Analyse der antigenen Beziehung zwischen Viren mit Hilfe eines bildbasierten Mikroneutralisationsassays

Geben Sie Medien und seriell verdünnte, rezeptorzerstörende, enzymbehandelte Antiseren auf Monoschichten von Säugetierzellen, um eine unspezifische Virusbindung zu verhindern.

Fügen Sie eine Influenzavirussuspension hinzu. Antiseren-Antikörper, die spezifisch für virale Proteine sind, binden, neutralisieren Viren und verhindern das Eindringen in die Zelle.

Niedrige neutralisierende Antikörperkonzentrationen oder nicht-neutralisierende Antikörper ermöglichen eine ineffektive Bindung viraler Antigene, die die Virusbindung an Zellrezeptoren ermöglicht.

Medien entsorgen. Tragen Sie zellulosehaltige Medien auf und bilden Sie eine halbfeste Deckschicht.

Das Virus nutzt die Wirtszellmaschinerie, um Viruspartikel zu bilden und eine Zelllyse zu verursachen.

Das Overlay schränkt die Virusbewegung ein, erleichtert eine lokalisierte Infektion und erzeugt Löcher in den Zellmonoschichten.

Entfernen Sie das Overlay. Fixieren und permeabilisieren Sie die Zellen.

Mit Puffer waschen. Fügen Sie Antikörper hinzu, die virale Antigene in permeabilisierten Zellen binden.

Pipettieren Sie Meerrettichperoxidase-konjugierte Sekundärantikörper, die an Primärantikörper binden.

Führen Sie Peroxidasesubstrate und Wasserstoffperoxid ein, was zu einem blauen Produkt führt.

Bildvertiefungen zur Quantifizierung virusinfizierter Zellpopulationen gegen Antiserumverdünnungen.

Identifizieren Sie Antiserenverdünnungen, die auf eine bestimmte Reduktion einer infizierten Zellpopulation hinweisen, um Neutralisationstiter zu bestimmen.

Um die Virusneutralisation durchzuführen, bereiten Sie die Zellmonoschicht zwei oder drei Tage im Voraus vor und geben Sie dann 50 Mikroliter VGM in jede Vertiefung der Platte. Verwenden Sie die Spalten 11 und 12 für die Virus- bzw. Zellkontrolle. Geben Sie 50-Mikroliter-Aliquots einer 1:20-Verdünnung eines rezeptorzerstörenden Enzyms oder RDE-behandeltem Serum in die erste Reihe der Spalten 1 bis 10.

werden zweifache serielle Verdünnungen durchgeführt, indem 50 Mikroliter von Reihe A in Reihe H überführt und 50 Mikroliter aus Reihe H verworfen werden. Geben Sie dann 50 Mikroliter Verdünnungsmittel in jede Vertiefung der Zellkontrollsäule. Geben Sie 50 Mikroliter des Virus in jede Vertiefung der Platte, mit Ausnahme der Zellkontrollsäule. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für zwei bis drei Stunden. Entfernen Sie dann das Inokulum und fügen Sie das Overlay zu jeder Vertiefung hinzu. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius ungestört. Fixieren und färben Sie dann die Platten.

Um die Neutralisation zu quantifizieren, platzieren Sie eine Well-Platte im Scanbereich eines Flachbettscanners. Scannen Sie die Platte und führen Sie die Well-Plate-Reader-Software aus, um die erforderlichen Virustiter zu berechnen.