Studieren Mitochondrial Struktur und Funktion in Drosophila Ovarien

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Methoden zur Untersuchung der mitochondrialen Struktur und Funktion im lebenden sowie im fixierten Gewebe im Modellorganismus Drosophila melanogaster zu demonstrieren. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Mitochondrienbiologie zu beantworten. Wie zum Beispiel die Regulationsmechanismen der mitochondrialen Funktion.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine detaillierte Analyse der Beziehung zwischen mitochondrialer Struktur und Funktion durchführt. Nachdem Sie fünf betäubte weibliche Fliegen gemäß dem Textprotokoll aussortiert haben, verwenden Sie unter dem Präpariermikroskop zwei Pinzettenpaare, um den Brustkorb vom Bauch zu trennen. Übertragen Sie dann die Bäuche vorsichtig in die zweite Vertiefung der Schüssel.

Halten Sie mit einer Pinzette den Bauch am hinteren Ende fest, und drücken Sie mit der anderen Pinzette langsam die Eierstöcke heraus. Halten Sie dann mit der Pinzette einen einzelnen Eierstock am undurchsichtigen hinteren Ende fest und bewegen Sie ihn vorsichtig in die dritte Vertiefung der Schale, um ihn zu necken oder zu fixieren. Toupieren Sie die Schutzhülle vorsichtig um die Eierstöcke herum, indem Sie mit einer Pinzette das hintere Ende halten und mit einer Nadel leicht vom hinteren zum vorderen Ende führen.

Zur Herstellung von Polylysen-beschichteten Kammern geben Sie zwei getrennte 20-Mikroliter-Tropfen Polylysen auf das Deckglas einer Petrischale mit Glasboden. Trocknen Sie die Platten eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius an der Luft und konturieren Sie das Polylysin auf der Unterseite der Platte. Stellen Sie die Scanparameter am konfokalen Mikroskop ein, indem Sie die Bildaufnahmesoftware öffnen, und stellen Sie auf der Registerkarte "Erfassung" die entsprechenden Scanparameter ein.

Aktivieren Sie die Kontrollkästchen Zeitreihe, Bleiche und Regionen, um die einzelnen Registerkarten zu öffnen. Geben Sie dann die entsprechenden Werte für die Erfassungsparameter in jede Registerkarte ein. Legen Sie als Nächstes einen präparierten und toupierten Eierstock auf eine markierte Polylysin-beschichtete Region und verwenden Sie eine Nadel, um den Eierstock zu spreizen und die Eierstöcke zu trennen.

Geben Sie einen 10-Mikroliter-Tropfen Insektenpräpariermittel auf den Eierstock und achten Sie darauf, dass der gesamte mit Polylysin beschichtete Bereich bedeckt ist. Decken Sie dann die Petrischale ab. Unmittelbar nach dem Einsetzen des Eierstocks legen Sie die Probe auf den Mikroskoptisch und verwenden Sie das Okular, um das interessierende Feld im lebenden Gewebe schnell zu lokalisieren.

Klicken Sie auf Live, um ein Live-Bild des ausgewählten Interessenfelds aufzunehmen, und klicken Sie dann auf Stopp, um den Live-Scan zu stoppen. Passen Sie bei Bedarf die Erfassungsparameter so an, dass das detektierte Fluoreszenzsignal unter den Sättigungswerten mit dem definierten Hintergrund liegt, der durch Anpassen der Offset-Werte eingestellt wurde. Verwenden Sie auf der Registerkarte "Grafik" das Bézier-Zeichenwerkzeug, um einen kleinen ROI zu zeichnen, um die Fotobleichzone auf dem durch Scannen aufgenommenen Bild abzugrenzen.

Führen Sie dann die Bildaufnahme durch, indem Sie auf Experiment starten klicken. Um die Lebendfärbung mit fluoreszierenden mitochondrialen Farbstoffen durchzuführen, verdünnen Sie den Fleckenbestand in warmem Präpariermedium auf die endgültige Arbeitskonzentration. Nachdem das Präparieren und Necken bereits demonstriert wurde, legen Sie die Eierstöcke in 200 Mikroliter Färbelösung in eine Vertiefung einer Sezierschale.

Decken Sie die Schale mit einer in Alufolie eingewickelten Schachtel ab, um sie vor Licht zu schützen, und inkubieren Sie das Taschentuch 10 Minuten lang. Waschen Sie anschließend die befleckten Eierstöcke, indem Sie sie mit einer Pinzette vorsichtig in drei aufeinanderfolgende Vertiefungen mit Medium ohne Flecken schieben. Bei der Co-Färbung mit TMRE führen Sie bei der kompatiblen mitrochondrialen Gesamtfärbung zuerst die Färbung mit TMRE durch, dann ohne Waschen des Gewebes und übertragen Sie die Probe sofort in die mitochondriale Gesamtfärbung.

Nachdem Sie die Eierstöcke gewaschen und montiert haben, wie weiter oben in diesem Video gezeigt, aktivieren Sie das Z-Schnitt-Kästchen, um die Lasche zu öffnen, um eine konfokale Bildgebung an der Probe durchzuführen. Drehen Sie das Fokusrad in Richtung des unteren Randes der Probe, während sie live gescannt wird, und klicken Sie auf Zuerst einstellen, um den untersten Z-Schnitt zu definieren. Bewegen Sie dann das Fokusrad in die entgegengesetzte Richtung, um den obersten Abschnitt zu definieren.

Führen Sie die Bildaufnahme durch, indem Sie auf Experiment starten klicken. Im Falle der Lebend-Xvivamikroskopie sollten die Daten innerhalb von 15 Minuten nach der Gewebemontage erhoben werden, da sonst die Versuchsergebnisse durch Veränderungen der Physiologie aufgrund des anschließenden Absterbens des Gewebes beeinflusst werden können. Unmittelbar nach der Sektion unter einem Abzug die Eierstöcke in 200 Mikroliter frisches PFA bei Raumtemperatur in die Vertiefung einer gläsernen Sezierschale legen.

Inkubieren Sie das Gewebe 15 Minuten lang, um es zu fixieren. Nachdem Sie die Eierstöcke in PBS gemäß dem Textprotokoll gewaschen haben, während Sie noch in PBS sind, toupieren Sie die Eierstöcke, um die schützende Faserhülle vorsichtig zu entfernen, die den Antigenzugang vom Antikörper behindern kann. Permeabilisieren Sie die toupierten Eierstöcke, indem Sie sie in ein Mikrofuse-Röhrchen mit 500 Mikrolitern 0,5 Prozent Tritan x 100 PBS legen.

Legen Sie dann das Rohr in eine abgedeckte Box und lassen Sie es 30 Minuten lang bei 25 U/min schaukeln. Entfernen Sie das PBS/TX gemäß dem Textprotokoll, blockieren Sie das Gewebe, indem Sie 200 Mikroliter BSA hinzufügen, gelöst in 0,5 Prozent PBS/TX. Inkubieren Sie die Proben auf der Wippe eine Stunde lang bei Raumtemperatur.

Nach Entfernen der Blockierungslösung fügen Sie anti-tollwütige Desyclin E und anti-Maus-ATPB-Antikörper hinzu. Inkubieren Sie das Gewebe auf der Wippe zwei Stunden lang bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation verwenden Sie PBS-TX, um die Eierstöcke dreimal für jeweils 15 Minuten zu waschen.

Anschließend werden 200 Mikroliter der entsprechenden Sekundärantikörper und frisches PBS-TX zugegeben und eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nachdem Sie das Taschentuch zweimal gewaschen haben, fügen Sie bei der dritten Wäsche Haken hinzu. Entfernen Sie dann mit einer Mikropipette von einem Milliliter die immungefärbten Eierstöcke aus dem Mikrofuse-Röhrchen in eine frische Vertiefung einer Glasdisparierschale, die 200 Mikroliter PBS enthält.

Geben Sie einen Tropfen Eindeckmedium auf Glycerinbasis auf einen Objektträger und geben Sie die immungefärbten Eierstöcke nacheinander in das Eindeckmedium. Während Sie den undurchsichtigen Teil des Eierstocks mit einer Pinzette festhalten, ziehen Sie unter einem Präpariermikroskop mit einer Nadel vorsichtig die transparenten Eierstöcke aus den undurchsichtigen reifen Eikammern. Entfernen Sie dann die reifen Eikammern vom Einbettmedium.

Legen Sie ein Deckglas auf den Objektträger und drücken Sie leicht, um sicherzustellen, dass sich das Eindeckmedium gleichmäßig verteilt. Trocknen Sie die Proben 15 Minuten lang an der Luft, bevor Sie die Ränder mit Nagellack versiegeln. Führen Sie abschließend bei Bedarf eine konfokale Mikroskopie durch.

Wie hier gezeigt, führt ein Flip, der auf eine der mitochondrialen Wolken gerichtet ist, die mit den Nerse-Zellen assoziiert sind, innerhalb von 200 Sekunden zu einem Verlust von mehr als 50 Prozent des Fluoreszenzsignals von den blauen und weißen ROIs, die den roten Flip-ROI umgeben, während die gelben Kontroll-ROIs minimal gebleicht werden. Die Drosophilla-Eierstöcke zeigten eine Abnahme des Signals mit der Gewebetiefe, und es ist wichtig, die maximale Gewebetiefe zu bestimmen, in der die Phlorophore wie TMRE und Mitostain während der Live-Bildgebung nachgewiesen werden können. Eine qualitative Analyse aus der Co-Färbung mit TMRE und der gesamten mitochondrialen Färbung zeigt, dass die Drisophilla germarium im Stadium 2B ein höheres mitochondriales Potential pro Masseneinheit aufweist.

In dieser Abbildung zeigt die semiqualitative Analyse den Unterschied im mitochondrialen Potential pro Masseneinheit zwischen AFCs und MBCs, wie sie aus einer Eikammer des Stadiums 9 analysiert wurden. Diese Bilder zeigen, dass die Mitosoxaufnahme in den mitotischen und postmitotischen Drisophilla-Follikelzellen stattfindet. In diesem Experiment identifizierte die Co-Immun-Färbung ein erhöhtes Decyclin-Signal, das sich mit dem mitochondrialen ATPB-Signal überlappt, und die GFP-negativen DRP1-Klone im Germarium und in einer Eikammer im Stadium 9.

Die beschriebenen Methoden können modifiziert und eingesetzt werden, um die Funktion der mitochondrialen Struktur in anderen Drisophilla-Geweben zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man fixierte und lebende Drisophilla-Eierstöcke präpariert, färbt und abbildet, um die Struktur und Funktion der Mitochonrien zu untersuchen.