Name: Identifikation von Kinase-Substrat-Pairs Mit High Throughput Screening (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Kinase-Substrat-Paare durch Hochdurchsatz-Screening identifizieren. Diese Methode nutzt GST-Kinase-Pulldown und Autoradiographie für die schnelle Analyse von Kinase-Aktivität in Zellsignalwegen.

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Diese Arbeit wurde vom NSERC Zuschuss unterstützt 386634. Wir möchten die Mitglieder des Screaton Lab für hilfreiche Diskussionen danken.

1. Vorbereitung der Reagenzien, Platten und Zellen <ol><li> Bilden 500 ml Lyse-Puffer: 25 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 50 mM NaF, 0,5 mM EDTA pH 8,0, 0,5% Triton X-100, 5 mM beta-Glycerophosphat, 5% Glycerin. Lagerung bei 4 ° C. Unmittelbar vor der Verwendung, fügen Sie 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und 1 mM Natriumvanadat. Nach diesem Schritt wird PMSF in keiner Spülpuffer erforderlich. </li><li> Machen 20 ml 10x Kinase-Puffer: 200 mM Tris pH 7,5, 50 mM beta-Glycerophosphat (FW 216), 2 mM Natriumvanadat. Aliquot in 1-ml-Röhrchen und bei -20 ° C. Unmittelbar vor der Verwendung, fügen Sie 5 mM DTT. </li><li> Machen Sie 20 ml 10x M-ATP-Puffer: 300 um Adenosintriphosphat (ATP), 66 mM MgCl 2, 33 mM MnCl 2 Aliquot in 1-ml-Röhrchen und bei -20 ° C. </li><li> Auf 100 ml 2x Natriumdodecylsulfat (SDS) Lysepuffer: 1,5 g Tris-Base, 20 ml Glycerin, 30 ml H 2 O. Auflösen und pH-Wert auf 6,8 mit HCl. In 40ml 10% SDS, die Lautstärke auf 100 ml. In 25 mg Bromphenolblau. </li><li> Spot 4 ul 25 ng / ul Säuger-Expressionsplasmid ein GST-Kinase 14 pro in Sätze von 96-Well-Platten und Kennzeichenschilder entsprechend kodiert gut. Dichtung und gefrier Platten bei -20 ° C bis zur Verwendung. </li><li> 1-2 Tage vor der Transfektion, Kultur HEK293T-Zellen in Komplett Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) + 10% fötalem Rinderserum (FBS) und Antibiotika in einem 37 ° C-Inkubator mit CO 2 (5% final) ergänzt. Passage mit Trypsin und erlauben nicht die Aktie um&gt; 80% konfluent während der Expansion zu werden. Für den Bildschirm (ca. 3 x 15 cm-Schalen aus HEK293T-Zellen bei 80% Konfluenz) sind mindestens 6 x 10 7 Zellen erforderlich. </li></ol> 2. Transfektion Hinweis: Siehe Abbildung 1 für ein Flussdiagramm des gesamten Protokoll. <ol><li> Wenn Platten, die Kinase-Plasmide wurden eingefroren, bei Raumtemperatur auftauen einnd Zentrifuge bei 1.900 × g für 3 min, vorhandene Feuchtigkeit an der Unterseite der Vertiefungen sammeln. </li><li> Mischungs 8,6 ml reduzierte Serummedium (zB OPTI-MEM) mit 312,7 &amp; mgr; l Lipid basierende Transfektionsreagenz. Lassen Sie sitzen für 5 min. </li><li> Zugabe von 10 &amp; mgr; l der reduzierten Serummedium zu jeder Vertiefung unter Verwendung eines automatisierten Flüssigkeitsabgabevorrichtung mit einem kleinen Volumen Kassette angebracht. </li><li> In 10 ul pro Vertiefung der reduzierten Serum-Medium / Transfektionsreagenz Mischung aus Schritt 2.2 unter Verwendung eines automatisierten Flüssigkeitsspender mit einem kleinen Volumen Kassette ausgestattet. Lassen Sie sich für 20 bis 45 min. </li><li> Resuspendieren 293T-Zellen mit 7,5 × 10 5 Zellen / ml in 80 ml ​​vollständigem DMEM. 100 ul Zellsuspension (dh 7,5 × 10 4 Zellen) pro Vertiefung unter Verwendung eines automatisierten Flüssigkeitsabgabevorrichtung mit einem Standardvolumen Kassette angebracht. </li><li> Überprüfen Brunnen unter dem Mikroskop für eine gleichmäßige Zellverteilung und zum Inkubator für 24 Stunden. </li></ol> 3. GST-Pulldown-Kinase <ol><li> Stellen Sie fresh: 4 mM Pervanadat-Lösung durch Mischen von 60 ul 0,2 M Natriumvanadat mit 540 &amp; mgr; l H 2 O In einem zweiten Rohr Mischung 2,7 ul 30% Wasserstoffperoxid und 1,4 ml PBS. Fügen Sie die beiden Lösungen zusammen und lassen Sie sich für 15 Minuten vor dem Gebrauch. </li><li> Mit Hilfe einer Mehrkanalpipette (verwenden Sie nicht eine automatische Flüssigkeitsspender, wie es erzeugt zu viel Turbulenz in der gut) verzichtet werden 2 ul von 0,25 M CaCl 2 in jede Vertiefung, gefolgt von 2,5 ul des Pervanadat in Schritt 3.1 vorbereitet. Inkubieren jede Platte bei 37 ° C für 10 min und dann auf Eis zu stellen. </li><li> Vorbereitung 35 ml Lyse-Puffer durch Zugabe von DTT, PMSF und Natriumvanadat, wie in Abschnitt 1 (Herstellung der Reagentien) angegeben. </li><li> Keeping Platten auf Eis zu entfernen Medium aus jeder Vertiefung unter Verwendung einer Vakuumstrahlpumpe. Sofort im 50 ul / Vertiefung von eiskaltem Lyse-Puffer unter Verwendung eines automatisierten Flüssigkeitsspender mit einer Standardkassette ausgestattet. Lassen Sie sitzen 30 Minuten lang auf Eis zu lysieren (optional: Hier können gegebenenfalls durch Versiegelung plat stoppene und Lagerung bei -80 ° C. Um auftauen Platten auf Eis) fortsetzen. </li><li> Spin-Platten bei 1.900 × g für 3 min bei 4 ° C. </li><li> Kratzen Zellen aus jeder Vertiefung mit einer Mehrkanalpipette und übertragen Sie alle Inhalte in geeigneter Weise V-Boden Platten mit 96 Vertiefungen gekennzeichnet. Spin-Platten bei 1.900 × g für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Während Spin, füllen Glutathion-beschichteten Platten (eine für jede 96-Well-Platte) mit 100 ul / Vertiefung von eiskaltem Lyse-Puffer (ohne PMSF) als Spülung. Halten Platten auf Eis. </li><li> Entfernen V-Bodenplatten aus der Zentrifuge. Ein zu einer Zeit, zu invertieren die Glutathion-Platten über ein Waschbecken zu schütteln den Lysepuffer und Blot auf einem Papiertuch. Bringen Lysepuffer aus den V-Bodenplatten auf die Glutathion-Platten durch Kippen der Platte und mit einer Mehrkanalpipette, man aufpassen, nicht das Pellet am Boden stören. Abdeckplatten und lassen auf Eis für mindestens 2 Stunden zu binden. </li><li> In der Nähe des Ende der 2 Stunden Bindungsschritt, bereiten Sie einen Radiostation, die Gewährleistung tEr erforderlichen Sicherheitsvorkehrungen bestehen für radioaktive Arbeit. Stellen Hybridisierungsofen bis 30 ° C. </li><li> Vorbereitung 200 ml Lysispuffer durch Zugabe von DTT und Natriumvanadat wie in Abschnitt 1. PMSF deutet ist in diesem Stadium nicht erforderlich. </li><li> Kehren Sie die Glutathion-Platten über ein Waschbecken zu schütteln den Lysepuffer und tupfen Sie auf einem Papiertuch. Spülen Sie die Taschen 3x mit 100 ul Lysepuffer (ohne PMSF). Lassen Sie sich nicht Brunnen sitzen trocken - halten sie in Spülung bis bereit zu gehen. </li><li> Bereiten Sie 55 ml 1x Kinasepuffer (KB) durch Verdünnen des 10fach und das Hinzufügen von DTT, wie in Abschnitt 1. Spülen Platten einmal mit 50 ul 1x KB mit Hilfe eines automatisierten Flüssigkeitsspender mit einem Standardvolumen Kassette ausgerüstet angezeigt. Lassen 1x KB in Brunnen, bis die Lösung A bereit ist: <ol><li> Vorbereitung der Lösung A durch Zugabe von 500 bis 530 ug des Substrats von Interesse ist, 500 &amp; mgr; g des basischen Myelinproteins (MBP), 2,65 ml 10 × KB, 13,25 &amp; mgr; l 1 M DTT, und H 2 O bis auf 15,9 ml. </li></ol></li&gt; <li> Ein zu einer Zeit, zu invertieren die Platten über ein Waschbecken, um 1x KB Spülung entfernen, Fleck auf Papiertuch, und sofort fügen 30 ul Lösung A unter Verwendung eines automatisierten Flüssigkeitsspender mit einem kleinen Volumen Kassette ausgestattet. Halten Platten auf Eis. </li><li> Vorbereitung der Lösung B in den Arbeitsbereich der Radioaktivität durch Zugabe von 2,5 ml 10x M-ATP, 500 &amp; mgr; Ci 32 P ATP gamma- und H 2 O auf 10 ml. <ol><li> In 20 ul Lösung B pro Vertiefung mit einem Repeater-Pipette, die aufgrund von Ausstoßkraft Mischhilfen. Decken und Inkubation in 30 ° C Hybridisierungsofen für 30 min. </li></ol></li><li> Nach 30 min Übertragungsplatten wieder auf Eis. Zugabe von 50 ul 2 x SDS-Lysepuffer zu jedem Well mit einer Mehrkanalpipette. Kann an dieser Stelle, um zum nächsten Schritt, oder dichten die Platten mit Aluminiumfolie und bei -20 ° C, bis praktisch. </li></ol> 4. Laufsport, Färbung und Trocknung Gele Hinweis: Alle Arbeiten sind in einem Gebiet durchgeführt werden DESIGNAted auf Radioaktivität. <ol><li> Schalten Sie Hybridisierungsofen und auf 85 ° C eingestellt. Tau-Platten bei Raumtemperatur. Sobald Backofen Temperatur, Übertragungsplatten zum Ofen und Inkubation für 10 min, um Proben zu denaturieren erreicht. </li><li> Last 26-Well-Fertig Gele mit 15 ul jeder Reaktion unter Verwendung einer Mehrkanalpipette um mehrere Brunnen auf einmal zu füllen. Ist darauf zu achten, dass alle Spitzen ausgerichtet entsprechend gut, bevor Proben werden. Führen Gel bei 150 V Lassen Sie die Markierungsfarbstoff (blaue Linie) ablaufen der Unterseite des Gels, da dies enthält den unincorporated ATP. </li><li> Demontieren Sie die Gele und schneiden Sie die nicht rechtsfähige ATP (blaue Linie) mit einem Skalpell oder gerade Kante, wie es die Filme überbelichtet. Legen Sie die Gele in beschriftete Behälter geben und mit Coomassie-Färbung für 15 min. </li><li> Entfernen Sie die Coomassie-Färbung, kurz spülen Sie die Gele mit Wasser, und fügen Sie destain Lösung. Entfärben der Gele bis die Proteine ​​sind deutlich sichtbar. Ein Band für MBP und ein Band für das Substrat solltewerden für jede Probe sichtbar. </li><li> Um die Gele trocken: <ol><li> Schneiden Sie ein großes Blatt Filterpapier und legen Sie es auf dem Trockner. </li><li> Befeuchten Sie ein Cellophanfolie in destilliertem Wasser, bis es glatt ist und knitterfrei, und legen Sie sie auf dem Papier. </li><li> Verlegen Sie die Gele auf dem Zellophan Blech, die eine Anmerkung in der Größenordnung von Gelen. Befeuchten Sie ein zweites Blatt Cellophan und legen Sie auf der Gele. </li><li> Rollen Sie alle Luftblasen (eine Platte Siegelwalze funktioniert gut für diese) für eine schöne gleichmäßige Oberfläche. Schließen Sie die Klappe, schalten Sie das Vakuum und trocknen Sie die Gele für 3 Stunden bei 80 ° C. </li></ol></li><li> Sobald Gele trocken sind, setzen Sie sie XAR-Film mit einem Bildschirm, um das Signal zu verstärken. Wickeln Sie die Kassette mit Frischhaltefolie oder eine Plastiktüte und verschließen Sie mit Klebeband gegen Frost draußen zu halten. Bewahren Sie die Kassette bei -80 ° C über Nacht. </li></ol> 5. Entwicklung XAR Films <ol><li> Am folgenden Tag, entfernen Kassette aus dem Gefrierschrank und lassen bei Raumtemperatur auftauen. Entwickeln Sie den Film inDunkelkammer unter Verwendung eines Filmprozessors gemß den Anweisungen des Herstellers. Hinweis: Überprüfen Sie die Folien nach Beweisen für Kinase-Substrat-Paare. Ein zweiter längerer Exposition kann auch nützlich sein schwächer Phosphorylierungsereignisse detektieren. </li></ol>

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<li>Abu-Thuraia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axl+phosphorylates+elmo+scaffold+proteins+to+promote+rac+activation+and+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Axl phosphorylates elmo scaffold proteins to promote rac activation and cell invasion.</a> Mol Cell Biol. 35, 76-87 (2015).</li>
<li>Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+kinase+complement+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The protein kinase complement of the human genome.</a> Science. 298, 1912-1934 (2002).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Seit den ursprünglichen Veröffentlichungen über den Ansatz 14,15 ist die ursprüngliche Bibliothek 180 GST-Kinasen wurden in 420 Mitglieder oder ~ 80% des menschlichen Protein Kinoms erweitert. Der erweiterte Bibliothek, die wie beschrieben Protokoll dauert 4-5 Tage und dann 1-4 Tage, um Filme zu entwickeln (wie dies notwendig erscheint), die durch die Verwendung von Phosphorimaging und digitale Signalverstärkung verkürzt werden konnte. Es gibt mehrere wichtige Schritte, bei denen darauf geachtet werden muss <...

Protein posttranslationale Modifikationen (PTMs) essentiell für die intrazelluläre Kommunikation. Vielleicht ist die am besten untersuchten aller PTMs ist Phosphorylierung durch Proteinkinasen, die eine Vielzahl von Proteinfunktionen, einschließlich ihrer biochemischen Aktivität, subzelluläre Lokalisierung, Konformation und Stabilität regulieren katalysiert. Die Identifizierung von Phosphorylierungsstellen auf Zielproteine ​​können durch tryptische Phosphopeptid Kartierung oder jetzt Standard Proteomics Techniken unter Verwendung von Proben für die phosphorylierten Peptide 1,2 angereichert erreicht werden. Während drei Viertel der zum Ausdruck Proteom sollen phosphoryliert 3 und eine identifizierte 200.000 Phosphorylierungsstellen 5, wobei die Schätzungen bis zu 1 Mio. 6, viele von ihnen haben keine zugewiesenen Biologie, Signalwegs oder Proteinkinase. Während Identifizierung der phosphorylierten Websites ist relativ einfach, eine vergleichsweise größere Herausforderung ist es,identifizieren die verwandten Kinase (n), dass diese Seiten abzielt, ein Prozess, wir als Mapping-Kinase: Substrat-Paare. Mehrere Ansätze zum Identifizieren von Kinase: Substrat-Paare beschrieben wurden, entweder ausgehend von einer Kinase von Interesse und der nach seiner Substrate oder beginnend mit einem Substrat von Interesse und zu versuchen, eine modifizierende Kinase experimentell 7-11 oder rechnerisch 12 finden. Kinasen für eine bekannte phosphorylierte Substrat identifizieren kann Bioinformatik verwendet, um Proteine, die eine kurze konservierte Aminosäuresequenz flankieren den phosphorylierten Rest (der Konsensusstelle), sowie die Identifizierung Kinasen, die einen präzipitierbaren Komplex mit dem Substrat enthalten identifizieren. Allerdings sind diese Ansätze zeitaufwendig und oft nicht von Erfolg gekrönt. Wir entwickelten eine systematische funktionalen Ansatz schnell zu identifizieren Kinasen, die eine gegebene Substrat 13 phosphorylieren kann. Der Bildschirm Assay produziert hervorragende spezifischekeit, mit sehr klaren Auswahl für eine mögliche verwandte Kinasen. Angesichts der Zentralität der Phosphorylierung an biologischen Signal, der Bildschirm ist nützlich für die Entdeckung in nahezu allen Zellsignalwege 14-16. Der Bildschirm beinhaltet die Durchführung einer großen Kinase-Assay mit einer Bibliothek von menschlichen Proteinkinasen. Die Kinasen wurden mit bakteriellen Glutathion-S-Transferase (GST) -Protein, markiert worden und werden aus Säugetierzellextrakten gereinigt ist, was bedeutet, daß die rekombinanten Enzyme - im Gegensatz zu den aus Bakterien hergestellt, - in Gegenwart der vorgeschalteten Proteinkinasen oft die erforderliche erzeugten rekombinante Enzyme Aktivität haben in vitro. Tatsächlich, während Serin, Threonin und Tyrosin Kinaseaktivität für nachgeschaltete Kinaseaktivierung in Hefe 10 vorhanden sind, codiert das Hefegenom 122 Proteinkinasen, die anzeigt, dass die Säuger Kinoms, mit mehr als 500 Gene 17 ist wesentlich komplexer zu werden, um Regulate die Prozesse eindeutig höherer Ordnung Organismen. Darüber hinaus kann die Wirkung der relevanten Zellbiologie und menschlichen Erkrankungen (wie beispielsweise kleinen Molekülen, Wachstumsfaktoren, Hormone, etc.) verschiedene Reize zu 14,15 modulate Kinase-Aktivität in einem geeigneten Kontext eingesetzt werden.

<table><tbody><tr><td>Lysepuffer</td><td>Made in house</td><td></td><td>Siehe Protokoll Schritt 1.1</td></tr><tr><td>10x Kinase-Puffer</td><td>Made in house</td><td></td><td>Siehe Protokoll Schritt 1.2</td></tr><tr><td>10x M-ATP</td><td>Made in house</td><td></td><td>Siehe Protokoll Schritt 1.3</td></tr><tr><td>Humane Kinase-Plasmide</td><td>Orfeome, Invitrogen, Origene</td><td></td><td>GST-tagged in house</td></tr><tr><td>96 Well Platten</td><td>Fisher Scientific</td><td>CS003595</td><td></td></tr><tr><td>293T Zellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002201</td><td>Ergänzung mit 100&nbsp; U/ml Penicillin, 100&nbsp; &#956; g/ml Streptomycin, 10% fötales Kälberserum.</td></tr><tr><td>CO2-Inkubator</td><td>Sanyo</td><td>MCO-17AIC</td><td></td></tr><tr><td>15 cm Zellkulturschalen</td><td>Fisher Scientific</td><td>877224</td><td></td></tr><tr><td>Reduziertes Serummedium</td><td>Invitrogen</td><td>22600-050</td><td></td></tr><tr><td>Transfektionsreagenz auf Lipidbasis</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Automatischer Flüssigkeitsspender</td><td>Thermo Scientific</td><td>5840300</td><td></td></tr><tr><td>Kleiner Kassettenaufsatz</td><td>Thermo Scientific</td><td>24073295</td><td></td></tr><tr><td>Standard-Kassettenaufsatz</td><td>Thermo Scientific</td><td>14072670</td><td></td></tr><tr><td>4 mM Pervanadat</td><td>Made in house</td><td></td><td>Siehe Protokoll Schritt 3.1</td></tr><tr><td>0,25 M CaCl2</td><td>Made in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mehrkanalpipette (20-200 &#956; l)</td><td>Labnet</td><td>p4812-200</td><td></td></tr><tr><td>Mehrkanalpipette (1-10 &#956; l)</td><td>Thermo Scientific</td><td>4661040</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Platten mit V-Boden</td><td>Evergreen Scientific</td><td>290-8116-01V</td><td></td></tr><tr><td>Glutathion-beschichtete 96-Well-Platten</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-15240</td><td></td></tr><tr><td>Hybridisierungsofen</td><td>Biostad</td><td>350355</td><td></td></tr><tr><td>GST-getaggtes Substrat</td><td>Hauseigenes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Myelin-Basisprotein (MBP)</td><td>Sigma</td><td>M1891</td><td></td></tr><tr><td>Repeater-Pipette (1 ml)</td><td>Eppendorf</td><td>22266209</td><td></td></tr><tr><td>32P gamma-ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>BLU502Z500UC</td><td></td></tr><tr><td>2x SDS-Lysepuffer (100&nbsp; ml)</td><td>Made in house</td><td></td><td>Siehe Protokollschritt 1.4</td></tr><tr><td>26-Well-vorgefertigte TGX-Gele</td><td>BioRad</td><td>567-1045</td><td>Der erforderliche Gelanteil hängt vom Molekulargewicht des betreffenden Substrats ab</td></tr><tr><td>Coomassie stain</td><td>Made in house</td><td></td><td>0,1 % Coomassie R250, 10 % Essigsäure, 40 % Methanol</td></tr><tr><td>Coomassie destain</td><td>Made in house</td><td></td><td>10 % Essigsäure, 20 % Methanol</td></tr><tr><td>Beschriftete Gelbehälter</td><td>Im eigenen Haus</td><td></td> hergestellt <td>Gebrauchte Kunststoffdeckel aus leeren Spitzenboxen, gerade groß genug, um ein Gel aufzunehmen</td></tr><tr><td>Whatman Filterpapier</td><td>Fisher Scientific</td><td>57144</td><td></td></tr><tr><td>Zellophanplatten (2)</td><td>BioRad</td><td>165-0963</td><td></td></tr><tr><td>Geltrockner</td><td>Labconco</td><td>4330150</td><td></td></tr><tr><td>Doppelemulsions-Autoradiographiefilm</td><td>VWR</td><td>IB1651454</td><td></td></tr><tr><td>Filmkassette</td><td>Fisher Scientific</td><td>FBAC-1417</td><td></td></tr><tr><td>Intensiviersieb</td><td>Fisher Scientific</td><td>FBIS-1417</td><td></td></tr><tr><td>Plattendichtung Gummiwalze</td><td>Sigma</td><td>R1275</td><td></td></tr></tbody></table>

identifikation von kinase-substrat-pairs mit high throughput screening

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

Wir haben ein Screening-Plattform zu dedizierten menschliche Proteinkinasen phosphoryliert für Substrate, die verwendet werden können, um neue Signaltransduktionswege aufzuklären identifizieren. Unsere Vorgehensweise bietet die Verwendung einer Bibliothek von gereinigtem GST-markiertes humanes Protein-Kinasen und ein rekombinantes Protein Substrat von Interesse. Wir haben diese Technologie ein Protein für die Beta-Zellproliferation erforderlich ist, sowie die verwendet werden, um MAP / Mikrotubuli-Affinität regulierenden Kinase 2 (Modell 2) als Kinase für eine Glucose-regulierten Website auf CREB-Regulated Transcriptional Koaktivator 2 (CRTC2) zu identifizieren, Axl Familie von Tyrosinkinasen als Regulatoren der Zellmetastasen durch Phosphorylierung des Adapterprotein ELMO. Wir beschreiben diese Technologie und diskutieren, wie sie helfen können, eine umfassende Karte, wie Zellen auf Reize aus der Umwelt zu etablieren.

Repräsentative Ergebnisse von einem Bildschirm werden in Abbildung 2 dargestellt. 180 Kinasen wurden unter Verwendung eines GST-tagged Peptidsubstrat entsprechend zu AS 268-283 von CRTC2 sowie klassischen Kinaseassays Substrat das basische Myelinprotein (MBP) gescreent. Nur zwei Kinasen, MARK2 und die eng verwandte Kinase phosphoryliert das MARK3 CRTC2 Peptids. MBP ist als eine interne Kontrolle in allen Assays eingeschlossen, da es enthält viele phosphorylierbare Reste und läuft bei 18 kDa, in Richtung...

Die Proteinphosphorylierung ist ein zentrales Merkmal der Art und Weise, wie Zellen Informationen in ihrem extrazellulären Milieu interpretieren und darauf reagieren. Hier stellen wir ein Hochdurchsatz-Screening-Protokoll vor, bei dem Kinasen verwendet werden, die aus Säugetierzellen gereinigt wurden, um schnell Kinasen zu identifizieren, die ein oder mehrere Substrate von Interesse phosphorylieren.

Identifikation von Kinase-Substrat-Pairs Mit High Throughput Screening


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Kinase-Enzyme zu identifizieren, die ein Substrat der Wahl phosphorylieren, wobei Methoden des Hochdurchsatz-Screenings verwendet werden. Dies wird zunächst erreicht, indem Zellen mit Plasmiden transfiziert werden, die Kinase-FU-Proteine als Glutathion-S-Transferase oder GST exprimieren. Der zweite Schritt besteht in der Durchführung eines GST-Kinase-Pulldowns.Anschließend werden die Proben in Gele geladen, die dann durchlaufen und mit Kumasi-Bright-Blue-Färbemittel gefärbt werden. Der letzte Schritt besteht darin, die Gele zu trocknen und sie einer Autoradiographiefolie auszusetzen. Letztendlich kann man durch die Entwicklung und Interpretation der resultierenden Filme Kinase-Substrat-Paare identifizieren, da jede Spur einem spezifischen Kinase-Assay entspricht.Bisherige Methoden zur Identifizierung einer Kinase für ein bekanntes phosphoryliertes Substrat umfassen die Verwendung bioinformatischer Ansätze zur Suche nach einer Konsensusstelle im Substrat, die Detektion von Komplexen zwischen Kinase und Substraten mittels biochemischer Techniken sowie einen Versuchs-und-Irrtum-Ansatz, sowie die Suche nach Konsenssubstraten auf der Grundlage ihrer bekannten biologischen Funktion. Diese Ansätze sind zeitaufwändig und führen nicht immer zum Erfolg. Unser Ansatz ermöglicht die schnelle Identifizierung von Kinase-Substrat-Paaren auf der Grundlage funktioneller Ergebnisse.Als wir erstmals die Idee für diese Methode hatten, waren wir besorgt, dass die Spezifität in vitro unzureichend sein könnte. Tatsächlich ist die Substratspezifität hervorragend, und wir stellen oft fest, dass nur verwandte Kinasen einer Familie in der Lage sind, ein bestimmtes Substrat im Screening zu phosphorylieren. Dies zeigt sich besonders deutlich, wenn wir mehrere Substrate in jedem Screening multiplexen, was belegt, dass das Verfahren funktioniert. Courtney, eine Technikerin aus meinem Labor, beginnt das Verfahren mit der Vorbereitung der Reagenzien, Platten und Zellen, wie im textbasierten Protokoll beschrieben.Wenn Platten mit Kinase-Plasmiden eingefroren wurden, diese bei Raumtemperatur auftauen und dreimal für drei Minuten mit 1900 × g zentrifugieren, um Feuchtigkeit am Boden der Vertiefungen zu sammeln. 8,6 Milliliter Medium mit reduziertem Serumanteil mit 312,7 Mikrolitern lipidbasiertem Transfektionsreagenz vermischen und die Mischung fünf Minuten lang ruhen lassen, um sie anschließend jeder Vertiefung hinzuzufügen. Jeweils 10 Mikroliter des Mediums mit reduziertem Serumanteil zur 96-Loch-Platte mit den Kinase-Plasmiden geben.Unter Verwendung eines automatischen Flüssigkeitsdispensers mit einer Kleinvolumenkassette anschließend 10 µL des transfezierten Mediums mit reduziertem Serum pro Vertiefung hinzufügen, wobei ein automatischer Flüssigkeitsdispenser mit einer Kleinvolumenkassette verwendet wird, und die Platte 20 bis 45 Minuten ruhen lassen. Danach 293T-Zellen erneut suspendieren, und zwar bei 0,75 Millionen Zellen pro Milliliter in 80 Milliliter vollständigem, modifiziertem Dulbecco’s Minimal Essential Medium oder DMEM, mit jeweils 100 µL der Zellsuspension pro Vertiefung. Unter Verwendung eines automatischen Flüssigkeitsdispensers mit einer Standardvolumenkassette die Vertiefungen unter dem Mikroskop auf gleichmäßige Zellverteilung überprüfen, bevor die Platte für 24 Stunden in einen 37 °C warmen Inkubator zurückgestellt wird.Um das GST-Kinase-Pull-down-Experiment zu beginnen, stellen Sie eine vier Millimolar Vanadat-Lösung her, indem Sie 60 Mikroliter einer 0,2-Molar-Natriumvanadat-Lösung mit 540 Mikrolitern Wasser in einem zweiten Reaktionsgefäß mischen. Geben Sie außerdem 2,7 Mikroliter einer 30-%igen Peroxidlösung und 1,4 Milliliter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) zusammen. Mischen Sie die beiden Lösungen und lassen Sie das Gemisch vor der Verwendung 15 Minuten lang stehen.Unter Verwendung einer Mehrkanalpipette zwei Mikroliter einer 0,25-molaren Calciumchloridlösung in jedes Loch geben, gefolgt von 2,5 Mikrolitern der bewährten DNA-Lösung. Jede Platte 10 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren und anschließend auf Eis stellen, wobei die Platten auf Eis verbleiben. Das Medium aus jedem Loch entfernen und sofort 50 Mikroliter kalte Lysepuffer pro Loch unter Vakuum hinzufügen.Unter Verwendung eines automatischen Flüssigkeitsdispensers, der mit der Standardkassette ausgestattet ist, die Platte 30 Minuten auf Eis stehen lassen, um sie zu lysieren. Nach dem Zentrifugieren der Platten bei 1900 × g für drei Minuten bei vier Grad Celsius die Zellen aus jedem Well mit einer Mehrkanalpipette abkratzen und den gesamten Inhalt in entsprechend beschriftete vbo überführen. Bei 96-Well-Platten die Platten bei 1900 × g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren und während des Zentrifugierens die Glutathion-beschichteten Platten mit je 100 µL eiskallem Lysepuffer pro Well füllen.Als Spülung die Platten auf Eis stellen. Nach der Zentrifugation der V-Boden-Platten die Glutathion-Platten über einem Ausguss umdrehen, um den Lysepuffer herauszuschütteln, und auf einem Papierhandtuch abtupfen. Den Lysepuffer von den V-Boden-Platten durch Kippen der Platte und unter Verwendung einer Mehrkanalpipette auf die Glutathion-Platten übertragen, wobei darauf geachtet werden muss, das Pellet am Boden nicht aufzuwirbeln.Anschließend die Platten abdecken und mindestens zwei Stunden auf Eis stellen. Gegen Ende des zweistündigen Bindeschritts eine Radioaktivitätsarbeitsstation vorbereiten und sicherstellen, dass die erforderlichen Sicherheitsvorkehrungen für Arbeiten mit Radioaktivität getroffen sind. Den Hybridisierungsofen auf 30 Grad Celsius einstellen.Drehen Sie die Glutathion-Platten über einem Ausguss um, um den Lysepuffer herauszuschütteln, und tupfen Sie sie mit einem Papiertuch ab. Spülen Sie die Vertiefungen dreimal mit jeweils 100 Mikrolitern Lysepuffer ohne PMSF aus. Lassen Sie die Vertiefungen nicht austrocknen.Bewahren Sie sie bis zur Weiterverarbeitung in der Spülung auf. Bereiten Sie anschließend 55 Milliliter eines 1x-Kinasepuffers oder eines 1x kb gemäß der schriftlichen Anleitung vor. Geben Sie mithilfe eines automatisierten Flüssigkeitsdosiersystems, das mit einer Standardvolumenkassette ausgestattet ist, 50 Mikroliter des 1x kb in jedes Loch der Platte.Dann bereiten Sie Lösung A vor, indem Sie nacheinander eine Lösung herstellen, die das Substrat Ihrer Wahl sowie myelinsäurebindendes Protein oder MVP enthält, wie im Textprotokoll beschrieben. Drehen Sie die Platten über einem Ausguss um, um die Einmal-XKB-Spülung auf ein Papiertuch ablaufen zu lassen, und geben Sie sofort 30 Mikroliter Lösung A hinzu, unter Verwendung eines automatischen Flüssigkeitsdosiersystems mit einer Kleinvolumenkassette. Halten Sie die Platten auf Eis.Bereiten Sie anschließend Lösung B im Bereich für radioaktive Arbeiten wie im Textprotokoll beschrieben vor, mit 20 Mikroliter Lösung B pro Vertiefung. Geben Sie die Lösung mit einer Mehrfachpipette unter Rühren aufgrund der Ausstoßkraft auf und inkubieren Sie die Platte 30 Minuten lang in einem Hybridisierungsofen bei 30 Grad Celsius. Nach 30 Minuten bringen Sie die Platten zurück auf Eis.Fügen Sie dann mit einer Mehrkanalpipette 50 Mikroliter zweifach konzentrierter Natrium-SDS-Lysepuffer (SDS-Lysispuffer) in jedes Loch hinzu. Die gesamte Arbeit in diesem Abschnitt sollte in einem Bereich durchgeführt werden, der für radioaktive Arbeiten vorgesehen ist. Schalten Sie den Hybridisierungsofen ein und stellen Sie ihn auf 85 Grad Celsius ein.Sobald der Ofen die Temperatur erreicht hat, überführen Sie die Platten in den Ofen und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang, um die Proben zu denaturieren. Danach laden Sie 26-Kammern-Vorgegossene Gele mit jeweils 15 Mikrolitern jeder Reaktion. Bei Verwendung einer Mehrkanalpipette, um mehrere Vertiefungen gleichzeitig zu befüllen, muss darauf geachtet werden, dass alle Spitzen mit den entsprechenden Vertiefungen ausgerichtet sind. Führen Sie das Gel vor dem Hinzufügen der Proben bei 150 Volt laufen. Lassen Sie die blaue Linie nicht vom unteren Rand des Gels laufen, da diese die nicht eingebauten ATP-Moleküle enthält. Zerlegen Sie anschließend die Gele und entfernen Sie die nicht eingebauten ATP-Moleküle, da diese die Belichtung des Gels auf den Filmen verdunkeln würden.Die Gele in beschriftete Behälter geben und 15 Minuten lang mit Kumasi-Färbemittel bedecken. Anschließend das Kumasi-Färbemittel entfernen. Die Gele kurz mit Wasser spülen und Detektionslösung hinzufügen.Die Gele solange belassen, bis die Proteine deutlich sichtbar sind. Für jede Probe sollten ein Band für MVP und ein Band für das Substrat sichtbar sein. Um die Gele zu trocknen, ein großes Blatt Filterpapier zuschneiden und auf den Trockner legen.Befeuchten Sie ein Cellophanblatt mit destilliertem Wasser, bis es glatt und faltenfrei ist, und legen Sie es auf das Papier. Legen Sie die Gele auf das Cellophanblatt und notieren Sie sich die Reihenfolge der Gele. Befeuchten Sie ein zweites Cellophanblatt und legen Sie es auf die Gele. Entfernen Sie alle Blasen, um eine gleichmäßige Oberfläche zu erhalten. Schließen Sie die Klappe, schalten Sie das Vakuum ein und trocknen Sie die Gele drei Stunden lang bei 80 Grad Celsius. Sobald die Gele getrocknet sind, belichten Sie sie mit einer Doppelschicht-Autoradiographiefolie unter Verwendung eines Verstärkerschirms, um das Signal zu intensivieren.Verpacken Sie die Kassette mit Frischhaltefolie oder einer Plastiktüte und verschließen Sie sie mit Klebeband, um Frost auszuschließen, bevor Sie die Kassette über Nacht bei minus 80 Grad Celsius lagern. Am folgenden Tag nehmen Sie die Kassette aus dem Gefrierschrank und lassen sie bei Raumtemperatur auftauen. Entwickeln Sie den Film in einem abgedunkelten Raum mithilfe eines Filmprozessors gemäß den vom Hersteller angegebenen Anweisungen.Hier sind repräsentative Ergebnisse aus einem Screening, bei dem 180 Kinasen untersucht wurden, unter Verwendung eines GST-markierten Peptid-Substrats, das den Aminosäuren 268 bis 283 des durch Kreb regulierten transkriptionellen Coaktivators zwei oder CRTC zwei entspricht, sowie des klassischen Kinase-Assay-Substrats Myelin-Basisches Protein oder MBP nur zwei. Die Kinasen mark zwei und die eng verwandte Kinase mark drei wurden phosphoryliert. Das CRTC-zwei-Peptid MBP ist in allen Assays als interne Kontrolle enthalten, da es zahlreiche phosphorylierbare Reste aufweist und mit 18 Kilodalton nahe dem unteren Rand des Gels läuft.Dies ermöglicht eine Interpretation der Spezifität. Einige Kinasen phosphorylieren ein Substrat und MVP robust. Bemerkenswert ist hierbei, dass die Vertiefungen mit GST allein stets eine gewisse endogene Kinaseaktivität anreichern.Daher liegt in dem Assay stets eine Hintergrundphosphorylierung vor. Obwohl dies nicht ausschließt, dass die Phosphorylierung des Substrats real ist, deutet es darauf hin, dass die Kinase im In-vitro-Setting möglicherweise weniger selektiv ist. Es ist besonders aussagekräftig, mehrere Substrate mit unterschiedlichen Molekulargewichten einzubeziehen, um Schlussfolgerungen bezüglich der Substratspezifität der Kinase zu ziehen.Da der Screen in vitro durchgeführt wird und zusätzliche Komplexitätsebenen in vivo auftreten, muss eine Kinasenkandidatin in Zellen validiert werden. Beispielsweise könnte eine Kinasenkandidatin in vitro in der Lage sein, ein Substrat zu phosphorylieren, jedoch nicht im selben Zelltyp oder in denselben Teilzellen eines Kompartiments wie das Substrat exprimiert sein. Dies erfolgt typischerweise durch RNAi-vermittelte Stilllegung des Kandidaten.Es ist ebenfalls möglich, einen Sekundärscreen unter Verwendung eines nicht-phosphorylierbaren Mutanten des Substrats durchzuführen, um die Spezifität zu bestätigen.

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Forschung

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