Name: Auswertung der bioenergetischen Funktion in Cerebral Vascular Endothelial Cells (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: Lernen Sie die Bewertung mitochondrialer Funktion in zerebrovaskulären Endothelzellen für Neurowissenschaften. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Analysen zur Untersuchung der Blut-Hirn-Schranken-Integrität.

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Diese Arbeit wurde durch die folgenden Zuschüsse unterstützt: AHA 16SDG31170008 an X.R. und NIH P20 GM109098, P01 AG027956 und U54 GM104942 an J.W.S.

HINWEIS: Die Regelung des Protokolls ist in Abbildung 1, mit einem Zeitplan der Verfahren gezeigt. 1. Kultur und Passage von CVE-Zellen <ol><li> Kultur CVE Zellen (bEnd.3 Zellen) in komplettem Wachstumsmedium (glucosereichem Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium, DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin in einer T75 cm 2 Gewebekulturkolben ergänzt. Wachsen bei 37 ° C in einem 5% CO 2 -Inkubator. </li><li> Entfernen und die Zellkulturmedium zu verwerfen. Spülen Sie die Zellschicht mit 0,25% Trypsin-0,03% EDTA-Lösung, und fügen Sie dann 1 bis 2 ml Trypsin-EDTA-Lösung in den Kolben und halten den Kolben bei 37 ° C für 3 - 5 min. Beachten Sie die Zellen unter einem inversen Mikroskop, bis die Zellschicht abgelöst wird. In 10 ml komplettem Wachstumsmedium und aspirieren die Zellen durch vorsichtiges Pipettieren. </li><li> Man dekantiert die Flüssigkeit und Zellen in eine 15-ml-Zentrifugenröhrchen und Spinn bei 700 xg für 5 min um Zelltrümmer zu entfernen. </li&gt; <li> Überstand verwerfen aus dem Zentrifugenröhrchen. In 10 ml komplettem Wachstumsmedium und resuspendieren Zellpellet. Dreh die Zellen bei 700 · g für 5 min. </li><li> Überstand verwerfen aus dem Zentrifugenröhrchen. Resuspendieren des Zellpellets in komplettem Wachstumsmedium bei einer Konzentration von 2,0 × 10 5 Zellen / mL (bestimmt durch Zählen unter Verwendung eines Hämozytometers; auszuschließen toten Zellen durch Trypan-Blau - Färbung). HINWEIS: Frisch aufgetaute Zellen subkultiviert mindestens 3 Durchgänge für Experimente. </li></ol> 2. Seed und Behandeln Zellen auf Zellkulturplatten <ol><li> Samenzellen auf einer 96-well extrazellulärem Flußmittel Zellkulturplatte: 80 &amp; mgr; l / Vertiefung. Legen Sie die Zellkulturplatte bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Inkubator. Hinweis: 16 × 10 3 Zellen pro Vertiefung 60 erreicht - 80% Konfluenz innerhalb von 24 h. </li><li> Wenn die Zellen zu einer Chemikalie ausgesetzt werden, fügen Sie die Behandlungen, sobald die Zellen an den Plattenboden angebracht sind (8 - 24 h nach sehending). HINWEIS: Für die Transfektion Experimente, keine Antibiotika in komplettem Wachstumsmedium hinzuzufügen. </li></ol> 3. Bewertung der mitochondrialen Funktion der Bioanalyzer Verwendung <ol><li> Vor Beginn des Assays, die eine extrazelluläre Flußsensor Kartusche mit Kalibrierfluid Hydrat durch Zugabe von 150 &amp; mgr; l von extrazellulärem Flußmittel Kalibrierlösung mit der Platte und Inkubation O / N bei 37 ° C ohne CO 2. </li><li> Mit der Plattenwaschstation, ändern Sie die Zellkulturmedium in pH 7,0 extrazellulären Flusstestmedium. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C ohne CO 2 für 30 - 60 min. </li><li> Bereiten Sie Arbeitslösungen von 8 uM Oligomycin, 4,5 uM FCCP, 10 uM Rotenon und 10 &amp; mgr; M Antimycin A in DMEM. Last 25 &amp; mgr; l der Stammlösungen in Patrone Injektionsöffnungen: Port A, Oligomycin; Port-B, FCCP; Port C, Rotenon und Antimycin A mit extrazellulären Flusstestmedium. Implementieren Sie das Testprotokoll , wie in Tabelle 1 beschrieben. </li><li> Legen Sie das hydratisierte Patrone in den Bioanalyzer und führen Sie die Kalibrierung durch die Schaltfläche &quot;Start&quot; klicken. Nachdem die Kalibrierung abgeschlossen ist, entfernen Sie die &quot;Unload Cartridge&quot; prompt, indem Sie auf die Patrone Bodenplatte und laden Sie die Zellenplatte. Weiter den Test bis zum Ende aller Messungen. </li><li> Öffnen Sie die Datendatei und erhalten die Rate Werte aus dem Bioanalyzer. Exportieren Sie die Daten in ein Tabellenkalkulationsdatei. </li></ol> 4. Datenanalysen HINWEIS: Die Berechnungen für die Datenanalysen werden formuliert unten. Die Werte werden aus dem Bioanalyzer erhalten wie die OCR 2 in Abbildung dargestellt. <ol><li> Zur Berechnung Basalatmung, subtrahieren Sie die nicht die mitochondriale Atmung (Messungen 10 bis 12) aus dem Grundwert (Messung 3). HINWEIS: Basalatmung = Basal - nicht die mitochondriale Atmung = Rate ③ - Bewerten ⑩ ~ ⑫. </li><li> Zur Berechnung der ATP productivom Basalwert (Messung 3) - auf der ATP-linked Atmung (6 Messungen 4) abziehen. HINWEIS: ATP-Produktion = Basal - ATP-linked Atmung = Rate ③ - Bewerten ④ ~ ⑥. </li><li> Um eine maximale Atmung zu subtrahieren , die nicht die mitochondriale Atmung (Messungen 10 bis 12) aus dem Maximum der Atmung (Messungen von 7 bis 9). HINWEIS: Maximal Atmung = maximale Atmung - nicht die mitochondriale Atmung = Rate ⑦ ~ ​​⑨ - Bewerten ⑩ ~ ⑫. </li><li> Um Ersatzkapazität zu berechnen, subtrahieren Sie den Basalwert (Messung 3) aus dem Maximum der Atmung (Messungen von 7 bis 9). HINWEIS: Die Ersatzkapazität = Maximale Atmung - Basal = Rate ⑦ ~ ​​⑨ - Bewerten ③. </li><li> Proton Leck, subtrahieren , um die nicht-mitochondriale Atmung (Messung 10 bis 12) Zur Berechnung der ATP-linked Atmung (Messung 4). HINWEIS: Protonenleck =-ATP verknüpft Atmung - nicht Mitochondrienl Atmung = Rate ④ - Bewerten ⑩ ~ ⑫. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass keine potenziellen Interessenkonflikte in Bezug auf die Forschung, Autorenschaft und/oder Veröffentlichung dieses Artikels bestehen. Die Open-Access-Gebühren für diesen Artikel wurden von Agilent Technologies zur Verfügung gestellt.

Dieses Protokoll stellt ein Verfahren zur in zerebralen vaskulären Endothelzellen des bioenergetischen Phänotyp auswertet. Es dient als Basistest für die endotheliale Zell mitochondrialen Auswertung und es ist optimal für die Experimente, die Mechanismen von Stimuli zu untersuchen, die die mitochondriale Signalweg in CVE Zellen beeinflussen können. Es stellt auch ein Verfahren für potentielle Therapeutika für BBB-Störung-assoziierter Krankheiten testen. Kritische Schritte im Rahmen des Protokolls Extrazellulärem Flußmittel bioanalyzers haben die Fähigkeit, OCR in Echtzeit zu messen. In diesem Assay wird die geeignete Zelldichte Identifizierung kritisch. Wenn die Zelldichte von weniger als 8 × 10 3 Zellen pro Vertiefung ist, die basale OCR zu niedrig analysiert werden (Abbildung 2 und Abbildung 3); Wenn die Zelldichte von über 32 × 10 3 Zellen pro Vertiefung ist, müssen die Zellen nicht zu Oligomycin oder FCCP treatme antwortennts (Abbildung 2 und Abbildung 3). Die optimale Zelldichte für diese Zelllinie in unserem experimentellen Modell ist 16 × 10 3 Zellen pro Vertiefung, die reproduzierbare Ergebnisse und Empfindlichkeit zeigt auf Reize 7 und Behandlungen 10,14. Wenn eine 24-well Bioanalyzer verwendet wird, neue Titrationen der Zelldichte würde für den Test erforderlich. Es ist dokumentiert , dass CVEs ein großes Volumen von Mitochondrien haben im Vergleich zu anderen endothelialen Zellen oder Gewebetypen 15,16, was auf die Notwendigkeit einer größeren Energieproduktion und weniger Zellen für bioenergetics Stoffwechsel zu messen. Wir haben verschiedene Arten von Gehirn - Endothelzellen getestet, wie primäre und immortalisierten murinen zerebrovaskulären Endothelzellen 7 und immortalisierten humanen zerebrovaskulären Endothelzellen (nicht veröffentlichte Daten). Diese Zellen ähnliche Zelldichten erforderlich, um die akzeptable OCR (Basalatmung OCR innerhalb von 40 zu erreichen - 160 pmol / min96-Well-Platten und 50-400 pmol / min für 24-Well-Platten), wenn der Bioenergetik-Test durchgeführt wurde. Kaczara et al. Berichteten bioenergetischen Metabolismus in menschlichen Nabelvenen - Endothelzellen (HUVEC) zu messen, die eine höhere Zelldichte 17 verwendet. Unsere Gruppe nicht beurteilen Gefäßzellen aus anderen Geweben oder Organen. Theoretisch könnte die Bioanalyzer potentiell auf jedem Zelltyp verwendet werden, aber es erfordert den Assay für die Zelldichte, Zellkulturmedium, und die Kulturbedingungen zu optimieren (einige spezifische Zellen Platten können erfordern beschichtet gut zu wachsen). Es ist erforderlich, dass die Experimente der OCR Rate innerhalb des akzeptablen Bereichs liegt, um sicherzustellen, abgeschlossen sind. Wenn die OCR in Endothelzellen aus anderen Organen niedriger als CVEs von Gehirn, kann die Zelldichte zu erhöhen helfen, innerhalb eines akzeptablen OCR Bereich zu bekommen. Alternativ kann, wenn Zellen nicht oxidative Phosphorylierung als Hauptenergiequelle verwenden, würde der Bioanalyzer kein optima seinl Assay. Die Bioanalyzer ermöglicht die sequentielle Unterbrechung der Elektronentransportkette, auf der Grundlage der Reihenfolge, in der die Reagenzien aufgebracht werden. Zuerst Oligomycin angewendet wird, welche Mitochondrien Complex V (ATP-Synthase) hemmt. Zweitens FCCP, ein Elektron Entkoppler, angewendet wird, was zur Störung des Protonengradienten führt. Schließlich Rotenon und Antimycin A, welche Mitochondrien Komplexe I und III hemmen bzw. angewendet auf eine vollständige Hemmung des Elektronenflusses zu führen. Die Reihenfolge der Arzneimittelexposition ist wichtig, weil die Medikamente die spezifische Elektronentransportkettenreaktion blockieren, und die sequentiellen Änderungen gemessen werden kann, die die Funktion der Mitochondrien zu reflektieren. Technische Änderungen und Fehlerbehebung Um mitochondrialen Antwort bewerten in CVE-Zellen auf Reize, ist es empfehlenswert, dass die Reize auf Zellen angewandt werden, nachdem die Zellen in der Zellkulturplatte Boden eingehalten werden (siehe Timelinein 1 gezeigt ist ; es dauert in der Regel mindestens 6 h). Um reproduzierbare Ergebnisse durch Behandlungen erhalten, ist es äußerst wichtig, die Zelldichte konsistent zu halten. Wenn Vorbehandlungen vor der Zellaussaat ausgelegt sind, die Zelldichte für jede Vorbehandlung sollte sorgfältig gemessen, ohne die toten Zellen für die Aussaat. Wenn die Transfektion im experimentellen Design enthalten ist, finden Sie in der Transfektion Protokoll des Herstellers. Nachgewiesene in in Abbildung Daten 4 wurde miR-34a in die CVE - Zellen , die eine Lipofectamin - Transfektion - Kit, die Antibiotika-freien Zellkulturmedium und eine Mito-Stresstest zur Beurteilung der Veränderungen in der metabolischen Funktion mit Überexpression von miR-34a erfordert . Die Dosen von Plasmid kann auch optimiert werden, wie zuvor 13 veröffentlicht. Eine weitere Änderung, die dem Protokoll vorgenommen werden können, verändert sich die Konzentrationen der Reagenzien. Eine Titrationskurve von Oligomycin, FCCP und / oder Rotenon und Antimycin A kann completed. Darüber hinaus, wenn dieser Assay mit hohem Durchsatz verwendet wird , aus verschiedenen Arzneimitteln analysiert, wird vorgeschlagen , einen parallelen Assays umfassen die Lebensfähigkeit der Zellen und die Zellproliferation zu messen, die in unseren früheren Veröffentlichungen 7,13 beschrieben wurde. Die OCR - Werte signifikant von der Zellzahl (2 und 3) und die Zellproliferation und Lebensfähigkeitstests profitieren die Normalisierung der Daten beeinflusst. Jedoch sind die Vollendung dieser Assays im Ermessen des jeweiligen Labor. Einschränkungen der Technik Die Hauptbeschränkung dieses Protokolls besteht darin , dass man nur eine in vitro Zellkulturmodell in der Studie verwendet. Zur Zeit gibt es keine verfügbaren ex - vivo - Modellen oder Tiermodellen , die die Funktion der Mitochondrien Endothelzellen richten. Neue Modelle werden erwartet , für die Auswertung der bioenergetischen Funktion in vivo entwickelt werden , und <em&gt; ex vivo in zukünftigen Studien. Eine weitere Einschränkung ist die Ausdehnung der Sperrabschätzungen nach den bioenergetics Maßnahmen. Die Experimente können nicht ausgeführt werden, weil, erstens, die nach Abschluss der bioenergetischen Messungen wird die Lebensfähigkeit der Zellen nach vollständiger Unterbrechung der Elektronentransportkette vermindert; zweitens spezielle Zellkulturplatten und Einsätze erforderlich sind Bioenergetik Werte zu erkennen und nicht-Einsätze für Barriereprüfungen passen. Daher gibt es nicht viele funktionelle Assays, die nach dem bioenergetics Assay abgeschlossen werden kann. Es wird jedoch erwartet, dass spezielle Geräte funktionelle Assays entwickelt werden können, vor dem bioenergetics Assay durchzuführen. Bedeutung der Technik in Bezug auf bestehende / Alternativmethoden Frühere Verfahren erforderten die Isolierung von Mitochondrien aus den Zellen 18 mitochondriale Funktion zu bewerten. Diese new Technik der Bioanalyzer mit ermöglicht die Messung der mitochondrialen Aktivität in intakten Zellen, die mehr von der zellulären Umgebung bewahrt als isolierte Mitochondrien zu bewerten. Zukünftige Anwendungen oder Anfahrt nach dieser Technik Mastering Dieses Protokoll wurde entwickelt und für die bEnd.3 Zelllinie entwickelt, aber es ist auch kompatibel mit primären zerebralen vaskulären endothelialen (pCVE) Zellen 7 oder andere Endothel, und das haben wir 7 unter Verwendung von pCVE Zellen in unserer früheren Veröffentlichung demonstriert. Wenn andere Arten von Endothel verwendet werden, kann die Beschichtung der Kulturplatte und die Verwendung von Wachstumsfaktoren erforderlich. Jedoch wird die Titration Assay für andere Zelltypen als auch empfohlen. Dieses Protokoll bietet ein allgemeines Verfahren in der Auswertung der bioenergetics von CVE Zellen angenommen werden, und es kann weiter Mechanismus Studien oder therapeutische Antworten auf diese Weise angewendet werden.

Es ist allgemein anerkannt, dass die Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​durch cerebral vascular endothelial (CVE) Zellen gebildet hat sehr unterschiedliche und einzigartige Funktionen, ausschlaggebend für die vaskuläre biology. Diese Endothelzellen verwenden Mitochondrien meisten der zellulären Zufuhr von Adenosintriphosphat (ATP) als Quelle für chemische Energie zu erzeugen. Zusätzlich ATP für die CVE Zellen bereitzustellen, regulieren Mitochondrien verschiedene zelluläre Prozesse in vaskulären endothelialen Zellen, wie zelluläre Signal 1-4, Apoptose 5, und die Kontrolle des Zellzyklus und Zellwachstum . 6 Dysregulation der mitochondrialen bioenergetischen Funktion in Zellen CVE kann sich auf mitochondrialen Biogenese, zu einer Beeinträchtigung der vaskulären Endothel - Aktivität führt, und verschärfen zerebrovaskuläre Erkrankungen und neurodegenerativen Erkrankungen, zB Schlaganfall 7,8 und Alzheimer-Krankheit (AD) 9. Wir haben gezeigt, dass Beschimpfungen zu CVE-Zellen nach Exposition mit lipopolysacrid (LPS) die Funktion der Mitochondrien in CVE - Zellen beeinträchtigen und verschlechtern Hub 7 Ergebnisse. Tert-Butylhydrochinon (TBHQ) erhöht Schlaganfall Sterblichkeit um 10 in CVE - Zellen mit oxidative Phosphorylierung zu stören. Daher stellt die quantitative Modell der bioenergetischen Funktion in CVE-Zellen nicht nur Piloten eine Reihe von Mechanismus bezogenen Studien für das zentrale Nervensystem (ZNS) Erkrankungen, sondern auch einen Durchbruch in der Wirkstoff-Screening von Therapeutika mitochondrialen Funktion in der Gefäßbiologie Targeting. Isolierte Mitochondrien wurden verwendet bioenergetischen Funktion zu messen. Wir haben 7 und andere 11 haben Einschätzungen von zellulären Bioenergetik in intakten Zellen CVE berichtet durch einen extrazellulären Fluss Bioanalyzers verwenden. Der Analysator bietet den Vorteil der endogenen zellulären bioenergetischen Beurteilung. Dieser empfindliche und konsistente Assay misst den mitochondrialen Metabolismus von CVE Zellen und kann verwendet werden bioenergetischen Beeinträchtigung durch sti auszuwertenmuli, untersuchen die Mechanismen der mitochondrialen Signalwege und Bildschirm Medikamente oder Behandlungen, die die Funktion der Mitochondrien in CVE-Zellen beeinflussen. Die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) wird durch die Bioanalyzers aufgezeichnet eine pharmakologische Profilierung Ansatz durch die Verwendung von vier mitochondrialen Disruptoren Kombination: Oligomycin, Carbonyl- Cyanid-4 (trifluormethoxy) phenylhydrazons (FCCP), Rotenon und Antimycin A. In diesem Protokoll wir ausführlich eine optimierte Ansatz, der für die Messung und Berechnung der mitochondrialen Funktionsparameter in CVE-Zellen, einschließlich basalen mitochondriale Atmung, die ATP-Produktion, Protonenleck, maximale Atmung und Ersatzatemkapazität, in einem einzigen Assay ermöglicht.

<table><tbody><tr><td>bEnd.3 Zelllinie</td><td>ATCC</td><td>CRL-2299</td><td>25 - 30 Passagen</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12450</td><td>10% Endkonzentration</td></tr><tr><td>Penicillin/Steptomycin</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>1&fach; 100 Strumpf</td></tr><tr><td>0,25 % Trypsin, 0,03 % EDTA-Lösung</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Corning</td><td>25-000-CI</td><td>1,0 & Mikro; M Endkonzentration</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>CAS 50-99-7</td><td>25 mM Endkonzentration</td></tr><tr><td>Oligomycin</td><td>Sigma</td><td>O4876</td><td>1,0 &micro; M Endkonzentration</td></tr><tr><td>Carbonilcyanid 4-(trifluormethoxy)phenylhydrazon (FCCP)</td><td>Sigma</td><td>C2920</td><td>0,5 &micro; M Endkonzentration</td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Sigma</td><td>R8875 1,0</td><td>&micro; M Endkonzentration</td></tr><tr><td>Antimycin A</td><td>Sigma</td><td>CAS 1397-94-0</td><td>1,0 &Mikro; M Endkonzentration</td></tr><tr><td>Plattenwaschstation</td><td>Seahorse Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biozelluläres Flussmittel Bioanayzer&nbsp; &nbsp;</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>XFe96</td><td></td></tr><tr><td>Extrazelluläre Flussmittel-Zellkulturplatte</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>102416-100</td><td></td></tr><tr><td>Extrazelluläre Flussmittel-Sensorkartusche</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>102416-100</td><td></td></tr><tr><td>Extrazelluläre Flussmittel-Kalibrierungslösung</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>100840-000</td><td></td></tr><tr><td>Extrazelluläres Flussmittel</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>102365-100</td><td>PH vor dem Assay gepuffert</td></tr></tbody></table>

auswertung der bioenergetischen funktion in cerebral vascular endothelial cells

Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells

Die Integrität der Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​ist kritisch Hirnverletzung zu verhindern. Zerebrale vaskuläre Endothel (CVE) -Zellen sind eine der Zelltypen, die die BBB umfassen; Diese Zellen haben eine sehr hohe Energiebedarf, der optimal mitochondrialen Funktion erfordert. Im Falle von Krankheit oder Verletzung kann die mitochondriale Funktion in diesen Zellen verändert werden, was zu einer Erkrankung oder der Öffnung der BBB. In diesem Manuskript, stellen wir eine Methode die Funktion der Mitochondrien in CVE-Zellen zu messen, indem unter Verwendung von Voll, intakte Zellen und eine Bioanalyzer. Ein Mito-Stress-Test wird verwendet, um die Zellen in Frage zu stellen, die entweder physikalisch oder chemisch gestört wurden, und ihre bioenergetischen Funktion auswerten. Darüber hinaus bietet dieses Verfahren auch eine nützliche Möglichkeit, um neue Therapeutika zu suchen, die direkte Auswirkungen auf die Funktion der Mitochondrien haben. Wir haben die Zelldichte optimiert erforderlichen Sauerstoffverbrauchsraten zu erzielen, die für die Berechnung einer Vielzahl von mitochondrialen para ermöglichenMeter, einschließlich der ATP-Produktion, maximale Atmung und freie Kapazitäten. Wir zeigen auch die Empfindlichkeit des Assays durch den Nachweis, daß die Einführung der MikroRNA, miR-34a, führt zu einer ausgeprägten und detektierbare Abnahme der mitochondrialen Aktivität. Während die in diesem Dokument dargestellten Daten für die bEnd.3 Zelllinie optimiert ist, haben wir optimiert auch das Protokoll für die primäre CVE-Zellen, ferner die Nützlichkeit in der präklinischen und klinischen Modellen hindeutet.

Um die bioenergetischen Funktion von CVE - Zellen als Reaktion auf oxidativen Stress beurteilen zu können , wählten wir die Maus Gehirn mikrovaskulären Endothel - Zelllinie bEnd.3, die die gleichen Vergleichsbarriereeigenschaften als primäre Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen 12 zeigt. Da die Kinetik und die relative Intensität der Reaktion sind unter den verschiedenen Zelltypen variiert, wurden die erste Serie von Experimenten entwickelt messbare OCR Ebenen zu erhalten, indem die optimale Anzahl von bEnd.3 Zellen identifiziert in dem Assay zur metabolischen Profils zu verwenden, gezeigt in Abbildung 2. Nach der Auswertung werden die Daten quantifiziert und dargestellt in Abbildung 3. Basalatmung, maximale Atmung und Ersatzatemkapazität zeigte eine proportionale Reaktion mit Zelldichte. ATP - Produktion verringerte sich jedoch bei 64 × 10 3 Zellen pro Vertiefung ausgewählt wurden, was darauf hindeutet , dass die Über konfluenten ZellkulturFür dieses Experiment nicht geeignet. Die optimalen Zelldichten auftreten zwischen 8-32 × 10 3 Zellen pro Vertiefung auf der Grundlage der Antwort auf die mitochondriale Disruptoren. Für nachfolgende Experimente eine Aussaatdichte von 16 × 10 3 Zellen pro Vertiefung verwendet wurde für die optimale Detektion von Änderungen in OCR zu ermöglichen. Mit 16 × 10 3 Zellen pro Vertiefung, beobachteten wir die erwarteten Antworten in OCR und gezeigt , dass die microRNA miR-34a die Funktion der Mitochondrien in CVE - Zellen (Abbildung 4) reduziert. Wir haben früher , dass miR-34a oxidative Phosphorylierung 13 in diesen Zellen reduziert berichtet. Die wiederholten Versuche zeigten auch , dass eine maximale Atmungs und Ersatzkapazität durch die Überexpression von miR-34a deutlich in CVEs bei 24 h nach der Transfektion verringert wurden, obwohl die Basalatmung, ATP - Produktion, und Protonenleck hatten keine signifikanten Änderungen (Figur 4) . Diese Datenveranschaulichen die Empfindlichkeit der Bioanalyzer Veränderungen in der mitochondrialen Funktion in CVEs zu detektieren. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig1.jpg" /> Abbildung 1. Strategische Planung für das Experiment. Der Zeitplan für die Zelle, Platte, und die Patrone Vorbereitung angezeigt wird . <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54847/54847fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54847/54847fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig2.jpg" /> Abbildung 2. Repräsentative Rohdaten von bioenergetischen Funktion in CVE Zellen mit verschiedenen Zelldichten. Der Sauerstoffverbrauch Raten wurden in CVE - Zellen mit unterschiedlichen Zelldichten gemessen. Die Daten stellen den Mittelwert ± SD (n = 5); OCR: Sauerstoffverbrauchsrate; FCCP: carbonyl Cyanid-4- (trifluormethoxy) phenylhydrazon;<html> Rot / Anti-A: Rotenon und Antimycin A. ①, ② und ③ zeigen Basalatmung; ④, ⑤ und ⑥ zeigen ATP verknüpft Atmung; ⑦, ⑧ und ⑨ zeigen maximale Atmung; ⑩, ⑪ und ⑫ zeigen nicht die mitochondriale Atmung. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54847/54847fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54847/54847fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig3.jpg" /> Abbildung 3. Repräsentative Ergebnisse von bioenergetischen Funktion in CVE Zellen mit verschiedenen Zelldichten. Basalatmung, die ATP - Produktion, maximale Atmung und freie Kapazitäten aus den Rohdaten von den Bioenergetik funktionellen Test in Abbildung 2 mit den Formeln generiert berechnet werden in Abschnitt 4 angegeben . Die Daten repräsentieren den Mittelwert ± SD (n = 5) bedeuten; OCR: Sauerstoffverbrauchsrate.<html> f = &quot;http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54847/54847fig3large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig4.jpg" /> Abbildung 4: Repräsentative Ergebnisse von Verminderte Bioenergetische Funktion von miR-34a (A) Rohdaten der mitochondrialen Funktion nach Überexpression von miR-34a bei 24 h nach der Transfektion.. (B) Basalatmung, die ATP - Produktion, maximale Atmung und freie Kapazitäten werden aus den Rohdaten von den Bioenergetik funktionellen Test in 4A erzeugt berechnet; die Parameter durch die Formeln in Abschnitt 4. Die Überexpression von miR-34a reduziert die Funktion der Mitochondrien in CVE-Zellen bei 24 h nach der Transfektion angegeben berechnet werden. Die Daten stellen den Mittelwert ± SD (n = 5); OCR: Sauerstoffverbrauchsrate. ****, P &lt;0,0001.files / ftp_upload / 54847 / 54847fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Tabelle 1" src="/files/ftp_upload/54847/54847table1.jpg" /> Tabelle 1. Das Instrument Run Protokoll.

Endothelzelle Mitochondrien sind kritisch Blut-Hirn-Schranke Integrität aufrechtzuerhalten. Wir führen ein Protokoll bioenergetischen Funktion in der zerebralen vaskulären Endothelzellen zu messen.

Auswertung der bioenergetischen Funktion in Cerebral Vascular Endothelial Cells

The integrity of the blood-brain-barrier (BBB) is critical to prevent brain injury. Cerebral vascular endothelial (CVE) cells are one of the cell types ...

Die allgemeinen Ziele dieses Verfahrens bestehen darin, zu untersuchen, wie Veränderungen der mitochondrialen Funktion die Entstehung neurologischer Erkrankungen beeinflussen, und Therapeutika zu entwickeln, die direkt auf die Öffnung der Blut-Hirn-Schranke wirken. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich neurologischer Erkrankungen zu beantworten, beispielsweise, wie der neuronale Zelltod nach einem Schlaganfall minimiert werden kann. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine Echtzeitanalyse der mitochondrialen Funktion in intakten Zellen ermöglicht.Nachdem die zerebralen vaskulären Endothelzellen in vollständigem Medium in einem T75 cm² Zellkulturgefäß bei 37 °C und 5 % CO₂ bis zu einer Konfluenz von 80 % gezüchtet wurden, entsorgen Sie das Zellkulturmedium und waschen die Zellen mit Trypsin-EDTA. Geben Sie anschließend ein bis zwei Milliliter frisches Trypsin-EDTA in das Gefäß und lösen Sie die Zellen bei 37 °C drei bis fünf Minuten lang ab. Nach Bestätigung der Ablösung der Zellen unter einem invertierten Mikroskop beenden Sie die Reaktion durch vorsichtige Zugabe von 10 Milliliter frischem vollständigem Zellkulturmedium und überführen die Zellen in ein kegelförmiges 15-Milliliter-Röhrchen zur Zentrifugation.Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet in 10 Milliliter frischem, vollständigem Wachstumsmedium vor einer weiteren Zentrifugation. Suspendieren Sie das Pellet anschließend im vollständigen Wachstumsmedium erneut mit einer Konzentration von zwei mal 10 hoch fünf Zellen pro Milliliter für die Unterkultur. Nach der geeigneten Anzahl an Unterkulturen geben Sie 1,6 mal 10 hoch vier Zellen in 80 Mikroliter vollständigem Medium pro Vertiefung in eine 96-Well-Extrazellulärer-Flux-Zellkulturplatte und stellen Sie die Platte in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid.Nachdem die Zellen an die Platte angeheftet sind, fügen Sie die gewünschte Behandlung den entsprechenden Vertiefungen hinzu und stellen Sie die Zellen zurück in den Inkubator. Am Tag vor dem Test zur Beurteilung der mitochondrialen Funktion befeuchten Sie eine Kartusche für den extrazellulären Fluss-Sensor mit 150 Mikroliter Kalibrierlösung für den extrazellulären Fluss und inkubieren die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius ohne Kohlendioxid. Am nächsten Morgen verwenden Sie die Plattenwaschanlage, um das Zellkulturmedium durch ein extrazelluläres Fluss-Testmedium mit pH 7,0 zu ersetzen.Anschießend die Zellen 30 bis 60 Minuten lang bei 37 Grad Celsius ohne Kohlendioxid inkubieren. Wenn die Zellen ausgeglichen sind, die hydratisierte Kartusche in den Bioanalyzer einlegen und auf die Schaltfläche „Start“ klicken, um die Kalibrierung zu beginnen. Am Ende der Kalibrierung die Aufforderung „Kartusche entsperren“ anklicken, um die Bodenplatte der Kartusche zu entfernen und die Zellplatte einzulegen.Öffnen Sie anschließend die Datendatei, um die Ratenwerte vom Bioanalyzer für den Export in die Tabellenkalkulationsdatei zu erhalten. Da die Kinetik und die relative Intensität der Reaktionen zwischen den verschiedenen Typen zerebraler vaskulärer Endothelzellen variieren, wurde in diesen Experimenten eine Reihe von Konzentrationen von bEnd.3-Zellen verwendet, um die optimale Zellanzahl zur Bestimmung der Sauerstoffverbrauchsrate in einem metabolischen Profiling-Assay zu identifizieren.Wie beobachtet, zeigen die basale und maximale Atmung sowie die respiratorische Reservkapazität eine proportionale Reaktion auf die Zelldichte. Die ATP-Produktion nimmt jedoch ab, wenn die höchste Zellkonzentration pro Mulde verwendet wird, was darauf hindeutet, dass eine überkonfluente Zellkultur für das Experiment nicht geeignet ist. Die optimalen Zelldichten scheinen im mittleren Bereich der Zellanzahl pro Mulde zu liegen.Daher wurden die erwarteten Sauerstoffverbrauchsrate-Werte in diesem repräsentativen Experiment unter Verwendung einer mittleren Zellkonzentration bewertet, wodurch gezeigt wurde, dass nichtkodierende prä-mRNA-Moleküle die mitochondriale Funktion in zerebralen vaskulären Endothelzellen verringern. Diese Experimente zeigen außerdem, dass die maximale Atmung und die Reservkapazität signifikant durch die Überexpression dieser Moleküle in zerebralen vaskulären Endothelzellen 24 Stunden nach der Transfektion abgenommen sind, obwohl die basale Atmung, die ATP-Produktion und der Protonenleck keine signifikanten Veränderungen aufweisen. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie innerhalb von zwei Tagen abgeschlossen werden.Von der Zellausplattierung bis zur Bestimmung der mitochondrialen Funktion, sofern es ordnungsgemäß durchgeführt wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass die Ermittlung der optimalen Zelldichte vor Beginn aller weiteren Verfahren äußerst wichtig ist. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden, wie Assays zur Zellviabilität oder zur Glykolyse, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen bezüglich der Veränderungen in der mitochondrialen Funktion aufgrund einer verminderten Zellviabilität oder Veränderungen in anderen Stoffwechselwegen zu beantworten.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher im Bereich der mitochondrialen Funktion, um intakte Zellen anstelle isolierter Mitochondrien zu verwenden, und zwar bei einer Vielzahl von Erkrankungen, einschließlich neurologischer Erkrankungen, Krebs oder Stoffwechselstörungen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die mitochondriale Funktion in zerebralen vaskulären Endothelzellen untersucht.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Diese Methode beschreibt, wie zu isolieren und zu verewigen mikrovaskulären Endothelzellen von der Maus Gehirn. Wir beschreiben ein Schritt-für-Schritt-Protokoll ausgehend von der Homogenisierung von Hirngewebe, Verdauungsschritten, Aussaat und Immortalisierung der Zellen. Normalerweise dauert es etwa fünf Wochen, um eine homogene, verewigt mikrovaskuläre Endothelzellen Zelllinie zu erhalten.

Erzeugung eines Immortalisierte Murine Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen Zelllinie als<em&gt; In Vitro</em&gt; Blut-Hirn-Barriere Modell

Dieses Video zeigt die Beurteilung der mitochondrialen Funktion von zerebralen vaskulären endothelialen (CVE) Zellen mit Hilfe eines extrazellulären Flux-Assays. CVE-Zellen werden in einer extrazellulären Flussmittel-Zellkulturplatte plattiert. Extrazelluläre Flusssensoren werden hydratisiert, bevor sie in den Bioanalysator geladen und kalibriert werden. Die Platte mit den Zellen wird dann zur Analyse geladen.

Beurteilung der mitochondrialen Funktion in zerebralen vaskulären Endothelzellen

Endotheliale Dysfunktion ist mit zahlreichen Krankheitszuständen verbunden und prädiktiv für unerwünschte kardiovaskuläre Ereignisse bei Menschen. Flussvermittelte Vasodilatation (FMD) ein nicht-invasiven Ultraschall Verfahren zur Bewertung der endothelialen Funktion. Methodische Entscheidungen und Erfahrung des Bedieners können die Ergebnisse beeinflussen. Ein systematischer Ansatz zur Bekämpfung der MKS in Studien am Menschen wird hier diskutiert.

Ultraschall Beurteilung der Endothelial Abhängige Fluss Vasodilatation der Arteria brachialis in der klinischen Forschung

Mikrovaskuläre Endothelzellen (BMEC) des Gehirns sind durch spezifische Verbindungsproteine miteinander verbunden, die eine hochregulierte Barriere zwischen Blut und dem Zentralnervensystem (ZNS) bilden, die sogenannte Blut-Hirn-Schranke (BHS). Die Isolierung primärer mikrovaskulärer Endothelzellen des murinen Gehirns, wie in diesem Protokoll beschrieben, ermöglicht detaillierte in vitro-Studien der BHS.

Isolierung von primären murinen Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen

Der vorliegende Artikel beschreibt die methodischen Überlegungen für mehrere nicht-invasive Beurteilungen der Gefäßfunktion und -morphologie, die in der medizinischen Forschung häufig zur Beurteilung verschiedener Stadien der Atherosklerose verwendet werden.

Einen methodischen Ansatz, um Nicht-invasive Assessments der Gefäßfunktion und Morphologie

Wir beschreiben eine einfache zellbasierten Bioassay zum Nachweis, zur Quantifizierung und Überwachung der Aktivität der Mitglieder der vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor-Familie von Liganden. Der Assay verwendet chimären Rezeptoren in einem Faktor-abhängigen Zelllinie exprimiert eine semi-quantitative oder quantitative Bewertung der Rezeptorbindung bereitzustellen, und die Vernetzung durch den Liganden.

Eine einfache Bioassay für die Beurteilung von Vascular Endothelial Growth Factors

Hier demonstriert werden Protokolle zur intakten zerebralen Endothelzellen "Röhren" und (2) die gleichzeitige Messung von endothelialen Kalzium und Membranpotential im Endothel-derived Hyperpolarisation (1) frisch zu isolieren. Des weiteren können diese Methoden für die pharmakologische Optimierung von Endothelzellen Kalzium und elektrische Signalisierung als Einzel- oder interaktive experimentellen Variablen.

Gleichzeitige Messung von intrazellulären Calcium und Membrane Potential in frisch isolierte und intakte Maus zerebralen Endothel

Wir präsentieren drei einfache In-vitro-Assays – den Fernmigrations-Assay, den Co-Kultur-Migrations-Assay und den Chemo-Attraktions-Assay,der die Funktionen menschlicher Stammzell abgeleiteter periventrikulärer Endothelzellen und deren Interaktion mit GABAerge Interneurons.

Migration, Chemo-Attraktion und Co-Culture-Assays für menschliche Stammzell-abgeleitete Endothelzellen und GABAerge Neuronen

Die intensive Vorbereitung intakter zerebraler endothelialer "Röhrchen" der Maus aus den zerebralen parenchymalen Arteriolen wird für die Untersuchung der zerebralen Blutflussregulation veranschaulicht. Darüber hinaus demonstrieren wir die experimentellen Stärken dieses endothelialen Studienmodells für die Fluoreszenzbildgebung und die elektrophysiologische Messung wichtiger zellulärer Signalwege, einschließlich Änderungen des intrazellulären [Ca2+] und des Membranpotentials.

Isolierung und funktionelle Analyse des arteriolären Endothels des Hirnparenchyms der Maus

Dieses Protokoll beschreibt ein zuverlässiges und effizientes In-vitro-Modell der Blutschranke des Gehirns. Die Methode verwendet zerebrale vaskuläre Endothelzellen der Maus bEnd.3 und misst den elektrischen Widerstand der Transmembran.

Aufzeichnung der funktionellen Barriereintegrität auf bEnd.3 vaskulären Endothelzellen mittels transendothelialer elektrischer Widerstandsdetektion

Hier demonstrieren wir die Technik der Verwendung impedanzbasierter Biosensoren: ECIS und cellZscope zur Messung der Endothelbarriere des Gehirns. Wir beschreiben die Vorbereitung und Technik des Hinzufügens verschiedener Stimuli zu einem in vitro-Modell des Gehirnendothels. Wir messen, erfassen und analysieren die Ergebnisse repräsentativ.

Messung von Veränderungen der Integrität der endothelialen Barriere des Gehirns mit zwei impedanzbasierten Biosensoren als Reaktion auf Krebszellen und Zytokine

Lernen Sie die Bewertung mitochondrialer Funktion in zerebrovaskulären Endothelzellen für Neurowissenschaften. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Analysen zur Untersuchung der Blut-Hirn-Schranken-Integrität.

Auswertung der bioenergetischen Funktion in Cerebral Vascular Endothelial Cells

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