Identifikation von Kinase-Substrat-Pairs Mit High Throughput Screening

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Kinasen zu identifizieren, die ein Substrat von Interesse mit Hilfe von Hochdurchsatz-Screening-Methoden phosphorylieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Zellen mit Plasmiden durchtrennt werden, die die Kinasen FU bis Glutathion als Transferase oder GST exprimieren. Der zweite Schritt besteht darin, einen GST-Kinase-Pulldown durchzuführen.

Als nächstes werden die Proben in Gele geladen, die dann laufen und mit Kumasi Brilliant Blue Farbstoff gefärbt werden. Der letzte Schritt besteht darin, die Gele zu trocknen und sie einem Autoradiographiefilm auszusetzen. Letztendlich ist man durch die Entwicklung und Interpretation der resultierenden Filme in der Lage, Kinase-Substratpaare zu identifizieren, da jede Spur repräsentativ für einen unterschiedlichen Kinase-Assay ist.

Bestehende Verfahren zur Identifizierung einer Kinase für ein bekanntes phosphoryliertes Substrat umfassen die Verwendung bioinformatischer Ansätze zur Suche nach einer Konsensusstelle im Substrat, das Nachweisen von Komplexen zwischen Kinase und Substraten unter Verwendung biochemischer Techniken und einen Trial-and-Error-Ansatz sowie die Suche nach Conte-Konsensussubstraten auf der Grundlage ihrer bekannten biologischen Funktion. Diese Ansätze sind zeitaufwendig und nicht immer erfolgreich. Unser Ansatz ermöglicht eine schnelle Identifizierung von Kinase-Substratpaaren auf der Grundlage funktioneller Ergebnisse.

Als wir die Idee zu dieser Methode hatten, hatten wir Bedenken, dass es in vitro eine unzureichende Spezifität geben würde. Wie sich herausstellt, ist die Substratspezifität ausgezeichnet und wir stellen oft fest, dass nur Kinasen von Familienmitgliedern in der Lage sind, ein bestimmtes Substrat im Screening zu phosphorylieren. Dies wird besonders deutlich, wenn wir mit mehreren Substraten in jedem Sieb multiplexen, was Courtney, eine Technikerin aus meinem Labor, demonstriert. Beginnen Sie das Verfahren mit der Vorbereitung von Reagenzien, Platten und Zellen, wie im Textprotokoll beschrieben.

Wenn Platten, die Kinase-Plasmide enthalten, eingefroren wurden, tauen Sie sie bei Raumtemperatur auf und zentrifugieren Sie sie drei Minuten lang bei 1900 μG, um die Feuchtigkeit am Boden der Vertiefungen zu sammeln. Mischen Sie 8,6 Milliliter reduziertes Serummedium mit 312,7 Mikrolitern Transfektionsreagenz auf Lipidbasis und lassen Sie die Mischung fünf Minuten lang in jeder Vertiefung einwirken. Von der 96-Well-Platte, die die Kinase-Plasmide enthält, befinden sich 10 Mikroliter des reduzierten Serummediums.

Geben Sie dann mit einem automatischen Flüssigkeitsspender, der mit einer Kassette mit kleinem Volumen ausgestattet ist, 10 Mikroliter des reduzierten Serummedium-Transfektionsreagenzmixes pro Vertiefung hinzu, indem Sie einen automatischen Flüssigkeitsspender verwenden, der mit einer Kassette mit kleinem Volumen ausgestattet ist, und lassen Sie die Platte 20 bis 45 Minuten lang ruhen. Als nächstes werden 2 93 T-Zellen bei 0,75 Millionen Zellen pro Milliliter in 80 Millilitern vollständiger Delcos mit einem modifizierten Medium oder DMEM bei 100 Mikrolitern der Zellsuspension pro Vertiefung reanimationssuspendiert. Überprüfen Sie die Vertiefungen unter einem Mikroskop mit einem automatischen Flüssigkeitsspender, der mit einer Standardvolumenkassette ausgestattet ist, auf eine gleichmäßige Zellverteilung, bevor Sie die Platte für 24 Stunden in einen 37-Grad-Inkubator zurückstellen.

Um das GST-Kinase-Pulldown-Experiment zu starten. Stellen Sie eine Lösung von vier Millimolar pro Vanadat her, indem Sie 60 Mikroliter 0,2 molare Natriumvanadat mit 540 Mikrolitern Wasser in einem zweiten Röhrchen mischen und 2,7 Mikroliter 30% Peroxid und 1,4 Milliliter phosphatgepufferte Kochsalzlösung oder PBS mischen. Fügen Sie die beiden Lösungen zusammen hinzu und lassen Sie die Mischung 15 Minuten einwirken, bevor Sie sie verwenden.

Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette zwei Mikroliter 0,25 molare Calciumchlorid in jede Vertiefung, gefolgt von 2,5 Mikrolitern der bewährten Dattellösung. Inkubieren Sie jede Platte 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und legen Sie sie dann auf Eis, wobei Sie die Platten auf Eis halten. Entfernen Sie das Medium aus jeder Vertiefung mit einem Vakuum von sofort 50 Mikrolitern eiskaltem Lysepuffer pro Vertiefung.

Lassen Sie die Platte mit einem automatischen Flüssigkeitsspender, der mit der Standardkassette ausgestattet ist, 30 Minuten lang auf Eis ruhen, um Läuse zu vermeiden. Nachdem Sie die Platten drei Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 1900 mal G gedreht haben, kratzen Sie die Zellen mit einer Mehrkanalpipette aus jeder Vertiefung ab und übertragen Sie den gesamten Inhalt auf ein entsprechend markiertes vbo. 96-Well-Platten drehen die Platten bei 1900 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius während des Spin-Füllens von Glutathion-beschichteten Platten mit 100 Mikrolitern pro Well eiskaltem Lysepuffer.

Halten Sie die Teller zum Spülen auf Eis. Nach dem Zentrifugieren der Bodenplatten die Glutathionplatten über einer Senke umdrehen, um den Lysepuffer auszuschütteln und auf einem Papiertuch zu tupfen. Übertragen Sie den Lysepuffer von den V-Bodenplatten auf die Glutathionplatten, indem Sie die Platte kippen und eine Mehrkanalpipette verwenden, wobei Sie darauf achten müssen, das Pellet auf dem Boden nicht zu stören.

Decken Sie dann die Teller ab und lassen Sie sie mindestens zwei Stunden auf Eis. Um kurz vor dem Ende des zweistündigen Bindeschritts zu binden, bereiten Sie einen Radioaktivitätsarbeitsplatz vor, der sicherstellt, dass die notwendigen Sicherheitsvorkehrungen für radioaktive Arbeiten getroffen werden. Stellen Sie den Hybridisierungsofen auf 30 Grad Celsius ein.

Drehen Sie die Glutathionplatten über eine Spüle, um den Lysepuffer auszuschütteln und auf einem Papiertuch zu tupfen. Spülen Sie die Vertiefungen dreimal mit 100 Mikrolitern Lysepuffer ohne PMSF. Lassen Sie die Brunnen nicht trocken sitzen.

Bewahren Sie sie in der Spülung auf, bis Sie fortfahren können. Bereiten Sie als nächstes 55 Milliliter eines X-Kinase-Puffers oder eines x kb vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Geben Sie 50 Mikroliter von einem x kb in jede Vertiefung der Platte mit einem automatischen Flüssigkeitsspender, der mit einer Standardvolumenkassette ausgestattet ist.

Bereiten Sie dann Lösung A vor, indem Sie eine Lösung herstellen, die das Substrat von Interesse und das Myelin-Basisprotein oder MVP enthält, wie im Textprotokoll beschrieben, nacheinander. Drehen Sie die Platten über einem Waschbecken um, um die eine XKB-Spülfläche auf einem Papiertuch zu entfernen, und fügen Sie sofort 30 Mikroliter Lösung A hinzu. Verwenden Sie einen automatischen Flüssigkeitsspender, der mit einer Kassette mit kleinem Volumen ausgestattet ist. Bewahren Sie die Teller auf Eis auf.

Als nächstes bereiten Sie Lösung B im Radioaktivitätsarbeitsbereich wie im Textprotokoll beschrieben mit 20 Mikrolitern Lösung B pro Vertiefung vor. Mit einer Repetierpipette, die das Mischen aufgrund der Auswurfkraft erleichtert, wird die Platte in einem 30 Grad Celsius heißen Hybridisierungsofen 30 Minuten lang inkubiert. Nach 30 Minuten die Teller wieder auf Eis legen.

Geben Sie dann mit einer Mehrkanalpipette 50 Mikroliter von zwei x Natriumecclesulfat oder SDS-Lysepuffer in jede Vertiefung. Alle Arbeiten in diesem Abschnitt sollten in einem Bereich durchgeführt werden, der für Funkaktivitäten vorgesehen ist. Schalten Sie den Hybridisierungsofen ein und stellen Sie ihn auf 85 Grad Celsius ein.

Sobald der Ofen die Temperatur erreicht hat, stellen Sie die Platten in den Ofen und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang, um die Proben zu denaturieren. Nächste Ladung. 26 gut vorgefertigte Gele mit 15 Mikrolitern jeder Reaktion.

Bei der Verwendung einer Mehrkanalpipette zum gleichzeitigen Befüllen mehrerer Wells muss darauf geachtet werden, dass alle Spitzen mit den entsprechenden Wells ausgerichtet sind. Bevor Sie die Proben hinzufügen, lassen Sie das Gel bei 150 Volt laufen. Lassen Sie die blaue Linie nicht von der Unterseite des Gels ablaufen, da diese das nicht eingearbeitete A TP enthält. Zerlegen Sie dann die Gele und entfernen Sie das nicht eingearbeitete TP, da es die Gelbelichtung auf den Folien abdunkelt.

Geben Sie die Gele in beschriftete Behälter und bedecken Sie sie 15 Minuten lang mit Kumasi-Fleck. Entfernen Sie als Nächstes den Kumasi-Fleck. Spülen Sie die Gele kurz mit Wasser ab und fügen Sie die Rückhaltelösung hinzu.

Bewahren Sie die Gele auf, bis die Proteine deutlich sichtbar sind. Für jede Probe sollte eine Bande für MVP und eine Bande für das Substrat sichtbar sein. Um die Gele zu trocknen, schneiden Sie ein großes Blatt Filterpapier ab und legen Sie es auf den Trockner.

Befeuchten Sie ein Zellophanblatt mit destilliertem Wasser, bis es glatt und faltenfrei ist, und legen Sie es auf das Papier. Lege die Gele auf die Zellophanfolie und notiere dir die Reihenfolge der Gele. Befeuchten Sie eine zweite Zellophanfolie und legen Sie sie auf die Gele.

Rollen Sie alle Blasen aus, um eine schöne, gleichmäßige Oberfläche zu erhalten. Schließen Sie die Klappe, schalten Sie das Vakuum ein und treiben Sie die Gele drei Stunden lang bei 80 Grad Celsius an. Sobald die Gele trocken sind, setzen Sie sie mit einem Sieb einem Doppelemulsions-Autoradiographiefilm aus, um das Signal zu verstärken.

Wickeln Sie die Kassette mit Frischhaltefolie oder einer Plastiktüte ein und verschließen Sie sie mit Klebeband, um Frost abzuhalten, bevor Sie die Kassette über Nacht bei minus 80 Grad Celsius lagern. Nehmen Sie die Kassette am nächsten Tag aus dem Gefrierschrank und lassen Sie sie bei Raumtemperatur auftauen. Entwickeln Sie den Film in einer Dunkelkammer mit einem Filmprozessor gemäß den gezeigten Anweisungen des Herstellers.

Hier sind repräsentative Ergebnisse aus einem Screening: 180 Kinasen wurden unter Verwendung eines A-GST-markierten Peptidsubstrats, das den Aminosäuren 268 bis 283 entspricht, aus dem kreb-regulierten transkriptionellen Koaktivator zwei oder C RTC zwei sowie dem klassischen Kinase-Assay-Substrat Myelin-Basisprotein oder MBP nur zwei gescreent. Kinasen markieren zwei und die hochverwandte Kinase, Markierung drei, phosphoryliert. Das CRTC-Zwei-Peptid-MBP ist als interne Kontrolle in allen Assays enthalten, da es viele Phosphoryl-zuordenbare Rückstände enthält und mit 18 Kilodalton zum unteren Rand des Gels hin verläuft.

Dies ermöglicht eine Interpretation der Spezifität. Einige Kinasen phosphorylieren ein Substrat und MVP robust. Zu beachten ist hierbei, dass die Vertiefungen, die GST allein enthalten, immer eine gewisse endogene Kinaseaktivität reinigen.

Somit kommt es im Assay immer zu einer Hintergrundphosphorylierung. Dies schließt zwar nicht aus, dass die Phosphorylierung des Substrats real ist, deutet aber darauf hin, dass die Kinase in der In-vitro-Umgebung weniger selektiv sein könnte. Besonders aussagekräftig ist es, mehrere Substrate mit unterschiedlichen Molekulargewichten einzubeziehen, um Rückschlüsse auf die Spezifität des Kinasesubstrats zu ziehen.

Da es sich um ein In-vitro-Screening handelt und in vivo zusätzliche Komplexitätsstufen auftreten, muss eine Kandidatenkinase in Zellen validiert werden. Zum Beispiel kann eine Kandidatenkinase die Fähigkeit haben, ein Substrat in vitro zu phosphorylieren, es kann nicht in demselben Zelltyp oder in denselben Unterzellen eines Kompartiments wie das Substrat exprimiert werden. Dies geschieht in der Regel durch RNAi-vermitteltes Silencing des Kandidaten.

Es ist auch möglich, ein sekundäres Screening mit einer nicht Phosphoryl-zuordenbaren Mutante des Substrats durchzuführen, um die Spezifität zu bestätigen.