Name: Studieren Mitochondrial Struktur und Funktion in Drosophila Ovarien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Lernen Sie Methoden zur Analyse mitochondrialer Struktur und Funktion in lebendem und fixiertem Drosophila melanogaster-Gewebe. Diese Techniken ermöglichen detaillierte Einblicke in die Regulationsmechanismen der Mitochondrienfunktionalität.

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Wir danken Leena Patel und Diamond Woodard für ihre Hilfe bei der Vorbereitung des Drosophila-Mediums und Dr. Igor Chesnokov für den Zugang zum an der Kamera befestigten Stereomikroskop.

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Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Kritische Schritte im Rahmen des Protokolls Photobleaching: Vermeidung unzumutbarer Photobleichens fluoreszierenden Proben ist unbedingt erforderlich, um eine effiziente Durchführung der konfokalen Mikroskopie. Daher wird die Zeitproben durch das Okular zu lokalisieren oder Bildaufnahmeparameter über den Live-Abtastmodus eingestellt sollte Photobleichens minimiert werden minimiert. Gewebeschäden: Da Mitochondrien betrachtet sind die Sensor...

Die Mitochondrien sind klassisch als zelluläre Kraftwerk beschrieben, da sie die Haupt Sitze der Energieproduktion in differenzierten Zellen sind. Darüber hinaus spielen Mitochondrien eine wichtige Rolle im Stoffwechsel, Wärmeerzeugung, Lipid - Modifikation, Calcium und Redoxhomöostase, die Orchestrierung von Zellsignalprozesse, etc 1. Mitochondria auch eine aktive Rolle bei der Induktion von Zelltod 2, sowie in der Zellzyklusregulation 3 spielen. Solche Multifunktionalität ergeben sich folgende grundlegende Fragen: a) Wie Mitochondrien führen alle diese Funktionen gleichzeitig und b) gibt es spezifische mitochondriale Pools oder Subzonen, die für verschiedene Funktionen spezialisiert sind? In diesem Zusammenhang ist es wichtig, dass die multifunktionale Mitochondrien in ihrer Form, Größe und Struktur innerhalb einzelner Zellen und dass die Beharrungsform der Mitochondrien variieren zwischen Zelltypen können dynamisch sind zu beachten. Jahrzehnte der Forschung aus verschiedenen LaborOratorien legen nahe , dass die Änderung der mitochondrialen Form, Größe und Struktur, die kollektiv mitochondrialen Dynamik genannt, entscheidend ist 4,5,6 verschiedenen mitochondrialen Funktionen aufrechtzuerhalten. Diese Ergebnisse heben die Möglichkeit, dass die Mitochondrien ihre Multifunktionalität, die aufgrund ihrer strukturellen Dynamik erreichen kann. Umfangreiche Anstrengungen unternommen werden, die mitochondriale Struktur-Funktions-Beziehung zu verstehen. Die Dynamik der mitochondrialen Struktur wird durch ihre Fähigkeit zu unterziehen Spaltung und Fusion Ereignisse miteinander in erster Linie beibehalten. Fission von großen Mitochondrien wandelt sie in kleinere mitochondrialen Elemente, während Fusion zwischen zwei kleineren Mitochondrien führt diese in ein größeres mitochondrialen Element 7. Außerdem kann transient Fusion von zwei Mitochondrien auftreten, um die Vermischung von deren Inhalt zu ermöglichen. Die Spaltung und Fusion Ereignisse der inneren und der äußeren mitochondrialen Membranen werden sorgfältig durch spec geregeltific setzt von Proteinen. Die Kernspaltung Maschinen ist dynamin-verwandtes Protein 1 (DRP1) aus, der aus dem Cytosol in die Mitochondrien durch seine Wechselwirkung mit bestimmten bona fide mitochondriale Proteine (zB Fis1 oder MFF1) eingestellt wird, während DRP1 Funktion auch reguliert werden kann durch andere Proteine auf der mitochondrialen Oberfläche 4. Obwohl DRP1 auf der äußeren Membran arbeitet, beeinflussen seine Spaltung Fähigkeiten, um die innere Membran als auch. Die Orchestrierung der Spaltung von äußeren und inneren Mitochondrienmembranen ist nicht gut verstanden. Auf der anderen Seite, die Fusion der inneren Membran wird im Kern durch die Aktivitäten der opA1 geregelt, während mitofusins die Fusion der äußeren Membran 5 regieren. Der Rest der entgegen Spaltung und Fusion Ereignisse der Mitochondrien diktieren die Steady-State-mitochondriale Form in einer Zelle. Zum Beispiel würde Unterdrückung der mitochondrialen Spaltung in vollständig und ohne Widerstand Fusion, während die Überaktivität der Mitochondrienl Spaltung würde zu einer Fragmentierung der Mitochondrien 3 führen. Die Untersuchung der mitochondrialen Struktur-Funktions-Beziehung geht es vor allem zwei komplementäre Ansätze: a) Analyse der zellulären und organismischen Phänotypen nach genetischen Manipulation von mitochondrialen Spaltung / Fusionsproteine ​​und b) die direkte Beurteilung der mitochondrialen Struktur und Funktion. Es ist bemerkenswert, dass genetische Analysen nicht immer die direkte Funktionalität des Moleküls an der Hand (in diesem Fall die mitochondriale Spaltung / Fusionsproteine) kann sich herausstellen, wie die Phänotypen aufgrund Nebenwirkungen auftreten können. Daher ist es von größter Bedeutung, Werkzeuge zu entwickeln und zu verwenden, um direkt mitochondriale Struktur und Funktion zu untersuchen. Bei der Beurteilung der mitochondrialen Struktur beinhaltet verschiedene Mikroskopie-Tools. Die Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie lebender Zellen fortgeschritten ist stark, die Studien der mitochondrialen Dynamik, da die mitochondriale Dynamik überwacht werden können, sowohl qualitativ als auch quantitathungsweise die entsprechenden Fluoreszenzmikroskopie Werkzeuge und Techniken unter Verwendung von 8. Die Fluoreszenzmikroskopie-basierte Werkzeuge wurden mitochondriale Struktur und Funktion in lebenden und fixierten Drosophila melanogaster Gewebe zu studieren entwickelt, die Aufklärung der Bedeutung der mitochondrialen Dynamik in vivo 9. Diese und verwandte Verfahren werden hier beschrieben, mit dem Ziel , mitochondriale Struktur studieren und Funktion in der Drosophila Ovars. Das Drosophila Ovar besteht aus Keimbahn und somatischen Abstammungslinien, die von ihren jeweiligen adulten Stammzellen entstehen , die 10,11 in der Germarium befinden. Sechzehn - Syncytial - Keimzellen (GCs) durch somatische Follikelzellen eingekapselt erhalten (FCs) einzelne Ei Kammern zu bilden , die aus dem Germarium (Abbildung 1) entstehen. Eines der 16 GCs eine Eizelle zu werden erhalten begangen, und die restlichen 15 GCs in Nährzellen entwickeln, die das Wachstum der Eizelle Kammer unterstützen, Die Reifung der Eizelle zu erleichtern, bevor sie verlegt wird. Die Mehrzahl der FCs laufen 9 Runden von Mitosen, bevor sie den mitotischen Zellzyklus verlassen terminal mit in einer strukturierten Epithelzellschicht unterscheiden, bestehend aus vorderen Follikelzellen (AFCs) posterior Follikelzellen (PFCs) und Hauptkörperzellen (MBCs) . Die aufeinander folgenden Ei Kammern sind durch Stengel Zellen verbunden, die Zellen unterschieden, die auch von den FCs früh in der Entwicklung ableiten. Mitochondriale Form durch die DRP1 mitochondrialen Spalt Protein reguliert wird im Prozess der Differenzierung während der normalen Entwicklung des Drosophila ovarian FC Schicht 9,12 beteiligt. Die Verfahren , die in diesen Studien verwendet , um die Beteiligung von DRP1 in Drosophila Follikel Zellschicht Entwicklung zu identifizieren , werden hier beschrieben.

<table><tbody><tr><td>Grace's Media (Insekten-Präpariermedium)</td><td>Fisher Scientific</td><td>30611031-2</td><td></td></tr><tr><td>41 Paraformaldehyd AQ</td><td>Electronic Microscopy Sciences</td><td>50-259-99</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker Green (insgesamt mitochondriale Färbung)</td><td>Life Technologies</td><td>m7514</td><td>Rekonstitution und Aliquot</td></tr><tr><td>Tetramethylrhodamin-Ethylester Perchlorat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>87917-25MG</td><td>Rekonstituierung und Aliquotierung</td></tr><tr><td>von MitoSox (Mito-Ros-Färbung)</td><td>Life Technologies</td><td>m36008</td><td>Rekonstituierung und Aliquotierung</td></tr><tr><td>von PolyLysine</td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN15017625</td><td></td></tr><tr><td>Fliegenfläschchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS-515</td><td></td></tr><tr><td>Fliegenkonische Fisher</td><td>Scientific</td><td>AS-355</td><td></td></tr><tr><td>Fliegenfläschchen Flugs Fisher</td><td>Scientific</td><td>AS273</td><td></td></tr><tr><td>Fly Conical</td><td>Flugs Fisher Scientific</td><td>AS 277</td><td></td></tr><tr><td>Jazzmix Drosophila food (Drosophila food)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS153</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserum Albumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9647-50G</td><td></td></tr><tr><td>Cyclin E Antikörper (d-300)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc- 33748</td><td></td></tr><tr><td>ATPB Antikörper [3D5] - Mitochondrial Marker</td><td>AbCam</td><td>ab14730</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Ziege Anti-Maus IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-165-146</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-175-144</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield</td><td>Fisher Scientific</td><td>H100</td><td></td></tr><tr><td>Azer Scientific EverMark Select Objektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-026-252</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop-Deckglas</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Mat Tek Corp&nbsp; Mircrowell-Schale mit Glasboden</td><td>Fisher Scientific</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Aktive Trockenhefe</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN10140001</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM 700</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzette</td><td>Fine Science Technologies</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Moria Vernickelter Stifthalter</td><td>Fine Science Technologies</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Minutien Pins</td><td>Fine Science Technologies</td><td>26002-15</td><td></td></tr><tr><td>MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 )</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>7194</td><td></td></tr><tr><td>Fly</td><td>Pad Fly stuff</td><td>59-118</td><td></td></tr><tr><td>Blowgun</td><td>Fly stuff</td><td>54-104</td><td></td></tr><tr><td>Blowgun needle</td><td>Flystuff</td><td>54-119</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting Microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Analysesoftware</td><td>Carl Zeiss</td><td>Zen&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Analysesoftware</td><td>Open Source</td><td>Image J</td><td></td></tr><tr><td>Research Makro-Zoom-Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>MVX10</td><td></td></tr><tr><td>QICAM Fast 1394 Gekühlte Digitalkamera, 12-Bit, Mono&nbsp;</td><td>QImaging</td><td>QIC-F-M-12-C</td><td></td></tr><tr><td>QCapture Pro 5.1</td><td>QImaging</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

studieren mitochondrial struktur und funktion in drosophila ovarien

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Eine Analyse der mitochondrialen Struktur-Funktions-Beziehung ist für ein gründliches Verständnis der regulatorischen Mechanismen der mitochondrialen Funktionalität erforderlich. Die Fluoreszenzmikroskopie ist ein unverzichtbares Werkzeug für die direkte Beurteilung der mitochondrialen Struktur und Funktion in lebenden Zellen und für die Untersuchung der mitochondrialen Struktur-Funktions-Beziehung, die hauptsächlich durch die Moleküle moduliert wird, die die Spaltungs- und Fusionsereignisse zwischen den Mitochondrien steuern. In dieser Arbeit werden spezifische Methoden zur Untersuchung der mitochondrialen Struktur und Funktion im lebenden sowie im fixierten Gewebe im Modellorganismus Drosophila melanogaster beschrieben und demonstriert. Das Gewebe der Wahl ist hier der Drosophila-Eierstock, der isoliert und für die ex vivo konfokale Lebendmikroskopie zugänglich gemacht werden kann. Darüber hinaus beschreibt die Arbeit, wie das mitochondriale Spaltprotein Drp1 in Drosophila-Eierstöcken genetisch manipuliert werden kann, um die Beteiligung der Drp1-gesteuerten mitochondrialen Spaltung an der Modulation der mitochondrialen Struktur-Funktions-Beziehung zu untersuchen. Die breite Anwendung solcher Methoden wird sowohl in bereits veröffentlichten als auch in neuen Daten demonstriert. Die beschriebenen Methoden können weiter ausgebaut werden, um den direkten Einfluss von Nährstoffen und/oder Wachstumsfaktoren auf die mitochondrialen Eigenschaften ex vivo zu verstehen. Angesichts der Tatsache, dass eine mitochondriale Dysregulation der Ätiologie verschiedener Krankheiten zugrunde liegt, wird erwartet, dass die beschriebenen innovativen Methoden, die in einem genetisch manipulierbaren Modellorganismus, Drosophila, entwickelt wurden, wesentlich zum Verständnis der mechanistischen Details der mitochondrialen Struktur-Funktions-Beziehung und zur Entwicklung mitochondriengesteuerter Therapiestrategien beitragen werden.

Die beschriebenen Verfahren können mitochondriale Struktur und Funktion zu untersuchen in lebenden und fixierten Drosophila Ovarien (2B) verwendet werden. einige Beispiele für die erwarteten Ergebnisse, die mit den beschriebenen Verfahren werden zur Verfügung gestellt. Dissektion der Drosophila Ovar: Wenn weiter seziert, sollten die abgetrennten Bäuche (3B) aus dem ges...

Eine Analyse der mitochondrialen Struktur-Funktions-Beziehung ist für ein gründliches Verständnis der regulatorischen Mechanismen der mitochondrialen Funktionalität erforderlich. Spezifische Methoden zur Untersuchung der mitochondrialen Struktur und Funktion in lebenden und fixierten Drosophila-Eierstöcken werden in dieser Arbeit beschrieben und demonstriert.

Studieren Mitochondrial Struktur und Funktion in Drosophila Ovarien

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Methoden zur Untersuchung der mitochondrialen Struktur und Funktion im lebenden sowie im fixierten Gewebe im Modellorganismus Drosophila melanogaster zu demonstrieren. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Mitochondrienbiologie zu beantworten. Wie zum Beispiel die Regulationsmechanismen der mitochondrialen Funktion.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine detaillierte Analyse der Beziehung zwischen mitochondrialer Struktur und Funktion durchführt. Nachdem Sie fünf betäubte weibliche Fliegen gemäß dem Textprotokoll aussortiert haben, verwenden Sie unter dem Präpariermikroskop zwei Pinzettenpaare, um den Brustkorb vom Bauch zu trennen. Übertragen Sie dann die Bäuche vorsichtig in die zweite Vertiefung der Schüssel.Halten Sie mit einer Pinzette den Bauch am hinteren Ende fest, und drücken Sie mit der anderen Pinzette langsam die Eierstöcke heraus. Halten Sie dann mit der Pinzette einen einzelnen Eierstock am undurchsichtigen hinteren Ende fest und bewegen Sie ihn vorsichtig in die dritte Vertiefung der Schale, um ihn zu necken oder zu fixieren. Toupieren Sie die Schutzhülle vorsichtig um die Eierstöcke herum, indem Sie mit einer Pinzette das hintere Ende halten und mit einer Nadel leicht vom hinteren zum vorderen Ende führen.Zur Herstellung von Polylysen-beschichteten Kammern geben Sie zwei getrennte 20-Mikroliter-Tropfen Polylysen auf das Deckglas einer Petrischale mit Glasboden. Trocknen Sie die Platten eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius an der Luft und konturieren Sie das Polylysin auf der Unterseite der Platte. Stellen Sie die Scanparameter am konfokalen Mikroskop ein, indem Sie die Bildaufnahmesoftware öffnen, und stellen Sie auf der Registerkarte "Erfassung" die entsprechenden Scanparameter ein.Aktivieren Sie die Kontrollkästchen Zeitreihe, Bleiche und Regionen, um die einzelnen Registerkarten zu öffnen. Geben Sie dann die entsprechenden Werte für die Erfassungsparameter in jede Registerkarte ein. Legen Sie als Nächstes einen präparierten und toupierten Eierstock auf eine markierte Polylysin-beschichtete Region und verwenden Sie eine Nadel, um den Eierstock zu spreizen und die Eierstöcke zu trennen.Geben Sie einen 10-Mikroliter-Tropfen Insektenpräpariermittel auf den Eierstock und achten Sie darauf, dass der gesamte mit Polylysin beschichtete Bereich bedeckt ist. Decken Sie dann die Petrischale ab. Unmittelbar nach dem Einsetzen des Eierstocks legen Sie die Probe auf den Mikroskoptisch und verwenden Sie das Okular, um das interessierende Feld im lebenden Gewebe schnell zu lokalisieren.Klicken Sie auf Live, um ein Live-Bild des ausgewählten Interessenfelds aufzunehmen, und klicken Sie dann auf Stopp, um den Live-Scan zu stoppen. Passen Sie bei Bedarf die Erfassungsparameter so an, dass das detektierte Fluoreszenzsignal unter den Sättigungswerten mit dem definierten Hintergrund liegt, der durch Anpassen der Offset-Werte eingestellt wurde. Verwenden Sie auf der Registerkarte "Grafik" das Bézier-Zeichenwerkzeug, um einen kleinen ROI zu zeichnen, um die Fotobleichzone auf dem durch Scannen aufgenommenen Bild abzugrenzen.Führen Sie dann die Bildaufnahme durch, indem Sie auf Experiment starten klicken. Um die Lebendfärbung mit fluoreszierenden mitochondrialen Farbstoffen durchzuführen, verdünnen Sie den Fleckenbestand in warmem Präpariermedium auf die endgültige Arbeitskonzentration. Nachdem das Präparieren und Necken bereits demonstriert wurde, legen Sie die Eierstöcke in 200 Mikroliter Färbelösung in eine Vertiefung einer Sezierschale.Decken Sie die Schale mit einer in Alufolie eingewickelten Schachtel ab, um sie vor Licht zu schützen, und inkubieren Sie das Taschentuch 10 Minuten lang. Waschen Sie anschließend die befleckten Eierstöcke, indem Sie sie mit einer Pinzette vorsichtig in drei aufeinanderfolgende Vertiefungen mit Medium ohne Flecken schieben. Bei der Co-Färbung mit TMRE führen Sie bei der kompatiblen mitrochondrialen Gesamtfärbung zuerst die Färbung mit TMRE durch, dann ohne Waschen des Gewebes und übertragen Sie die Probe sofort in die mitochondriale Gesamtfärbung.Nachdem Sie die Eierstöcke gewaschen und montiert haben, wie weiter oben in diesem Video gezeigt, aktivieren Sie das Z-Schnitt-Kästchen, um die Lasche zu öffnen, um eine konfokale Bildgebung an der Probe durchzuführen. Drehen Sie das Fokusrad in Richtung des unteren Randes der Probe, während sie live gescannt wird, und klicken Sie auf Zuerst einstellen, um den untersten Z-Schnitt zu definieren. Bewegen Sie dann das Fokusrad in die entgegengesetzte Richtung, um den obersten Abschnitt zu definieren.Führen Sie die Bildaufnahme durch, indem Sie auf Experiment starten klicken. Im Falle der Lebend-Xvivamikroskopie sollten die Daten innerhalb von 15 Minuten nach der Gewebemontage erhoben werden, da sonst die Versuchsergebnisse durch Veränderungen der Physiologie aufgrund des anschließenden Absterbens des Gewebes beeinflusst werden können. Unmittelbar nach der Sektion unter einem Abzug die Eierstöcke in 200 Mikroliter frisches PFA bei Raumtemperatur in die Vertiefung einer gläsernen Sezierschale legen.Inkubieren Sie das Gewebe 15 Minuten lang, um es zu fixieren. Nachdem Sie die Eierstöcke in PBS gemäß dem Textprotokoll gewaschen haben, während Sie noch in PBS sind, toupieren Sie die Eierstöcke, um die schützende Faserhülle vorsichtig zu entfernen, die den Antigenzugang vom Antikörper behindern kann. Permeabilisieren Sie die toupierten Eierstöcke, indem Sie sie in ein Mikrofuse-Röhrchen mit 500 Mikrolitern 0,5 Prozent Tritan x 100 PBS legen.Legen Sie dann das Rohr in eine abgedeckte Box und lassen Sie es 30 Minuten lang bei 25 U/min schaukeln. Entfernen Sie das PBS/TX gemäß dem Textprotokoll, blockieren Sie das Gewebe, indem Sie 200 Mikroliter BSA hinzufügen, gelöst in 0,5 Prozent PBS/TX. Inkubieren Sie die Proben auf der Wippe eine Stunde lang bei Raumtemperatur.Nach Entfernen der Blockierungslösung fügen Sie anti-tollwütige Desyclin E und anti-Maus-ATPB-Antikörper hinzu. Inkubieren Sie das Gewebe auf der Wippe zwei Stunden lang bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation verwenden Sie PBS-TX, um die Eierstöcke dreimal für jeweils 15 Minuten zu waschen.Anschließend werden 200 Mikroliter der entsprechenden Sekundärantikörper und frisches PBS-TX zugegeben und eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nachdem Sie das Taschentuch zweimal gewaschen haben, fügen Sie bei der dritten Wäsche Haken hinzu. Entfernen Sie dann mit einer Mikropipette von einem Milliliter die immungefärbten Eierstöcke aus dem Mikrofuse-Röhrchen in eine frische Vertiefung einer Glasdisparierschale, die 200 Mikroliter PBS enthält.Geben Sie einen Tropfen Eindeckmedium auf Glycerinbasis auf einen Objektträger und geben Sie die immungefärbten Eierstöcke nacheinander in das Eindeckmedium. Während Sie den undurchsichtigen Teil des Eierstocks mit einer Pinzette festhalten, ziehen Sie unter einem Präpariermikroskop mit einer Nadel vorsichtig die transparenten Eierstöcke aus den undurchsichtigen reifen Eikammern. Entfernen Sie dann die reifen Eikammern vom Einbettmedium.Legen Sie ein Deckglas auf den Objektträger und drücken Sie leicht, um sicherzustellen, dass sich das Eindeckmedium gleichmäßig verteilt. Trocknen Sie die Proben 15 Minuten lang an der Luft, bevor Sie die Ränder mit Nagellack versiegeln. Führen Sie abschließend bei Bedarf eine konfokale Mikroskopie durch.Wie hier gezeigt, führt ein Flip, der auf eine der mitochondrialen Wolken gerichtet ist, die mit den Nerse-Zellen assoziiert sind, innerhalb von 200 Sekunden zu einem Verlust von mehr als 50 Prozent des Fluoreszenzsignals von den blauen und weißen ROIs, die den roten Flip-ROI umgeben, während die gelben Kontroll-ROIs minimal gebleicht werden. Die Drosophilla-Eierstöcke zeigten eine Abnahme des Signals mit der Gewebetiefe, und es ist wichtig, die maximale Gewebetiefe zu bestimmen, in der die Phlorophore wie TMRE und Mitostain während der Live-Bildgebung nachgewiesen werden können. Eine qualitative Analyse aus der Co-Färbung mit TMRE und der gesamten mitochondrialen Färbung zeigt, dass die Drisophilla germarium im Stadium 2B ein höheres mitochondriales Potential pro Masseneinheit aufweist.In dieser Abbildung zeigt die semiqualitative Analyse den Unterschied im mitochondrialen Potential pro Masseneinheit zwischen AFCs und MBCs, wie sie aus einer Eikammer des Stadiums 9 analysiert wurden. Diese Bilder zeigen, dass die Mitosoxaufnahme in den mitotischen und postmitotischen Drisophilla-Follikelzellen stattfindet. In diesem Experiment identifizierte die Co-Immun-Färbung ein erhöhtes Decyclin-Signal, das sich mit dem mitochondrialen ATPB-Signal überlappt, und die GFP-negativen DRP1-Klone im Germarium und in einer Eikammer im Stadium 9.Die beschriebenen Methoden können modifiziert und eingesetzt werden, um die Funktion der mitochondrialen Struktur in anderen Drisophilla-Geweben zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man fixierte und lebende Drisophilla-Eierstöcke präpariert, färbt und abbildet, um die Struktur und Funktion der Mitochonrien zu untersuchen.

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