Auswertung der bioenergetischen Funktion in Cerebral Vascular Endothelial Cells

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, zu beurteilen, wie sich Veränderungen der mitochondrialen Funktion auf die Entwicklung neurologischer Erkrankungen auswirken, und Therapeutika zu entwickeln, die eine direkte Wirkung auf die Öffnung der Blut-Hirn-Schranke haben. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich neurologischer Erkrankungen zu beantworten, wie z.B. wie der neuronale Zelltod nach einem Schlaganfall minimiert werden kann. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine Echtzeit-Bewertung der mitochondrialen Funktion in ganzen intakten Zellen ermöglicht.

Nachdem die zerebralen vaskulären Endothelzellen in vollständigem Medium in einem T75 Zentimeter großen quadratischen Gewebekulturkolben bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid bis 80 % Konfluenz gezüchtet wurden, verwerfen Sie das Zellkulturmedium und spülen Sie die Zellen mit Trypsin-EDTA. Geben Sie dann ein bis zwei Milliliter frisches Trypsin-EDTA in den Kolben und lösen Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius für drei bis fünf Minuten. Nachdem Sie bestätigt haben, dass die Zellen unter einem inversen Mikroskop angehoben wurden, stoppen Sie die Reaktion durch sanfte Zugabe von 10 Millilitern frischem vollständigem Zellmedium und überführen Sie die Zellen zur Zentrifugation in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen.

Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet in 10 Millilitern frischem Vollwachstumsmedium für eine weitere Zentrifugation. Suspendieren Sie dann das Pellet in vollständigem Wachstumsmedium in einer Konzentration von zweimal 10 bis fünf Zellen pro Milliliter für die Subkultur. Nach der entsprechenden Anzahl von Subkulturen säen Sie 1,6 mal 10 bis die vierten Zellen in 80 Mikrolitern vollständigem Medium pro Vertiefung auf eine extrazelluläre Flux-Zellkulturplatte mit 96 Brunnen aus und stellen Sie die Platte in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid.

Wenn sich die Zellen an der Platte festgesetzt haben, geben Sie die gewünschte Behandlung in die entsprechenden Vertiefungen und geben Sie die Zellen wieder in den Inkubator. Hydratisieren Sie am Tag vor dem mitochondrialen Funktionsbewertungsassay eine extrazelluläre Flussmittelzensurpatrone mit 150 Mikrolitern extrazellulärer Flussmittelkalibrationslösung und inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius ohne Kohlendioxid. Verwenden Sie am nächsten Morgen die Plattenwaschstation, um das Zellkulturmedium in ein extrazelluläres Flussmittel-Assay-Medium mit pH 7,0 zu wechseln.

Inkubieren Sie die Zellen dann 30 bis 60 Minuten lang bei 37 Grad Celsius ohne Kohlendioxid. Wenn sich die Zellen äquilibriert haben, laden Sie die hydratisierte Kartusche in den Bioanalysator und klicken Sie auf die Schaltfläche Start, um die Kalibrierung zu starten. Klicken Sie am Ende der Kalibrierung auf die Eingabeaufforderung Patrone entsperren, um die Bodenplatte der Patrone zu entfernen und die Zellenplatte einzulegen.

Öffnen Sie dann die Datendatei, um die Ratenwerte aus dem Bioanalyzer für den Export in die Tabellenkalkulationsdatei zu erhalten. Angesichts der Tatsache, dass die Kinetik und die relative Intensität der Reaktionen zwischen den verschiedenen zerebralen vaskulären Endothelzelltypen variieren, wurde in diesen Experimenten eine Reihe von Konzentrationen von bEnd. 3 Zellen wurden verwendet, um die optimale Anzahl von Zellen für die Messung des Sauerstoffverbrauchs in einem metabolischen Profiling-Assay zu identifizieren.

Wie beobachtet, zeigen die basale und maximale Atmung sowie die freie Atmungskapazität eine proportionale Reaktion auf die Zelldichte. Die ATP-Produktion nimmt jedoch ab, wenn die höchste Konzentration von Zellen pro Vertiefung verwendet wird, was darauf hindeutet, dass eine überkonfluente Zellkultur für das Experiment nicht geeignet ist. Die optimalen Zelldichten scheinen im mittleren Bereich der Zellzahlen pro Vertiefung zu liegen.

Daher wurden in diesem repräsentativen Experiment die zu erwartenden Sauerstoffverbrauchsraten anhand einer Zellkonzentration im mittleren Bereich bewertet, was zeigt, dass nicht-kodierende Vorläufer-mRNA-Moleküle die mitochondriale Funktion in zerebralen vaskulären Endothelzellen reduzieren. Diese Experimente zeigen auch, dass die maximale Atmung und die freie Kapazität durch die Überexpression dieser Moleküle in zerebralen vaskulären Endothelzellen 24 Stunden nach der Transfektion signifikant verringert werden, obwohl die basale Atmung, die ATP-Produktion und das Protonenleck keine signifikanten Veränderungen aufweisen. Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei Tagen abgeschlossen werden.

Von der Beschichtung der Zellen bis zum Zugriff auf die mitochondriale Funktion, wenn sie richtig durchgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Bestimmung der optimalen Zelldichte äußerst wichtig ist, bevor Sie mit anderen Verfahren beginnen. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, wie z. B. Zellviabilitäts- oder glykolytische Assays, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu den Veränderungen der mitochondrialen Funktion zu beantworten, die aufgrund einer verminderten Zellviabilität oder Veränderungen in anderen Stoffwechselwegen auftreten.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der mitochondrialen Funktion, um intakte Zellen in isolierten Mitochondrien und einer Vielzahl von Krankheiten, einschließlich neurologischer Erkrankungen, Krebs oder Stoffwechselstörungen, zu verwenden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie auf die mitochondriale Funktion in zerebralen vaskulären Endothelzellen zugreifen können.