Identifikation von Kinase-Substrat-Pairs Mit High Throughput Screening

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Kinase-Enzyme zu identifizieren, die ein Substrat der Wahl phosphorylieren, wobei Methoden des Hochdurchsatz-Screenings verwendet werden. Dies wird zunächst erreicht, indem Zellen mit Plasmiden transfiziert werden, die Kinase-FU-Proteine als Glutathion-S-Transferase oder GST exprimieren. Der zweite Schritt besteht in der Durchführung eines GST-Kinase-Pulldowns.

Anschließend werden die Proben in Gele geladen, die dann durchlaufen und mit Kumasi-Bright-Blue-Färbemittel gefärbt werden. Der letzte Schritt besteht darin, die Gele zu trocknen und sie einer Autoradiographiefolie auszusetzen. Letztendlich kann man durch die Entwicklung und Interpretation der resultierenden Filme Kinase-Substrat-Paare identifizieren, da jede Spur einem spezifischen Kinase-Assay entspricht.

Bisherige Methoden zur Identifizierung einer Kinase für ein bekanntes phosphoryliertes Substrat umfassen die Verwendung bioinformatischer Ansätze zur Suche nach einer Konsensusstelle im Substrat, die Detektion von Komplexen zwischen Kinase und Substraten mittels biochemischer Techniken sowie einen Versuchs-und-Irrtum-Ansatz, sowie die Suche nach Konsenssubstraten auf der Grundlage ihrer bekannten biologischen Funktion. Diese Ansätze sind zeitaufwändig und führen nicht immer zum Erfolg. Unser Ansatz ermöglicht die schnelle Identifizierung von Kinase-Substrat-Paaren auf der Grundlage funktioneller Ergebnisse.

Als wir erstmals die Idee für diese Methode hatten, waren wir besorgt, dass die Spezifität in vitro unzureichend sein könnte. Tatsächlich ist die Substratspezifität hervorragend, und wir stellen oft fest, dass nur verwandte Kinasen einer Familie in der Lage sind, ein bestimmtes Substrat im Screening zu phosphorylieren. Dies zeigt sich besonders deutlich, wenn wir mehrere Substrate in jedem Screening multiplexen, was belegt, dass das Verfahren funktioniert. Courtney, eine Technikerin aus meinem Labor, beginnt das Verfahren mit der Vorbereitung der Reagenzien, Platten und Zellen, wie im textbasierten Protokoll beschrieben.

Wenn Platten mit Kinase-Plasmiden eingefroren wurden, diese bei Raumtemperatur auftauen und dreimal für drei Minuten mit 1900 × g zentrifugieren, um Feuchtigkeit am Boden der Vertiefungen zu sammeln. 8,6 Milliliter Medium mit reduziertem Serumanteil mit 312,7 Mikrolitern lipidbasiertem Transfektionsreagenz vermischen und die Mischung fünf Minuten lang ruhen lassen, um sie anschließend jeder Vertiefung hinzuzufügen. Jeweils 10 Mikroliter des Mediums mit reduziertem Serumanteil zur 96-Loch-Platte mit den Kinase-Plasmiden geben.

Unter Verwendung eines automatischen Flüssigkeitsdispensers mit einer Kleinvolumenkassette anschließend 10 µL des transfezierten Mediums mit reduziertem Serum pro Vertiefung hinzufügen, wobei ein automatischer Flüssigkeitsdispenser mit einer Kleinvolumenkassette verwendet wird, und die Platte 20 bis 45 Minuten ruhen lassen. Danach 293T-Zellen erneut suspendieren, und zwar bei 0,75 Millionen Zellen pro Milliliter in 80 Milliliter vollständigem, modifiziertem Dulbecco’s Minimal Essential Medium oder DMEM, mit jeweils 100 µL der Zellsuspension pro Vertiefung. Unter Verwendung eines automatischen Flüssigkeitsdispensers mit einer Standardvolumenkassette die Vertiefungen unter dem Mikroskop auf gleichmäßige Zellverteilung überprüfen, bevor die Platte für 24 Stunden in einen 37 °C warmen Inkubator zurückgestellt wird.

Um das GST-Kinase-Pull-down-Experiment zu beginnen, stellen Sie eine vier Millimolar Vanadat-Lösung her, indem Sie 60 Mikroliter einer 0,2-Molar-Natriumvanadat-Lösung mit 540 Mikrolitern Wasser in einem zweiten Reaktionsgefäß mischen. Geben Sie außerdem 2,7 Mikroliter einer 30-%igen Peroxidlösung und 1,4 Milliliter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) zusammen. Mischen Sie die beiden Lösungen und lassen Sie das Gemisch vor der Verwendung 15 Minuten lang stehen.

Unter Verwendung einer Mehrkanalpipette zwei Mikroliter einer 0,25-molaren Calciumchloridlösung in jedes Loch geben, gefolgt von 2,5 Mikrolitern der bewährten DNA-Lösung. Jede Platte 10 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren und anschließend auf Eis stellen, wobei die Platten auf Eis verbleiben. Das Medium aus jedem Loch entfernen und sofort 50 Mikroliter kalte Lysepuffer pro Loch unter Vakuum hinzufügen.

Unter Verwendung eines automatischen Flüssigkeitsdispensers, der mit der Standardkassette ausgestattet ist, die Platte 30 Minuten auf Eis stehen lassen, um sie zu lysieren. Nach dem Zentrifugieren der Platten bei 1900 × g für drei Minuten bei vier Grad Celsius die Zellen aus jedem Well mit einer Mehrkanalpipette abkratzen und den gesamten Inhalt in entsprechend beschriftete vbo überführen. Bei 96-Well-Platten die Platten bei 1900 × g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren und während des Zentrifugierens die Glutathion-beschichteten Platten mit je 100 µL eiskallem Lysepuffer pro Well füllen.

Als Spülung die Platten auf Eis stellen. Nach der Zentrifugation der V-Boden-Platten die Glutathion-Platten über einem Ausguss umdrehen, um den Lysepuffer herauszuschütteln, und auf einem Papierhandtuch abtupfen. Den Lysepuffer von den V-Boden-Platten durch Kippen der Platte und unter Verwendung einer Mehrkanalpipette auf die Glutathion-Platten übertragen, wobei darauf geachtet werden muss, das Pellet am Boden nicht aufzuwirbeln.

Anschließend die Platten abdecken und mindestens zwei Stunden auf Eis stellen. Gegen Ende des zweistündigen Bindeschritts eine Radioaktivitätsarbeitsstation vorbereiten und sicherstellen, dass die erforderlichen Sicherheitsvorkehrungen für Arbeiten mit Radioaktivität getroffen sind. Den Hybridisierungsofen auf 30 Grad Celsius einstellen.

Drehen Sie die Glutathion-Platten über einem Ausguss um, um den Lysepuffer herauszuschütteln, und tupfen Sie sie mit einem Papiertuch ab. Spülen Sie die Vertiefungen dreimal mit jeweils 100 Mikrolitern Lysepuffer ohne PMSF aus. Lassen Sie die Vertiefungen nicht austrocknen.

Bewahren Sie sie bis zur Weiterverarbeitung in der Spülung auf. Bereiten Sie anschließend 55 Milliliter eines 1x-Kinasepuffers oder eines 1x kb gemäß der schriftlichen Anleitung vor. Geben Sie mithilfe eines automatisierten Flüssigkeitsdosiersystems, das mit einer Standardvolumenkassette ausgestattet ist, 50 Mikroliter des 1x kb in jedes Loch der Platte.

Dann bereiten Sie Lösung A vor, indem Sie nacheinander eine Lösung herstellen, die das Substrat Ihrer Wahl sowie myelinsäurebindendes Protein oder MVP enthält, wie im Textprotokoll beschrieben. Drehen Sie die Platten über einem Ausguss um, um die Einmal-XKB-Spülung auf ein Papiertuch ablaufen zu lassen, und geben Sie sofort 30 Mikroliter Lösung A hinzu, unter Verwendung eines automatischen Flüssigkeitsdosiersystems mit einer Kleinvolumenkassette. Halten Sie die Platten auf Eis.

Bereiten Sie anschließend Lösung B im Bereich für radioaktive Arbeiten wie im Textprotokoll beschrieben vor, mit 20 Mikroliter Lösung B pro Vertiefung. Geben Sie die Lösung mit einer Mehrfachpipette unter Rühren aufgrund der Ausstoßkraft auf und inkubieren Sie die Platte 30 Minuten lang in einem Hybridisierungsofen bei 30 Grad Celsius. Nach 30 Minuten bringen Sie die Platten zurück auf Eis.

Fügen Sie dann mit einer Mehrkanalpipette 50 Mikroliter zweifach konzentrierter Natrium-SDS-Lysepuffer (SDS-Lysispuffer) in jedes Loch hinzu. Die gesamte Arbeit in diesem Abschnitt sollte in einem Bereich durchgeführt werden, der für radioaktive Arbeiten vorgesehen ist. Schalten Sie den Hybridisierungsofen ein und stellen Sie ihn auf 85 Grad Celsius ein.

Sobald der Ofen die Temperatur erreicht hat, überführen Sie die Platten in den Ofen und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang, um die Proben zu denaturieren. Danach laden Sie 26-Kammern-Vorgegossene Gele mit jeweils 15 Mikrolitern jeder Reaktion.

Bei Verwendung einer Mehrkanalpipette, um mehrere Vertiefungen gleichzeitig zu befüllen, muss darauf geachtet werden, dass alle Spitzen mit den entsprechenden Vertiefungen ausgerichtet sind. Führen Sie das Gel vor dem Hinzufügen der Proben bei 150 Volt laufen. Lassen Sie die blaue Linie nicht vom unteren Rand des Gels laufen, da diese die nicht eingebauten ATP-Moleküle enthält. Zerlegen Sie anschließend die Gele und entfernen Sie die nicht eingebauten ATP-Moleküle, da diese die Belichtung des Gels auf den Filmen verdunkeln würden.

Die Gele in beschriftete Behälter geben und 15 Minuten lang mit Kumasi-Färbemittel bedecken. Anschließend das Kumasi-Färbemittel entfernen. Die Gele kurz mit Wasser spülen und Detektionslösung hinzufügen.

Die Gele solange belassen, bis die Proteine deutlich sichtbar sind. Für jede Probe sollten ein Band für MVP und ein Band für das Substrat sichtbar sein. Um die Gele zu trocknen, ein großes Blatt Filterpapier zuschneiden und auf den Trockner legen.

Befeuchten Sie ein Cellophanblatt mit destilliertem Wasser, bis es glatt und faltenfrei ist, und legen Sie es auf das Papier. Legen Sie die Gele auf das Cellophanblatt und notieren Sie sich die Reihenfolge der Gele. Befeuchten Sie ein zweites Cellophanblatt und legen Sie es auf die Gele.

Entfernen Sie alle Blasen, um eine gleichmäßige Oberfläche zu erhalten. Schließen Sie die Klappe, schalten Sie das Vakuum ein und trocknen Sie die Gele drei Stunden lang bei 80 Grad Celsius. Sobald die Gele getrocknet sind, belichten Sie sie mit einer Doppelschicht-Autoradiographiefolie unter Verwendung eines Verstärkerschirms, um das Signal zu intensivieren.

Verpacken Sie die Kassette mit Frischhaltefolie oder einer Plastiktüte und verschließen Sie sie mit Klebeband, um Frost auszuschließen, bevor Sie die Kassette über Nacht bei minus 80 Grad Celsius lagern. Am folgenden Tag nehmen Sie die Kassette aus dem Gefrierschrank und lassen sie bei Raumtemperatur auftauen. Entwickeln Sie den Film in einem abgedunkelten Raum mithilfe eines Filmprozessors gemäß den vom Hersteller angegebenen Anweisungen.

Hier sind repräsentative Ergebnisse aus einem Screening, bei dem 180 Kinasen untersucht wurden, unter Verwendung eines GST-markierten Peptid-Substrats, das den Aminosäuren 268 bis 283 des durch Kreb regulierten transkriptionellen Coaktivators zwei oder CRTC zwei entspricht, sowie des klassischen Kinase-Assay-Substrats Myelin-Basisches Protein oder MBP nur zwei. Die Kinasen mark zwei und die eng verwandte Kinase mark drei wurden phosphoryliert. Das CRTC-zwei-Peptid MBP ist in allen Assays als interne Kontrolle enthalten, da es zahlreiche phosphorylierbare Reste aufweist und mit 18 Kilodalton nahe dem unteren Rand des Gels läuft.

Dies ermöglicht eine Interpretation der Spezifität. Einige Kinasen phosphorylieren ein Substrat und MVP robust. Bemerkenswert ist hierbei, dass die Vertiefungen mit GST allein stets eine gewisse endogene Kinaseaktivität anreichern.

Daher liegt in dem Assay stets eine Hintergrundphosphorylierung vor. Obwohl dies nicht ausschließt, dass die Phosphorylierung des Substrats real ist, deutet es darauf hin, dass die Kinase im In-vitro-Setting möglicherweise weniger selektiv ist. Es ist besonders aussagekräftig, mehrere Substrate mit unterschiedlichen Molekulargewichten einzubeziehen, um Schlussfolgerungen bezüglich der Substratspezifität der Kinase zu ziehen.

Da der Screen in vitro durchgeführt wird und zusätzliche Komplexitätsebenen in vivo auftreten, muss eine Kinasenkandidatin in Zellen validiert werden. Beispielsweise könnte eine Kinasenkandidatin in vitro in der Lage sein, ein Substrat zu phosphorylieren, jedoch nicht im selben Zelltyp oder in denselben Teilzellen eines Kompartiments wie das Substrat exprimiert sein. Dies erfolgt typischerweise durch RNAi-vermittelte Stilllegung des Kandidaten.

Es ist ebenfalls möglich, einen Sekundärscreen unter Verwendung eines nicht-phosphorylierbaren Mutanten des Substrats durchzuführen, um die Spezifität zu bestätigen.