Name: Studieren Mitochondrial Struktur und Funktion in Drosophila Ovarien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Lernen Sie Methoden zur Analyse mitochondrialer Struktur und Funktion in lebendem und fixiertem Drosophila melanogaster-Gewebe. Diese Techniken ermöglichen detaillierte Einblicke in die Regulationsmechanismen der Mitochondrienfunktionalität.

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Wir danken Leena Patel und Diamond Woodard für ihre Hilfe bei der Vorbereitung des Drosophila-Mediums und Dr. Igor Chesnokov für den Zugang zum an der Kamera befestigten Stereomikroskop.

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Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Kritische Schritte im Rahmen des Protokolls Photobleaching: Vermeidung unzumutbarer Photobleichens fluoreszierenden Proben ist unbedingt erforderlich, um eine effiziente Durchführung der konfokalen Mikroskopie. Daher wird die Zeitproben durch das Okular zu lokalisieren oder Bildaufnahmeparameter über den Live-Abtastmodus eingestellt sollte Photobleichens minimiert werden minimiert. Gewebeschäden: Da Mitochondrien betrachtet sind die Sensor...

Die Mitochondrien sind klassisch als zelluläre Kraftwerk beschrieben, da sie die Haupt Sitze der Energieproduktion in differenzierten Zellen sind. Darüber hinaus spielen Mitochondrien eine wichtige Rolle im Stoffwechsel, Wärmeerzeugung, Lipid - Modifikation, Calcium und Redoxhomöostase, die Orchestrierung von Zellsignalprozesse, etc 1. Mitochondria auch eine aktive Rolle bei der Induktion von Zelltod 2, sowie in der Zellzyklusregulation 3 spielen. Solche Multifunktionalität ergeben sich folgende grundlegende Fragen: a) Wie Mitochondrien führen alle diese Funktionen gleichzeitig und b) gibt es spezifische mitochondriale Pools oder Subzonen, die für verschiedene Funktionen spezialisiert sind? In diesem Zusammenhang ist es wichtig, dass die multifunktionale Mitochondrien in ihrer Form, Größe und Struktur innerhalb einzelner Zellen und dass die Beharrungsform der Mitochondrien variieren zwischen Zelltypen können dynamisch sind zu beachten. Jahrzehnte der Forschung aus verschiedenen LaborOratorien legen nahe , dass die Änderung der mitochondrialen Form, Größe und Struktur, die kollektiv mitochondrialen Dynamik genannt, entscheidend ist 4,5,6 verschiedenen mitochondrialen Funktionen aufrechtzuerhalten. Diese Ergebnisse heben die Möglichkeit, dass die Mitochondrien ihre Multifunktionalität, die aufgrund ihrer strukturellen Dynamik erreichen kann. Umfangreiche Anstrengungen unternommen werden, die mitochondriale Struktur-Funktions-Beziehung zu verstehen. Die Dynamik der mitochondrialen Struktur wird durch ihre Fähigkeit zu unterziehen Spaltung und Fusion Ereignisse miteinander in erster Linie beibehalten. Fission von großen Mitochondrien wandelt sie in kleinere mitochondrialen Elemente, während Fusion zwischen zwei kleineren Mitochondrien führt diese in ein größeres mitochondrialen Element 7. Außerdem kann transient Fusion von zwei Mitochondrien auftreten, um die Vermischung von deren Inhalt zu ermöglichen. Die Spaltung und Fusion Ereignisse der inneren und der äußeren mitochondrialen Membranen werden sorgfältig durch spec geregeltific setzt von Proteinen. Die Kernspaltung Maschinen ist dynamin-verwandtes Protein 1 (DRP1) aus, der aus dem Cytosol in die Mitochondrien durch seine Wechselwirkung mit bestimmten bona fide mitochondriale Proteine (zB Fis1 oder MFF1) eingestellt wird, während DRP1 Funktion auch reguliert werden kann durch andere Proteine auf der mitochondrialen Oberfläche 4. Obwohl DRP1 auf der äußeren Membran arbeitet, beeinflussen seine Spaltung Fähigkeiten, um die innere Membran als auch. Die Orchestrierung der Spaltung von äußeren und inneren Mitochondrienmembranen ist nicht gut verstanden. Auf der anderen Seite, die Fusion der inneren Membran wird im Kern durch die Aktivitäten der opA1 geregelt, während mitofusins die Fusion der äußeren Membran 5 regieren. Der Rest der entgegen Spaltung und Fusion Ereignisse der Mitochondrien diktieren die Steady-State-mitochondriale Form in einer Zelle. Zum Beispiel würde Unterdrückung der mitochondrialen Spaltung in vollständig und ohne Widerstand Fusion, während die Überaktivität der Mitochondrienl Spaltung würde zu einer Fragmentierung der Mitochondrien 3 führen. Die Untersuchung der mitochondrialen Struktur-Funktions-Beziehung geht es vor allem zwei komplementäre Ansätze: a) Analyse der zellulären und organismischen Phänotypen nach genetischen Manipulation von mitochondrialen Spaltung / Fusionsproteine ​​und b) die direkte Beurteilung der mitochondrialen Struktur und Funktion. Es ist bemerkenswert, dass genetische Analysen nicht immer die direkte Funktionalität des Moleküls an der Hand (in diesem Fall die mitochondriale Spaltung / Fusionsproteine) kann sich herausstellen, wie die Phänotypen aufgrund Nebenwirkungen auftreten können. Daher ist es von größter Bedeutung, Werkzeuge zu entwickeln und zu verwenden, um direkt mitochondriale Struktur und Funktion zu untersuchen. Bei der Beurteilung der mitochondrialen Struktur beinhaltet verschiedene Mikroskopie-Tools. Die Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie lebender Zellen fortgeschritten ist stark, die Studien der mitochondrialen Dynamik, da die mitochondriale Dynamik überwacht werden können, sowohl qualitativ als auch quantitathungsweise die entsprechenden Fluoreszenzmikroskopie Werkzeuge und Techniken unter Verwendung von 8. Die Fluoreszenzmikroskopie-basierte Werkzeuge wurden mitochondriale Struktur und Funktion in lebenden und fixierten Drosophila melanogaster Gewebe zu studieren entwickelt, die Aufklärung der Bedeutung der mitochondrialen Dynamik in vivo 9. Diese und verwandte Verfahren werden hier beschrieben, mit dem Ziel , mitochondriale Struktur studieren und Funktion in der Drosophila Ovars. Das Drosophila Ovar besteht aus Keimbahn und somatischen Abstammungslinien, die von ihren jeweiligen adulten Stammzellen entstehen , die 10,11 in der Germarium befinden. Sechzehn - Syncytial - Keimzellen (GCs) durch somatische Follikelzellen eingekapselt erhalten (FCs) einzelne Ei Kammern zu bilden , die aus dem Germarium (Abbildung 1) entstehen. Eines der 16 GCs eine Eizelle zu werden erhalten begangen, und die restlichen 15 GCs in Nährzellen entwickeln, die das Wachstum der Eizelle Kammer unterstützen, Die Reifung der Eizelle zu erleichtern, bevor sie verlegt wird. Die Mehrzahl der FCs laufen 9 Runden von Mitosen, bevor sie den mitotischen Zellzyklus verlassen terminal mit in einer strukturierten Epithelzellschicht unterscheiden, bestehend aus vorderen Follikelzellen (AFCs) posterior Follikelzellen (PFCs) und Hauptkörperzellen (MBCs) . Die aufeinander folgenden Ei Kammern sind durch Stengel Zellen verbunden, die Zellen unterschieden, die auch von den FCs früh in der Entwicklung ableiten. Mitochondriale Form durch die DRP1 mitochondrialen Spalt Protein reguliert wird im Prozess der Differenzierung während der normalen Entwicklung des Drosophila ovarian FC Schicht 9,12 beteiligt. Die Verfahren , die in diesen Studien verwendet , um die Beteiligung von DRP1 in Drosophila Follikel Zellschicht Entwicklung zu identifizieren , werden hier beschrieben.

<table><tbody><tr><td>Grace's Media (Insekten-Präpariermedium)</td><td>Fisher Scientific</td><td>30611031-2</td><td></td></tr><tr><td>41 Paraformaldehyd AQ</td><td>Electronic Microscopy Sciences</td><td>50-259-99</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker Green (insgesamt mitochondriale Färbung)</td><td>Life Technologies</td><td>m7514</td><td>Rekonstitution und Aliquot</td></tr><tr><td>Tetramethylrhodamin-Ethylester Perchlorat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>87917-25MG</td><td>Rekonstituierung und Aliquotierung</td></tr><tr><td>von MitoSox (Mito-Ros-Färbung)</td><td>Life Technologies</td><td>m36008</td><td>Rekonstituierung und Aliquotierung</td></tr><tr><td>von PolyLysine</td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN15017625</td><td></td></tr><tr><td>Fliegenfläschchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS-515</td><td></td></tr><tr><td>Fliegenkonische Fisher</td><td>Scientific</td><td>AS-355</td><td></td></tr><tr><td>Fliegenfläschchen Flugs Fisher</td><td>Scientific</td><td>AS273</td><td></td></tr><tr><td>Fly Conical</td><td>Flugs Fisher Scientific</td><td>AS 277</td><td></td></tr><tr><td>Jazzmix Drosophila food (Drosophila food)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS153</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserum Albumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9647-50G</td><td></td></tr><tr><td>Cyclin E Antikörper (d-300)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc- 33748</td><td></td></tr><tr><td>ATPB Antikörper [3D5] - Mitochondrial Marker</td><td>AbCam</td><td>ab14730</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Ziege Anti-Maus IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-165-146</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-175-144</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield</td><td>Fisher Scientific</td><td>H100</td><td></td></tr><tr><td>Azer Scientific EverMark Select Objektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-026-252</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop-Deckglas</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Mat Tek Corp&nbsp; Mircrowell-Schale mit Glasboden</td><td>Fisher Scientific</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Aktive Trockenhefe</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN10140001</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM 700</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzette</td><td>Fine Science Technologies</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Moria Vernickelter Stifthalter</td><td>Fine Science Technologies</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Minutien Pins</td><td>Fine Science Technologies</td><td>26002-15</td><td></td></tr><tr><td>MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 )</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>7194</td><td></td></tr><tr><td>Fly</td><td>Pad Fly stuff</td><td>59-118</td><td></td></tr><tr><td>Blowgun</td><td>Fly stuff</td><td>54-104</td><td></td></tr><tr><td>Blowgun needle</td><td>Flystuff</td><td>54-119</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting Microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Analysesoftware</td><td>Carl Zeiss</td><td>Zen&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Analysesoftware</td><td>Open Source</td><td>Image J</td><td></td></tr><tr><td>Research Makro-Zoom-Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>MVX10</td><td></td></tr><tr><td>QICAM Fast 1394 Gekühlte Digitalkamera, 12-Bit, Mono&nbsp;</td><td>QImaging</td><td>QIC-F-M-12-C</td><td></td></tr><tr><td>QCapture Pro 5.1</td><td>QImaging</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

studieren mitochondrial struktur und funktion in drosophila ovarien

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Eine Analyse der mitochondrialen Struktur-Funktions-Beziehung ist für ein gründliches Verständnis der regulatorischen Mechanismen der mitochondrialen Funktionalität erforderlich. Die Fluoreszenzmikroskopie ist ein unverzichtbares Werkzeug für die direkte Beurteilung der mitochondrialen Struktur und Funktion in lebenden Zellen und für die Untersuchung der mitochondrialen Struktur-Funktions-Beziehung, die hauptsächlich durch die Moleküle moduliert wird, die die Spaltungs- und Fusionsereignisse zwischen den Mitochondrien steuern. In dieser Arbeit werden spezifische Methoden zur Untersuchung der mitochondrialen Struktur und Funktion im lebenden sowie im fixierten Gewebe im Modellorganismus Drosophila melanogaster beschrieben und demonstriert. Das Gewebe der Wahl ist hier der Drosophila-Eierstock, der isoliert und für die ex vivo konfokale Lebendmikroskopie zugänglich gemacht werden kann. Darüber hinaus beschreibt die Arbeit, wie das mitochondriale Spaltprotein Drp1 in Drosophila-Eierstöcken genetisch manipuliert werden kann, um die Beteiligung der Drp1-gesteuerten mitochondrialen Spaltung an der Modulation der mitochondrialen Struktur-Funktions-Beziehung zu untersuchen. Die breite Anwendung solcher Methoden wird sowohl in bereits veröffentlichten als auch in neuen Daten demonstriert. Die beschriebenen Methoden können weiter ausgebaut werden, um den direkten Einfluss von Nährstoffen und/oder Wachstumsfaktoren auf die mitochondrialen Eigenschaften ex vivo zu verstehen. Angesichts der Tatsache, dass eine mitochondriale Dysregulation der Ätiologie verschiedener Krankheiten zugrunde liegt, wird erwartet, dass die beschriebenen innovativen Methoden, die in einem genetisch manipulierbaren Modellorganismus, Drosophila, entwickelt wurden, wesentlich zum Verständnis der mechanistischen Details der mitochondrialen Struktur-Funktions-Beziehung und zur Entwicklung mitochondriengesteuerter Therapiestrategien beitragen werden.

Die beschriebenen Verfahren können mitochondriale Struktur und Funktion zu untersuchen in lebenden und fixierten Drosophila Ovarien (2B) verwendet werden. einige Beispiele für die erwarteten Ergebnisse, die mit den beschriebenen Verfahren werden zur Verfügung gestellt. Dissektion der Drosophila Ovar: Wenn weiter seziert, sollten die abgetrennten Bäuche (3B) aus dem ges...

Eine Analyse der mitochondrialen Struktur-Funktions-Beziehung ist für ein gründliches Verständnis der regulatorischen Mechanismen der mitochondrialen Funktionalität erforderlich. Spezifische Methoden zur Untersuchung der mitochondrialen Struktur und Funktion in lebenden und fixierten Drosophila-Eierstöcken werden in dieser Arbeit beschrieben und demonstriert.

Studieren Mitochondrial Struktur und Funktion in Drosophila Ovarien

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Methoden zur Untersuchung der mitochondrialen Struktur und Funktion im lebenden sowie im fixierten Gewebe im Modellorganismus Drosophila melanogaster zu demonstrieren. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Mitochondrienbiologie zu beantworten. Wie zum Beispiel die Regulationsmechanismen der mitochondrialen Funktion.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine detaillierte Analyse der Beziehung zwischen mitochondrialer Struktur und Funktion durchführt. Nachdem Sie fünf betäubte weibliche Fliegen gemäß dem Textprotokoll aussortiert haben, verwenden Sie unter dem Präpariermikroskop zwei Pinzettenpaare, um den Brustkorb vom Bauch zu trennen. Übertragen Sie dann die Bäuche vorsichtig in die zweite Vertiefung der Schüssel.Halten Sie mit einer Pinzette den Bauch am hinteren Ende fest, und drücken Sie mit der anderen Pinzette langsam die Eierstöcke heraus. Halten Sie dann mit der Pinzette einen einzelnen Eierstock am undurchsichtigen hinteren Ende fest und bewegen Sie ihn vorsichtig in die dritte Vertiefung der Schale, um ihn zu necken oder zu fixieren. Toupieren Sie die Schutzhülle vorsichtig um die E

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Forschung

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Mikroinjektion Techniken zur Untersuchung Mitose in der Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

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