegnet werden kann und wie diese Erkenntnisse könnten unser Verständnis der mikrobiellen Physiologie bereichern.

<table><tbody><tr><td>Chloroform</td><td>JT Baker</td><td>9180-03 DC-Analyse</td><td>& Lipidextraktion</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>JT Baker</td><td>9070-03 DC-Analyse</td><td>& Lipidextraktion</td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>JT Baker</td><td>9507-05 DC-Analyse</td><td>& Lipidextraktion</td></tr><tr><td>Hexane</td><td>JT Baker</td><td>9309-02 DC-Analyse</td><td>& Lipidextraktion</td></tr><tr><td>Diethylether</td><td>Sigma</td><td>32203</td><td>Enzymatische Assays</td></tr><tr><td>bidistilliertes Wasser</td><td>&nbsp; BELIEBIG&</td><td>nbsp; NA</td><td>Enzymatische Assays</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma</td><td>T-1503</td><td>Enzymatische Assays</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Baker</td><td>9535-02</td><td>Enzymatische Assays</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Baker</td><td>3624-01</td><td>Enzymatische Assays</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X-100</td><td>Enzymatische Assays</td></tr><tr><td>LB Bouillon</td><td>ANY</td><td>NA</td><td>Bakterienwachstum, 10 g Trypton + 5 g Hefeextrakt + 10 g NaCl pro Liter bidestilliertes Wasser</td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>211705</td> Extrakt aus <td>bakteriellem Wachstum</td></tr><tr><td>Hefe</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>212750</td><td>Bakterienwachstum</td></tr><tr><td>TY Brühe</td><td>ANY</td><td>NA</td><td>Bakterienwachstum, 8 g Trypton + 3 g Hefeextrakt + 66 mg CaCl2&#183; 2H2O pro Liter bidestilliertem Wasser</td></tr><tr><td>CaCl2&#183; 2H2</td><td>O Baker</td><td>1332-01</td><td>Enzymatische Assays</td></tr><tr><td>Isopropyl-&beta;-D-Thiogalactosid (IPTG)</td><td>Invitrogen</td><td>15529-019</td><td>Bakterienwachstum</td></tr><tr><td>Diethanolamin</td><td>Sigma</td><td>D-8885</td><td>Enzymatische Assays</td></tr><tr><td>MnCl2</td><td>Sigma</td><td>221279</td><td>Enzymatische Assays</td></tr><tr><td>Phospholipase A2 Schlange venom</td><td>Sigma</td><td>P0790</td><td>Enzymatische Assays</td></tr><tr><td>Phospholipase C Clostridium perfringens</td><td>Sigma</td><td>P7633</td><td>Enzymatische Assays</td></tr><tr><td>Bis-p-Nitrophenylphosphat</td><td>Sigma</td><td>07422AH</td><td>Enzymatische Assays</td></tr><tr><td>p-Nitrophenylstearat</td><td>Sigma</td><td>N3627</td><td>Enzymatische Assays</td></tr><tr><td>p-Nitrophenyldodecanoat</td><td>Sigma</td><td>61716</td><td>Enzymatische Assays</td></tr><tr><td>p-Nitrophenyldecanoat</td><td>Sigma</td><td>N0252</td><td>Enzymatische Assays</td></tr><tr><td>p-Nitrophenylpalmitat</td><td>Sigma</td><td>N2752</td><td>Enzymatische Assays</td></tr><tr><td>p-Nitrophenylbutyrat</td><td>Sigma</td><td>N9876</td><td>Enzymatische Assays</td></tr><tr><td>p-Nitrophenyloctanoat</td><td>Sigma</td><td>21742</td><td>Enzymatische Assays</td></tr><tr><td>Essigsäure, Natriumsalz [1-14C]</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEC084</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>JT Baker</td><td>9224-01</td><td>Enzymatische Assays</td></tr><tr><td>Aluminium HPTLC Kieselgel 60 Platten. Kieselgel-HPTLC-Platten im Format 20 x 20 cm, 25 Blatt.</td><td>Merck</td><td>105547</td><td>TLC-Analyse & </td></tr><tr><td>Lipidextraktionsspektrometer UV/VIS Lambda 35</td><td>Perkin Elmer</td><td>NA</td><td>Enzymatische Assays</td></tr><tr><td>Storm 820 Phosphorimager</td><td>Molecular Dynamics</td><td>NA</td><td>Photostimulierbarer Lumineszenzscanner</td></tr><tr><td>Mehrzweck-Szintillationszähler</td><td>Beckman Coulter</td><td>NA</td><td>Radioaktivitätsquantifizierung</td></tr><tr><td>Französische Druckzelle</td><td>ThermoSpectronic</td><td>NA&nbsp;</td><td>Bruch von Zellen</td></tr><tr><td>Chromatographie-Papier 3MM Chr</td><td>Whatman</td><td>3030917</td><td>TLC analysis</td></tr><tr><td>Sinorhizobium meliloti 1021unsere</td><td>Referenz 11</td><td></td><td>untersuchte Stamm</td></tr><tr><td>Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS Kompetente Zellen</td><td>Novagen</td><td>69451</td><td>Proteinexpression</td></tr><tr><td>Stamm pET9a Vektor</td><td>Novagen</td><td>69431</td><td>Proteinexpressionsvektor</td></tr><tr><td>pET17b-Vektor</td><td>Novagen</td><td>69663</td><td>Proteinexpressionsvektor</td></tr><tr><td>steriles Polystyrol-Rundbodenröhrchen (14 ml) Falcon</td><td>Becton Dickinson</td><td>352057</td><td>Radiomarkierung von Bakterienkulturen</td></tr><tr><td>Polypropylen-Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 ml)</td><td>Eppendorf</td><td>30125.15</td><td>Enzymatische Assays</td></tr><tr><td>1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycerol</td><td>Sigma</td><td>D9135</td><td>Lipidstandard</td></tr><tr><td>L-&alpha;-phosphatidylcholin, Dipalmitoyl</td><td>Sigma</td><td>P6267</td><td>Lipidstandard</td></tr><tr><td>DL-&alpha;-Monopalmitin</td><td>Sigma</td><td>M1640</td><td>Lipidstandard</td></tr><tr><td>Palmitinsäure</td><td>Sigma</td><td>P0500</td><td>Lipidstandard</td></tr></tbody></table>

definieren von substratspezifität für lipase und phospholipase-kandidaten

Defining Substrate Specificities for Lipase and Phospholipase Candidates

Mikroorganismen produzieren ein breites Spektrum von (phospho) Lipasen, die um sezerniert werden für den Organismus externe Substrate zur Verfügung zu stellen. Alternativ können andere (phospho) Lipasen physikalisch mit dem produzierenden Organismus verursacht einen Umsatz von intrinsischen Lipiden assoziiert sein können und häufig zu einem Remodeling der Zellmembranen führt. Obwohl Potential (phospho) Lipasen mit einer Anzahl von Algorithmen vorhergesagt werden, wenn das Gen / Protein-Sequenz verfügbar ist, experimentelle Nachweis der Enzymaktivitäten, Substratspezifitäten, und potentielle physiologische Funktionen ist häufig nicht erhalten werden. Dieses Manuskript beschreibt die Optimierung der Testbedingungen für Interessenten (phospho) Lipasen mit unbekannten Substratspezifität und wie diese optimierten Bedingungen bei der Suche nach dem natürlichen Substrat eines jeweiligen (phospho) Lipase zu verwenden. Mit künstlichen chromogene Substrate, wie p - Nitrophenyl - Derivate, kann dazu beitragen , eine kleinere zu erkennenenzymatische Aktivität für eine vorhergesagte (phospho) Lipase unter Standardbedingungen. Eine solche geringfügige enzymatische Aktivität angetroffen wird, können die unterschiedlichen Parameter einer Enzymassay, um einen effizienteren Hydrolyse des künstlichen Substrat zu erhalten, variiert werden. Nachdem die Bedingungen arbeitet ein Enzym gut unter denen sie festgestellt haben, sollte eine Vielzahl von potentiellen natürlichen Substrate für deren Abbau getestet werden, ein Prozess, der verschiedene chromatographische Methoden gefolgt Einsatz werden können. Die Definition von Substratspezifitäten für neue Enzyme, liefert oft Hypothesen für eine mögliche physiologische Rolle dieser Enzyme, die dann experimentell überprüft werden kann. Nach diesen Richtlinien, konnten wir eine Phospholipase C (SMc00171) , die Phosphatidylcholin, für den Umbau von Membranen in dem Bakterium Sinorhizobium meliloti auf phosphor limitierenden Bedingungen des Wachstums in einem entscheidenden Schritt phosphocholin und Diacylglycerin verschlechtert zu identifizieren. Für zwei vorhergesagten patatin-wie Phospholipasen (SMc00930 und SMc01003) des gleichen Organismus, könnten wir ihre Substratspezifität neu zu definieren und zu klären, dass SMc01003 ein Diacylglycerol Lipase ist.

Aktivität von PC-spezifische Phospholipase C SMc00171 mit Bis- p - Nitrophenylphosphat Zellfreie Extrakte von E. erhalten coli BL21 (DE3) pLysS x, die smc00171 hatte ausgedrückt, wurden auf ihre Fähigkeit untersucht bis- p - Nitrophenylphosphat Ester zu hydrolysieren, eine spektrophotometrische enzymatischen Assay unter Verwendung M...

Viele vorhergesagte (Phospho)lipasen sind hinsichtlich ihrer Substratspezifitäten und physiologischen Funktionen schlecht charakterisiert. Hier stellen wir ein Protokoll zur Verfügung, um die Enzymaktivitäten zu optimieren, nach natürlichen Substraten zu suchen und physiologische Funktionen für diese Enzyme vorzuschlagen.

Definieren von Substratspezifität für Lipase und Phospholipase-Kandidaten

Microorganisms produce a wide spectrum of (phospho)lipases that are secreted in order to make external substrates available for the organism. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, den Nachweis physiologischer Substrate für potenzielle Lipasen und Phospholipasen zu beschleunigen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Entomologie zu beantworten, beispielsweise wie Phospholipasen zur Umbildung von Lipiden in biologischen Membranen beitragen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die Optimierung der enzymatischen Aktivität und die Suche nach dem natürlichen Substrat des Enzyms unabhängig voneinander durchgeführt werden können.Obwohl diese Methode Einblicke in die Substratspezifität bakterieller Lipasen und Phospholipasen ermöglichen kann, lässt sie sich auch anpassen, um Hydrolasen anderer Modellorganismen zu untersuchen. Die Idee zu dieser Methode entstand ursprünglich, als wir nach einer Enzymaktivität suchten, die das intrinsische Membranlipid Phosphatidylcholin in Rhizobium meliloti abbauen kann. Zum Herstellen zellfreier Proteinextrakte tauen Sie bakterielle Zellsuspensionen auf und lagern sie auf Eis.Anschließend die Zellsuspensionen dreimal durch eine kalte Druckzelle bei 20.000 Pfund pro Quadratzoll leiten. Intakte Zellen und Zelltrümmer durch Zentrifugation bei 5.000 × g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius entfernen. Nach der Zentrifugation Aliquote von 100 und 500 Mikrolitern aus dem Überstand für die nachfolgende Analyse anfertigen.Richten Sie den zuvor optimierten Enzymassay unter Verwendung der im Textprotokoll tabellierten Pipettierschemata ein. Verwenden Sie für eine erste Erfassung unterschiedlicher Enzymaktivitäten künstliche Substrate, die bei der Hydrolyse ein farbiges Produkt liefern, wie beispielsweise Para-Nitrophenol- oder PNP-Derivate. Verfolgen Sie den zeitlichen Verlauf der Zunahme der Absorption bei 405 Nanometern, die durch die Bildung von PNP im Spektrophotometer bei 30 Grad Celsius über einen Zeitraum von fünf Minuten verursacht wird.Schließlich führen Sie die Berechnungen wie im Textprotokoll beschrieben durch. Für die Radioisotopenmarkierung von Lipiden bereiten Sie eine Übernachtkultur eines interessierenden Organismus in fünf Millilitern des gewünschten Kulturmediums vor und kultivieren bei 30 Grad Celsius. Inokulieren Sie aus der Vorkultur in 20 Milliliter frisches Medium in einem 100-Millimeter-Kulturkolben, um eine initiale optische Dichte bei 620 Nanometern von 0,3 für die Kultur zu erreichen.Überführen Sie anschließend ein ein Milliliter umfassendes Aliquot der Kultur unter sterilen Bedingungen in ein 14-Milliliter-Sterilröhrchen aus Polystyrol mit rundem Boden. Geben Sie eine Mikrocurie 114 c Acetat zur ein Milliliter großen Kultur hinzu. Inkubieren Sie anschließend die flüssige Kultur unter Schütteln bei 30 Grad Celsius über einen Zeitraum von 24 Stunden.Am Ende der Inkubationszeit die Kultur in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen und bei Raumtemperatur mit 12.000 × g für fünf Minuten zentrifugieren. Den Pellet in 100 Mikrolitern Wasser resuspendieren. An diesem Punkt die Zellsuspension bei minus 20 Grad Celsius lagern oder unmittelbar mit der Extraktion polarer Lipide fortfahren.Um die polaren Lipide zu extrahieren, geben Sie 375 Mikroliter einer 2:1-Methanol:Chloroform-Lösung zu 100 Mikrolitern wässriger Zellsuspension hinzu. Vortexen Sie die Probe 30 Sekunden lang, bevor Sie sie fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie fünf Minuten bei 12.000 × g und Raumtemperatur.Anschließend den Überstand in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Danach 125 Mikroliter Chloroform und 125 Mikroliter Wasser zum Überstand hinzufügen. Nach 30 Sekunden Vortexen die Probe eine Minute bei 12.000 × g bei Raumtemperatur zentrifugieren.Überführen Sie die untere Chloroformphase in ein frisches Gefäß. Anschließend trocknen Sie die Lösung mit einem Strom aus Stickstoffgas. Lösen Sie die getrockneten Lipide in 100 Mikrolitern einer Chloroform-zu-Methanol-Lösung auf.Für die Trennung neutraler polarer Lipide mittels Dünnschichtchromatographie werden dreimikroliter-Aliquote der Lipidproben auf ein Hochleistungs-Dünnschichtchromatographie-Plättchen aus Silicagel auf Aluminiumträger aufgetragen, wobei zwei Zentimeter vom Rand der Platte entfernt begonnen wird. Werden mehrere Proben in eindimensionaler Chromatographie analysiert, ist ein Abstand von mindestens 1,5 Zentimetern zwischen den verschiedenen Probenauflagepunkten einzuhalten. Die mobile Phase wird in eine TLC-Entwicklungs­kammer überführt, die innen mit Chromatographiepapier beschichtet ist.Mit einer Glasplatte abdecken, damit die Kammer 30 Minuten lang sättigen kann. Die HPTLC-Kieselgelschicht auf Aluminiumträger mit den getrockneten Lipidproben in die Kammer überführen. Die Platte 30 Minuten lang in einer geschlossenen Kammer wandern lassen, bevor sie herausgenommen wird.Anschließend lassen Sie die Lösungsmittel zwei Stunden lang in einer Ablufthaube verdunsten. Sobald das entwickelte TLC-Blatt trocken ist, inkubieren Sie es drei Tage lang zusammen mit einem photostimulierbaren Leuchtschirm in einer geschlossenen Kassette. Danach belichten Sie den inkubierten Schirm in einem PSL-Scanner und gewinnen ein virtuelles Bild der getrennten radioaktiv markierten Lipide.Um die Diacylglycerol- oder DAG-Lipaseaktivität zu bestimmen, geben Sie zunächst 5.000 CPM 14C-markiertes DAG in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie außerdem eine Lösung von Triton X-100 zum Röhrchen und mischen Sie durch Vortexen. Trocknen Sie die Lösung unter einem Strom von Stickstoff ein.Für ein endgültiges 100-Mikroliter-Assay fügen Sie Tris-HCl-Puffer, eine Natriumchloridlösung und zweifach destilliertes Wasser hinzu. Vortexen Sie fünf Sekunden lang. Starten Sie die Reaktion durch Zugabe von fünf Mikrolitern Enzym zur Lösung.Die Lösung vier Stunden lang bei 30 Grad Celsius inkubieren. Die Reaktion durch Zugabe von 250 Mikrolitern Methanol und 125 Mikrolitern Chloroform stoppen, bevor die Lipide wie zuvor in diesem Video beschrieben extrahiert werden. Anschließend die neutralen polaren Lipide mittels 1D-Dünnschichtchromatographie und nachfolgender PSL-Bildgebung analysieren.Obwohl die vorhergesagte Phospholipase SMc01003 Aktivität mit künstlichen para-Nitrophenol-Acylestern zeigt, liegt die Aktivität nur doppelt bis dreimal über der Hintergrundaktivität in zellfreien Extrakten von Escherichia coli, in denen kein Fremdgen exprimiert worden war. Dies deutet darauf hin, dass para-Nitrophenyl-Acylester offenbar keine geeigneten Substrate für SMc01003 sind. Während zellfreie Extrakte von E. coli Diacylglycerin nicht abbauen können, führten Extrakte von Stämmen, in denen die vorhergesagte Phospholipase SMc01003 exprimiert worden war, zum Abbau von Diacylglycerin.Obwohl vorhergesagt wurde, dass SMc01003 eine Phospholipase ist, handelt es sich tatsächlich um eine Diacylglycerol-Lipase, die Diacylglycerol in Monoacylglycerol und eine Fettsäure abbaut. Anschließend wird Monoacylglycerol weiter zu Glycerin und einer weiteren Fettsäure abgebaut. Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb weniger Wochen durchgeführt werden.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Enzymaktivitäten von Lipasen und Phospholipasen optimiert und wie man anschließend die Suche nach ihren physiologischen Substraten fortsetzt. Ein entscheidender Vorteil dieses Verfahrens besteht darin, dass die Optimierung der Enzymaktivität von der Suche nach dem natürlichen Enzymsubstrat getrennt werden kann. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit organischen Lösungsmitteln oder radioaktiven Substanzen äußerst gefährlich sein kann, und dass stets die erforderlichen Sicherheitsvorkehrungen getroffen werden sollten, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

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