Drosophila Vorbereitung und Longitudinal Imaging der Herzfunktion in vivo unter Verwendung optischer Kohärenzmikroskopie (OCM)

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Herzfunktion von Drosophila in vivo mit Hilfe einer optischen Kohärenzmikroskopie longitudinal abzubilden. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der kardialen strukturellen und funktionellen Entwicklung von Drosophila zu beantworten, indem sie Metriken wie Änderungen des Herzdurchmessers, der Herzfrequenz und der kardialen Aktivitätsperiode während der Drosophila-Metamorphose liefert. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die optische Kohärenzmikroskopie in der Lage ist, Kleintierherzen nichtinvasiv mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung abzubilden.

Diese Technik kann dazu beitragen, die Mechanismen menschlicher Herzerkrankungen und die Beziehung zur kardialen Entwicklung aufgrund der genetischen Ähnlichkeiten, die zwischen Drosophila und Wirbeltieren bestehen, aufzudecken. Diese Methode kann auch auf andere Systeme angewendet werden, z. B. auf die optogenetische Stimulation zur Untersuchung oder Behandlung einer geschwächten Herzschrittmacherfunktion in Tiermodellen. Wenn Sie die Fliegen für dieses Experiment produzieren, lassen Sie die reproduktiven Elternfliegen sich acht Stunden lang paaren und Eier in ein frisches Fläschchen legen.

So entwickelt sich das Gelege der gelegten Eier zu Fliegen ähnlichen Alters. Um eine Larve für die OCM-Bildgebung zu montieren, bereiten Sie zunächst eine saubere Seite mit einem Stück doppelseitigem Klebeband vor. Drücke alle eingeschlossenen Luftblasen unter dem Klebeband heraus.

Verwenden Sie anschließend eine weiche Bürste, um eine Larve in der richtigen Größe aus dem Fläschchen zu entfernen. Legen Sie die Larve auf ein sauberes Taschentuch. Entfernen Sie anhaftende Lebensmittel mit einer angefeuchteten Bürste und lassen Sie sie anschließend trocknen.

Bestätigen Sie nun unter einem Weitfeldmikroskop das Entwicklungsstadium der Larve. Positionieren Sie dann die Larve mit der Rückenseite nach oben, um sie zu montieren. Senken Sie dann den klebrigen Objektträger auf die Larve ab und üben Sie mäßigen Druck aus, um ihn auf dem Klebeband zu befestigen.

Setzen Sie die montierte Larve mit der Rückenseite nach oben in y-Querrichtung auf den verstellbaren Tisch des OCM-Systems. Ein kleines Loch im Tisch verhindert, dass die Larve mit der Stagefläche in Berührung kommt. Ein breites Lumen des Herzschlauchs befindet sich von den Segmenten A5 bis A8. Ermitteln Sie anhand der Echtzeitbilder auf dem Computer den hinteren Bereich des Herzschlauchs und bewegen Sie den Tisch nach vorne, bis das A7-Segment sichtbar ist.

Legen Sie nun die Parameter der Bildaufnahme fest. Verwenden Sie 100 A-Bilder pro B-Bild und 100 B-Bilder. Stellen Sie dann die Scannerspannung auf etwa 0,28 Millimeter in x-Querrichtung und auf 0 Volt in y-Querrichtung ein.

Blockieren Sie als Nächstes den Probenstrahlengang mit einem dunklen Tuch und klicken Sie auf die Startschaltfläche in der Software, um Hintergrundrauschdaten für die Hintergrundsubtraktion zu erfassen. Um transversale M-Modus-Bilder zu erfassen, stellen Sie die Parameter auf 128 A-Bilder pro B-Bild ein und verwenden Sie 4.096 B-Bilder. Stellen Sie dann die Spannung so ein, dass sie wie zuvor 0,28 Millimeter in x-Richtung und 0 Volt in y-Richtung abdeckt.

Nehmen Sie dann Bilder im transversalen M-Modus des A7-Segments des Fliegenherzschlauchs auf. Blockieren Sie während des Datenspeichervorgangs den Bildstrahl mit einem dunklen Tuch, um die Lichteinwirkung auf die Probenprobe zu minimieren. Bilde das Herz fünfmal ab, um eine zuverlässige Messung der Herzfunktion zu erhalten.

Um dreidimensionale Bilder zu erfassen, verwenden Sie 400 A-Bilder pro B-Bild, 800 B-Bilder und verwenden Sie eine Spannung von 1,7 Millimetern auf dem x-quer und etwa 4 Millimeter auf dem y-quer. Bewegen Sie dann den Mikroskoptisch, um die gesamte Fliege zu beobachten, und stellen Sie den Fokus ein, um klare Bilder zu sehen. Um die Larve zu entfernen, verwenden Sie eine feuchte, weiche Bürste, um sie in ein neues Fläschchen mit frischem Futter für die weitere Entwicklung und Längsschnittuntersuchung zu übertragen.

Das breite Lumen des Herzschlauchs verbleibt im Puppenstadium PD1 bei den Segmenten A5 bis A8. Versuchen Sie bei PD1, das A7-Segment abzubilden, wie es bei den Larven im L2- und L3-Stadium der Fall ist. Das Puppenstadium von PD1 ist an dem weißen Puparium zu erkennen.

Dieses Zeitfenster ist ideal für die optische Bildgebung der frühen Puppe, da die hohe Transparenz zu einer höheren Lichtdurchdringung für die OCM-Bildgebung führt. Reinigen Sie die Puppe mit der Bürste, wenn Lebensmittel am Körper kleben. Montieren Sie die Puppe mit einer feuchten Bürste auf einen kleinen Glasschieber und halten Sie die Rückenseite nach oben.

Der Objektträger sollte in ein Fliegenrohr passen, um die Entwicklung des Tieres in seiner eigenen Kammer zu erhalten. Trocknen Sie überschüssiges Wasser von der Puppe ab und legen Sie sie dann mit der Puppe nach oben auf den Tisch und fahren Sie mit dem Bild des A7-Segments fort, wie es mit der Larve geschehen ist. Übertragen Sie nach der Bildgebung den Objektträger mit der Puppe in das Röhrchen für die kontinuierliche Kultur.

Nach der PD1-Phase, beginnend bei der PD2, beginnt sich zwischen den Segmenten A1 und A4 eine konische Kammer zu entwickeln. Da die Puppen zunehmend undurchsichtiger werden, verringert sich die Eindringtiefe des Bildgebungssystems. Bei PD2 wird die Puppenschale gelblich und der Körper ist weniger transparent als bei PD1.

Bei PD3 ist die Farbe der Puppe noch etwas dunkler als die des PD2-Stadiums. Im PD4-Stadium sind schwarze Streifen im Inneren der Schale zu erkennen. Einige PD4 entwickeln sich zu Erwachsenen und andere treten in das PD5-Stadium ein.

In der PD5-Stufe sind die schwarzen Streifen noch deutlicher. Nehmen Sie eine PD2-Puppe mit einer Pinzette auf und befestigen Sie sie auf einer Rutsche. Suchen Sie auf dem OCM-System das vordere Ende des Herzschlauchs und bewegen Sie sich dann etwa 50 Mikrometer in Richtung posterior, um das A1-Segment des Herzschlauchs zu finden.

Beachten Sie, dass im PD2-Stadium die konische Kammer des Herzens sehr klein ist und möglicherweise noch nicht schlägt. Fahren Sie mit der Bildgebung wie zuvor beschrieben fort. Wiederholen Sie das gleiche Verfahren für die Bildgebung von Drosophila in den Stadien PD3, PD4 und PD5.

Zu Beginn füllst du die adulte Fliege in ein leeres Fläschchen mit einem Volumen von etwa 45 Millilitern. Tauchen Sie dann einen Watteapplikator in die Anästhesielösung und stecken Sie den Zauberstab mit der Wattespitze direkt unter dem Wattestopfen in das Fläschchen. Warten Sie drei Minuten.

Die erwachsene Fliege wird je nach Größe zweieinhalb bis dreieinhalb Minuten lang betäubt. Bereiten Sie nun einen Objektträger mit einem Stück doppelseitigem Klebeband vor. Bewegen Sie dann die betäubte Fliege mit einer weichen Bürste mit der Rückenseite nach oben auf den Objektträger.

Trennen Sie unter einem Weitfeldmikroskop die Flügel mit einer Pinzette und kleben Sie sie auf das Klebeband, um so die Herzregion für die Bildgebung freizulegen. Verwenden Sie nun die zuvor beschriebene bildgebende Technik, um das A1-Segment des Herzens abzubilden, und opfern Sie die Fliege am Ende des Experiments. Die longitudinale kardiale Bildgebung wurde mit Stammfliegen und einer Kopie des 24B-GAL4-Treibers durchgeführt.

Im Larvenstadium beginnt der Herzschlauch an der hinteren Bauchregion A8 mit einem breiteren Lumen und endet am vorderen dorsalen Segment A1 mit einem schmaleren Durchmesser. Gegen Ende der PD2 begann sich im Segment A1 bis A4 eine konische Kammer zu entwickeln. Die Herzfrequenz der Fliege wurde aus den transversalen MCM-Bildern quantifiziert.

Kurioserweise hörte das Herz während der Puppenphase gelegentlich auf zu schlagen. Insgesamt verlangsamte sich der Herzschlag vom Larvenstadium bis zum Puppenstadium signifikant und stieg dann von der Puppe bis zum Erwachsenen erheblich an. Seit dieser Entwicklung hat diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Entwicklungskardiologie ein neues Werkzeug an die Hand gegeben, um die Auswirkungen verschiedener Gene auf die Herzentwicklung in Drosophila-Modellen zu untersuchen.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Entwicklung einer Drosophila sorgfältig zu verfolgen, um Bilder in jedem Entwicklungsstadium zu erstellen.