Auswertung der bioenergetischen Funktion in Cerebral Vascular Endothelial Cells

Die allgemeinen Ziele dieses Verfahrens bestehen darin, zu untersuchen, wie Veränderungen der mitochondrialen Funktion die Entstehung neurologischer Erkrankungen beeinflussen, und Therapeutika zu entwickeln, die direkt auf die Öffnung der Blut-Hirn-Schranke wirken. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich neurologischer Erkrankungen zu beantworten, beispielsweise, wie der neuronale Zelltod nach einem Schlaganfall minimiert werden kann. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine Echtzeitanalyse der mitochondrialen Funktion in intakten Zellen ermöglicht.

Nachdem die zerebralen vaskulären Endothelzellen in vollständigem Medium in einem T75 cm² Zellkulturgefäß bei 37 °C und 5 % CO₂ bis zu einer Konfluenz von 80 % gezüchtet wurden, entsorgen Sie das Zellkulturmedium und waschen die Zellen mit Trypsin-EDTA. Geben Sie anschließend ein bis zwei Milliliter frisches Trypsin-EDTA in das Gefäß und lösen Sie die Zellen bei 37 °C drei bis fünf Minuten lang ab. Nach Bestätigung der Ablösung der Zellen unter einem invertierten Mikroskop beenden Sie die Reaktion durch vorsichtige Zugabe von 10 Milliliter frischem vollständigem Zellkulturmedium und überführen die Zellen in ein kegelförmiges 15-Milliliter-Röhrchen zur Zentrifugation.

Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet in 10 Milliliter frischem, vollständigem Wachstumsmedium vor einer weiteren Zentrifugation. Suspendieren Sie das Pellet anschließend im vollständigen Wachstumsmedium erneut mit einer Konzentration von zwei mal 10 hoch fünf Zellen pro Milliliter für die Unterkultur. Nach der geeigneten Anzahl an Unterkulturen geben Sie 1,6 mal 10 hoch vier Zellen in 80 Mikroliter vollständigem Medium pro Vertiefung in eine 96-Well-Extrazellulärer-Flux-Zellkulturplatte und stellen Sie die Platte in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid.

Nachdem die Zellen an die Platte angeheftet sind, fügen Sie die gewünschte Behandlung den entsprechenden Vertiefungen hinzu und stellen Sie die Zellen zurück in den Inkubator. Am Tag vor dem Test zur Beurteilung der mitochondrialen Funktion befeuchten Sie eine Kartusche für den extrazellulären Fluss-Sensor mit 150 Mikroliter Kalibrierlösung für den extrazellulären Fluss und inkubieren die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius ohne Kohlendioxid. Am nächsten Morgen verwenden Sie die Plattenwaschanlage, um das Zellkulturmedium durch ein extrazelluläres Fluss-Testmedium mit pH 7,0 zu ersetzen.

Anschießend die Zellen 30 bis 60 Minuten lang bei 37 Grad Celsius ohne Kohlendioxid inkubieren. Wenn die Zellen ausgeglichen sind, die hydratisierte Kartusche in den Bioanalyzer einlegen und auf die Schaltfläche „Start“ klicken, um die Kalibrierung zu beginnen. Am Ende der Kalibrierung die Aufforderung „Kartusche entsperren“ anklicken, um die Bodenplatte der Kartusche zu entfernen und die Zellplatte einzulegen.

Öffnen Sie anschließend die Datendatei, um die Ratenwerte vom Bioanalyzer für den Export in die Tabellenkalkulationsdatei zu erhalten. Da die Kinetik und die relative Intensität der Reaktionen zwischen den verschiedenen Typen zerebraler vaskulärer Endothelzellen variieren, wurde in diesen Experimenten eine Reihe von Konzentrationen von bEnd.3-Zellen verwendet, um die optimale Zellanzahl zur Bestimmung der Sauerstoffverbrauchsrate in einem metabolischen Profiling-Assay zu identifizieren.

Wie beobachtet, zeigen die basale und maximale Atmung sowie die respiratorische Reservkapazität eine proportionale Reaktion auf die Zelldichte. Die ATP-Produktion nimmt jedoch ab, wenn die höchste Zellkonzentration pro Mulde verwendet wird, was darauf hindeutet, dass eine überkonfluente Zellkultur für das Experiment nicht geeignet ist. Die optimalen Zelldichten scheinen im mittleren Bereich der Zellanzahl pro Mulde zu liegen.

Daher wurden die erwarteten Sauerstoffverbrauchsrate-Werte in diesem repräsentativen Experiment unter Verwendung einer mittleren Zellkonzentration bewertet, wodurch gezeigt wurde, dass nichtkodierende prä-mRNA-Moleküle die mitochondriale Funktion in zerebralen vaskulären Endothelzellen verringern. Diese Experimente zeigen außerdem, dass die maximale Atmung und die Reservkapazität signifikant durch die Überexpression dieser Moleküle in zerebralen vaskulären Endothelzellen 24 Stunden nach der Transfektion abgenommen sind, obwohl die basale Atmung, die ATP-Produktion und der Protonenleck keine signifikanten Veränderungen aufweisen. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie innerhalb von zwei Tagen abgeschlossen werden.

Von der Zellausplattierung bis zur Bestimmung der mitochondrialen Funktion, sofern es ordnungsgemäß durchgeführt wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass die Ermittlung der optimalen Zelldichte vor Beginn aller weiteren Verfahren äußerst wichtig ist. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden, wie Assays zur Zellviabilität oder zur Glykolyse, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen bezüglich der Veränderungen in der mitochondrialen Funktion aufgrund einer verminderten Zellviabilität oder Veränderungen in anderen Stoffwechselwegen zu beantworten.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher im Bereich der mitochondrialen Funktion, um intakte Zellen anstelle isolierter Mitochondrien zu verwenden, und zwar bei einer Vielzahl von Erkrankungen, einschließlich neurologischer Erkrankungen, Krebs oder Stoffwechselstörungen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die mitochondriale Funktion in zerebralen vaskulären Endothelzellen untersucht.