Name: Drosophila Vorbereitung und Longitudinal Imaging der Herzfunktion in vivo unter Verwendung optischer Kohärenzmikroskopie (OCM) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Erfahren Sie die optische Kohärenzmikroskopie zur longitudinalen Bildgebung der Herzfunktion von Drosophila in vivo. Diese nichtinvasive Methode ermöglicht die quantitative Analyse kardialer Parameter während der Metamorphose.

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Diese Arbeit wurde unterstützt vom Lehigh University Start-Up Fund, dem NIH (R00EB010071 zu C.Z., R15EB019704 zu C.Z. und A.L., R03AR063271 zu A.L. und R01AG014713 und R01MH060009 zu R.E.T.), der NSF (1455613 zu C.Z. und A.L.), dem Cure Alzheimer's Fund (zu R.E.T.) und dem Massachusetts General Hospital (Executive Committee on Research Award an A.L.). M.C. und Y.M. wurde unterstützt durch das National Key Basic Research Program China (973-Programm) unter der Fördernummer 2014CB340404.

1. Herstellung von OCM - System für die optische Bildgebung von Drosophila 16 <ol><li> Wählen Sie ein Spektrometer und ein Hochgeschwindigkeits - Zeilenkamera , die eine Bildrate von mindestens 80 Bilder / s bereitstellt , so wird das OCM System in der Lage sein , den Herzschlag von Drosophila zu lösen. </li><li> Verwenden , um eine Breitbandlichtquelle , die axiale Auflösung von 2 &amp; mgr; m , um sicherzustellen , das Herz Struktur Drosophila zu identifizieren. </li><li> Verwenden Sie ein 10X-Objektiv eine hohe Quer Auflösung zu erhalten. </li><li> Verwenden Sie einen 45 ° Stabspiegel des Referenzarmes Lichtstrahl zu reflektieren und einen ringförmigen Probenarm Lichtstrahl zu erzeugen, um die Tiefenschärfe in den Proben zu verlängern. </li><li> Entwickeln Sie eine benutzerdefinierte Computerprogramm das OCM-System zur Steuerung und Messungen durchführen. </li></ol> 2. Drosophila Kultur <ol><li> Standard - Fly Essenszubereitung <ol><li> Setzen Sie ~ 5 ml Instant Drosophila Formel in eine Polystyrol FläschchenRohr mit Hilfe eines Papierschacht ein. </li><li> Gießen ~ 8 ml Wasser in die Formel richtig die Nahrung sättigen. </li><li> In verschiedenen Ergänzungen zur Standardfliegenfutter für verschiedene Experimente. Wenn für all - trans - Retinal (ATR) Nahrung für die optogenetische Vorbereitung Experiment Stimulation 35, verwenden Sie eine Pipette 100 mM ATR zu extrahieren und in ~ 8 ml Wasser auflösen , um die ATR - Konzentration von 1 mM in Essen. Nachdem die Lösung gleichmäßig mischen, gießen Sie die Lösung in die Formel und rühren Sie es ausreichend. </li><li> Eine fettreiche Diät-für die Untersuchung im Zusammenhang mit Fettleibigkeit Herzstörungen in Drosophila, 10,15 Mix ~ 10 ml Formel mit 15 ml Wasser in eine Tasse und Hitze für 30 Sekunden in der Mikrowelle zuzubereiten. Setzen Sie etwas kaltgepresstes Bio-Kokosöl in einem anderen Becher und erhitzen Sie es für 90 Sekunden in der Mikrowelle. </li><li> Extrakt 7,5 ml Kokosöl und mischen sich mit dem vorbereiteten Formel ausreichend, das Gewicht / Volumen-Verhältnis von Kokosöl zu Nahrungsmitteln zu machen ~ 30/100 und then-Extrakt ~ 2 ml gemischt Lebensmittel und legte es aus einem Rohr nach unten. </li><li> Warten Sie 1 Minute, bis das Medium gründlich gesättigt ist. Komprimieren Sie die Lebensmittel sorgfältig mit einer flachen Oberfläche , die Lebensbedingungen für die Drosophila zu optimieren. In 6 - 8 Körner von Hefe auf die vorbereitete Formel, und schließen Sie das Rohr mit einem Cluster von Baumwolle. </li></ol></li><li> Fruchtfliegen - Kreuze und Kultur <ol><li> Nehmen Sie einen Schlauch mit vorbereiteten Standard-Fliegen Essen, und entfernen Sie die eingesteckt Baumwolle. übertragen Sie vorsichtig die erwachsenen Fliegen (männlich und weiblich) mit dem Rohr, und stecken Sie sofort das Rohr mit Baumwolle. Überprüfen Sie die Baumwolle, um sicherzustellen, dass es keine Lücke zwischen der Baumwolle und der Rohrwand zu verhindern Fliegen aus aus dem Rohr austritt. </li><li> Halten Sie die Fruchtfliegen im Inkubator bei 25 ° C für Einkreuzungen. Die meisten der Gene aktiv sind und die zellulären Proteine werden bei 25 ° C 36-39 synthetisiert. </li><li> Nehmen Sie den Schlauch aus dem Inkubator aus nach 8 Hand Übertragung der eindult fliegt aus der Röhre, die Eier in ähnlichem Alter für experimentelle Kontrolle zu erhalten. </li><li> Weiterhin die Eier Kultivierung im Brutschrank bei 25 ° C, die für Drosophila - Entwicklung mit der Entwicklungszeit 8,5 Tage 40,41 der Standardtemperatur ist. HINWEIS: Die Temperatur beeinflusst die Entwicklungszeit (Ei bis zum erwachsenen) und Expression von verschiedenen Genen. </li></ol></li></ol> 3. Durchführung Optical Imaging mit OCM <ol><li> Berg Fly Larve für Optical Imaging ANMERKUNG: Das Ei von Drosophila Schraffuren in 22 bis 24 Stunden bei 25 ° C zu der ersten instar Larven (L1). Die zweite Larvenstadium tritt nach weiteren 24 Stunden. Die größte Larvenform ist das dritte Larvenstadium, die nach etwa 24 Stunden häutet. Strukturmerkmale in Larve kann verwendet werden, um ihre verschiedenen Entwicklungsstadien unterscheiden. Die Größe der Mundwerkzeuge zwischen dem ersten und dem zweiten instar instar unterscheidet. Der MundHaken der ersten instar Larven sind sehr klein und sehen aus wie zwei Paare von winzigen schwarzen Punkten, während die Mundhaken des zweiten Larvenstadium sind größer und die Struktur ist klarer. Die Stigmen sind in der Regel verwendet, um die zweite instar und den dritten Häutungsstadium zu identifizieren. Die zweite Larvenstadium hat vorderen Stigmen geprügelt, während für das dritte Larvenstadium, die vorderen Stigmen verzweigt sind. Ein dunkelorange Ring beginnt an der Spitze der hinteren Stigmen im dritten Larvenstadium zu erscheinen. <ol><li> Tragen Sie ein Stück doppelseitiges Klebeband an einem sauberen Mikroskop Objektträger aus Glas. Vertreibt die Luftblasen unter dem Band die Reflexionen durch Luftblasen während der Bildgebung zu vermeiden. </li><li> Nehmen Sie eine der Röhren mit den gezüchteten Fliegen aus dem Inkubator im Larvenstadium. </li><li> Identifizieren Sie die Larve in den Medien, entfernen Sie sie aus den Medien mit einer weichen Bürste und auf einem sauberen Tuch. Entfernen Sie alle an die Larve stecken Essen mit einem feuchten weichen Bürste und trocknen Sie sie auf das Gewebe. </li><li> Bewegen Sie den cleaneauf ein Gewebe unter der Objektivlinse eines Weitfeld-Mikroskop d fliegen. </li><li> Stellen Sie den Fokus des Mikroskops eine klare Sicht auf die Fliege zu finden. Identifizieren Sie die richtigen Entwicklungsstadium der Larve durch seine strukturellen Eigenschaften mit dem Mikroskop. </li><li> Positionieren Sie die Fliege den weichen Bürste. Sicherstellen, dass der Körper gerade mit der Rückenseite nach oben weist zur Montage auf dem Glasobjektträger von der dorsalen Seite vorzubereiten. Führen Sie diesen Schritt unter dem Mikroskop. </li><li> Achten Sie darauf, die Larve vor der Montage auf dem Band vollständig trocken ist. Andernfalls wird die Larve nicht auf dem Band haften. </li><li> Kleben Sie die Rückenseite des positionierten Fliege zum doppelseitigen Klebeband auf dem Glasträger mit mäßigem Druck. Beachten Sie, dass zu viel Druck kann die Fliege und zu wenig Kraft zu töten führen Bewegung während der Bildgebung zu fliegen. </li></ol></li><li> Optical Imaging von Drosophila an Larvalstadien (L2 und L3) mit OCM HINWEIS: Eine breite Lumen des Herzens Rohr fo sein kannund befindet sich in den Segmenten zwischen A5 bis A8 in den Larvenstadien (Abbildung 1). Die Quer OCM M-Modus-Bilder (2D + Zeit) wurden für jede Larve im A7 Segment des Herzrohr erfasst den systolischen und diastolischen Analyse zu erleichtern. <ol><li> Platzieren Sie die montierte Larve auf die einstellbare Probenstufe des OCM System entlang der Y-Querrichtung mit der Rückenseite nach oben weisend unterhalb der Objektivlinse. Ein kleines Loch in der Probentisch ist zum Platzieren der Larve notwendig sein Kontakt mit der Tischebene zu vermeiden. </li><li> Stellen Sie den Probentisch das Herz Rohr der Fruchtfliege zu der Brennebene des Abbildungsstrahls zu bewegen. Um bequem die A7-Segment zu finden, finden Sie den hinteren Bereich des Herzens Rohr mit dem Echtzeit-Querschnitts OCM Bilder in der Bilderfassungssoftware. Dann bewegen uns auf die Bühne, bis die A7 Segment sichtbar ist. </li><li> Die Parameter der Bildaufnahme-Software auf 100 A-Scans pro B-Scan (Rahmen), 100 B-Scans und die scanner Spannung zu bedecken ~ 0,28 mm in der x-Querrichtung, und 0 V in der Y-Querrichtung. Klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Start&quot; in der Software, um die Hintergrundrauschen Daten für Untergrundsubtraktion zu erwerben, indem die Probe Strahlengang mit einem dunklen Tuch blockiert. HINWEIS: 3 der 100 Rahmen für den Hintergrundabzug verwendet werden. </li><li> Set Parameter der Datenerfassungs-Software zu 128 A-Scans pro B-Scan, 4096 B-Scans und der Scannerspannung abzudecken ~ 0,28 mm in der x-Querrichtung, und 0 V in der Y-Querrichtung. Klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Start&quot; in der Software , die Quer M-Modus Bilder über das A7 - Segment des Fliegenherzrohr über einen Bereich zu erwerben Abdeckung 0,28 x 0,57 mm 2 für etwa 30 Sekunden. </li><li> Blockieren Sie den Abbildungsstrahl ein dunkles Tuch während der Datenspeichervorgang mit längerer Einwirkung der Fliege Herz dem Abbildungslicht zu vermeiden. </li><li> Wiederholen Sie die Messung für 5 mal zuverlässige Messung der Herz Spaß zu bekommenction. </li><li> Set Parameter der Bildaufnahme-Software zu 400 A-Scans pro B-scan, 800 B-Scans und der Scannerspannung abzudecken ~ 1,7 mm in der x-Querrichtung, und ~ 4 mm in der Y-Querrichtung. Bewegen Sie die Bühne in beiden Richtungen die ganze Fruchtfliege, um sicherzustellen, können abgebildet werden. Klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Start&quot; in der Software einen Datensatz zu erwerben Bilder von der Fruchtfliege in 3 Dimensionen zu erhalten. Hinweis: Die 3D-Struktur fliegen kann gemacht werden mit Amira 3D-Software </li><li> Verwenden Sie einen feuchten weichen Bürste die gemessene Fliege zu befeuchten und vorsichtig aus dem Glasobjektträger zu entfernen. Bewegen Sie es in ein separates Rohr für die kontinuierliche Entwicklung. Das Röhrchen für Langzeitstudie über die nächsten Entwicklungsstufen. </li></ol></li><li> Bild Drosophila bei Puppenstadien HINWEIS: Alle Fruchtfliegen wurden für die Bildgebung von PD1 bis PD5 entnommen. Wie in der schematischen Larve in 1b gezeigt ist , verbleibt ein breites Lumen in A5 bis A8 Segmenten the Herz Rohr bis PD1. Von PD2, beginnt eine konische Kammer zwischen A1 bis A4 Segmente zu entwickeln. Um konsistente Bilder erwerben und Herzanalyse, quer M-Modus - Bilder wurden von der A7 Segment PD1 erhalten und von der A1 - Segment nach PD2 wie gekennzeichnet in 1b erleichtern. <ol><li> Bild Drosophila bei PD1 HINWEIS: Drosophila wird eine weiße Puparium für eine kurze Zeitfenster haben ( das 0 - 1 h) während PD1. Dieses Zeitfenster ist ideal für die optische Abbildung des frühen pupa Durchführung, da die hohe Transparenz zu einer höheren Lichteinfall für die OCM-Bildgebung führt. <ol><li> Da die Fruchtfliegen an der Rohrwand gefunden werden, wenn sie Puppe geworden, mit einem feuchten weichen Bürste, die Puppe aus einzelnen Rohren für die Bildgebung bei PD1 entfernen und die Puppe mit der Bürste reinigen, wenn es Nahrung für den Körper geklebt ist. </li><li> Montieren Sie die Fruchtfliege auf einem kleinen Glasobjektträger direkt mit dem nassen Pinsel und halten Sie die Rückenseite nach oben zeigt (Abbildung 1a </strOng&gt;). Sicherstellen, daß der Objektträger aus Glas klein genug ist, in das Rohr zurück zu passen, sobald Abbildungs ​​in dieser Stufe abgeschlossen ist. </li><li> Überschüssiges Wasser von der Seite des Flugkörpers. </li><li> Setzen Sie den Glasobjektträger auf der Probenbühne des OCM-System, halten die Fruchtfliege an der Spitze. Finden klare Echtzeit-Bild des A7 Segment der Fliege Herz die gleiche Strategie in der Larve Messung beschrieben verwendet. </li><li> Stellen Sie die gleichen Parameter der Datenerfassungs-Software, wie in Abschnitt 3.2 und Bild die Herzschläge an der A7 Segment quer M-Modus und 3D-Bilder zu erwerben. </li><li> Nach der Bebilderung verwenden eine Pinzette die Glasobjektträger mit Puppe zu legen zurück in das Rohr für die kontinuierliche Kultur. </li></ol></li><li> Bild Drosophila bei PD2 bis PD5 Stages HINWEIS: Da die Probe mehr und mehr opak während der Puppenstadien wird, wird die Eindringtiefe des Abbildungssystems reduziert. <ol><li> Verwenden Sie eine Pinzette vorsichtig das Glas s entfernenLiDE montiert mit der Fliege an PD2 aus der Tube für die Bildgebung. Bei PD2, wird die Probenschale gelblich und der Körper wird weniger transparent gegenüber PD1 (Abbildung 1). </li><li> Setzen Sie den Schieber auf der Probenbühne des OCM-System. </li><li> Stellen Sie die Probenbühne die Fliege in der Brennebene des Abbildungsstrahlen des OCM-System zu bewegen. Finden Sie das vordere Ende des Herzschlauches mit Echtzeit-Querschnitts OCM Bild. Bewegen Sie ~ 50 &amp; mgr; m zurück in die hintere Richtung der A1-Segment des Herzschlauches zu finden. HINWEIS: An diesem Punkt der Herzentwicklung (PD2), wird die konische Kammer sehr klein sein und nicht zu schlagen sein. </li><li> Sammeln Quer M-Modus-Datensätze aus dem A1-Segment als auch 3D-Daten der gleichen Methode wie in früheren Entwicklungsstufen verwendet wird. </li><li> Setzen Sie den Schlitten zurück in die Röhre vorsichtig für eine kontinuierliche Kultur. HINWEIS: Bei PD3, die Farbe der Probe in der Schale ist dunkler als die bei PD2 Stufe. Bei PD4 Bühne, ca schwarzen Streifenn innerhalb der Schale der Proben beobachtet werden. Einige Fliegen entwickeln in Erwachsenen aus dieser Phase in den nächsten Tag, während andere in PD5 entwickeln wird. Bei PD5 Stadium sind schwarze Streifen noch offensichtlich in den Fruchtfliegen gesehen. Diese Fliegen werden Erwachsene in den nächsten Tag werden. </li></ol></li></ol></li><li> Bild Drosophila an der Volksbühnen HINWEIS: Bei adulten Stadium, weibliche und männliche Fliegen können durch die Größe des Körpers und der Farbe des Unterleibs zu unterscheiden. Weibliche Erwachsene haben größere Größe, während die Männchen sind kleiner und dunkel gefärbten in den Unterleib. <ol><li> Nehmen Sie den Schlauch aus dem Inkubator, wenn die Fruchtfliege in einen Erwachsenen entwickelt und übertragen die Erwachsenen zu einer ~ 45 ml Fläschchen leer fliegen. </li><li> Tauchen Sie das saugfähige Ende (ca. 1 cm Länge, ca. 3 mm Durchmesser) eines Zauberstab in die Anästhesie, legte den Stab in das Fläschchen, und stecken Sie das Rohr mit einem Cluster von Baumwolle das Anästhetikum Ende zu halten, knapp unterhalb der gesteckten Baumwolle und anesthetize die Fliege für 3 min. Die Dauer der Anästhesie hängt von der Größe der Fliege, und kann zwischen 2,5 bis 3,5 min variieren (zum Beispiel: männlich für 2,5 min, weiblich für 3 oder 3,5 min). </li><li> Vorbereiten eines Glasobjektträger mit einem Stück doppelseitigem Klebeband. </li><li> Bewegen Sie den narkotisierten Fliege auf dem Glasobjektträger mit Rückenseite nach oben zeigt die weichen Bürste. </li><li> Trennen Sie die Flügel eine Pinzette mit und halten die Flügel auf dem Band unter dem Mikroskop die Fliege zu fixieren und den Herzbereich für die Bildgebung aus. </li><li> Bild die Fliege von der A1 - Segment der Fliege Herz (Abbildung 1). Am Ende des Experiments kann die fly geopfert werden. </li></ol></li></ol> 4. Imaging - Analyse 16 <ol><li> Entwickeln Sie Matlab-Programme, die 2D- und 3D-Binär-Dateien mit dem Bildaufnahme-Software zur Bilddateien gesammelt zu konvertieren. </li><li> Verwenden Sie ImageJ das Herz Rohrbereich in den Quer M-Modus-Bilder und einen Zauberstab Algorithmus zur Identifizierung createa Maske des Herzbereich für jeden Quer M-Modus-Bild. Segment den maskierten Bereich und mit einem Spitzenfindungsalgorithmus die systolischen und diastolischen Stellen zu identifizieren. Berechnen Sie die zeitabhängigen Herzdurchmesseränderungen von den Quer M-Modus-Bilder. </li><li> Basierend auf den erfassten zeitabhängigen Herz Durchmesser, berechnen die Herzparameter wie HR, Herzaktivitätsperiode (CAP), Ende der Diastole Durchmesser (EDD), Ende der Systole Durchmesser (ESD), Ende der Diastole Bereich (EDA) und Systole Bereich Ende ( ESA). Berechnen Sie die fraktionelle Verkürzung (FS) mit <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/55002/55002eq1.jpg" /></li><li> Verwenden Sie ImageJ die 3D-OCM Bilder zu analysieren, um die strukturelle Entwicklung der Fliege Herz zu visualisieren. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass es keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit der aktuellen Studie gibt.

Die schnellen Herzschlag von Drosophila, mit einem Maximum HR rund 400 bpm bei Larven und adulte Stadien, erfordert eine hohe Abbildungsgeschwindigkeit der Herz Diastolen und Extrasystolen (nicht weniger als 80 Bilder / s auf den Erfahrungen basiert) zu lösen. Aufgrund der geringen Größe und Herzkammer micron Skala Herzwanddicke (von 5 bis 10 &amp; mgr; m), eine hohe räumliche Auflösung (besser als 2 &amp; mgr; m) wird zur Lösung der Herzrohrstrukturen erforderlich. In dieser Studie wurde eine hohe Auflösung un...

Langzeitstudie des Herzens bei Kleintieren trägt eine Vielzahl von menschlichen verwandte kardiovaskuläre Erkrankungen zu verstehen, wie Gen - 1,2 angeborener Herzfehler bezogen. In den vergangenen Jahrzehnten von verschiedenen Tiermodellen, wie Maus 3,4, Xenopus 5,6, Zebrabärbling 7,8, Vogel- 9 und Drosophila 10-16, wurden verwendet , das menschliche Herz-Entwicklung im Zusammenhang mit Forschung zu betreiben. Das Maus - Modell wurde in großem Umfang mit dem menschlichen Herzen 3,4 studieren normalen und abnormalen Herzentwicklung und Herzfehler Phänotypen aufgrund ihrer Ähnlichkeiten verwendet. Der Embryo Xenopus ist besonders nützlich bei der Untersuchung der Herzentwicklung aufgrund seiner einfachen Handhabung und Teiltransparenz 5,6. Die Transparenz des Embryos und der frühen Larve des Zebrabärbling - Modell ermöglicht eine einfache optische Beobachtung der Herzentwicklung 7,8. Das aviäre Modell ist ein gemeinsames Thema Entwicklungsherz Studien because kann das Herz leicht , nachdem sie die Eischalen Entfernen zugegriffen werden und die morphologische Ähnlichkeit der aviären Herzen auf den Menschen 9. Das Drosophila - Modell hat einige einzigartige Eigenschaften , die es ideal für die Durchführung Längsschnittstudien des Herzens zu machen. Erstens ist das Herz Rohr Drosophila ~ 200 &amp; mgr; m unterhalb der dorsalen Oberfläche, die Bequemlichkeit für den optischen Zugang und die Beobachtung des Herzens liefert. Zusätzlich sind viele molekulare Mechanismen und genetischen Pfade zwischen Drosophila und Wirbeltieren konserviert. Die Orthologe von über 75% der menschlichen Krankheitsgene wurden in Drosophila gefunden , die es weithin 11,13 in transgenen Studien gemacht. Darüber hinaus hat sie eine kurze Lebensdauer und geringe Wartungskosten und 14-16 für Entwicklungsbiologie Forschung häufig verwendet als Mustermodell wurde. In früheren Berichten beschrieben , die Protokolle zur Überwachung Drosophila Herzfunktionen wie erArtbeat. Jedoch wurden Verfahren Dissektion erforderlich 17,18. Optisches Abbildungs ​​bietet einen effektiven Weg Herzentwicklung bei Tieren aufgrund seiner nicht-invasive Natur zu visualisieren. Unterschiedliche optische Bildgebungsverfahren wurden bei der Durchführung von Tierherzstudie, wie Zwei-Photonen - Mikroskopie 19, konfokale Mikroskopie 20,21, Lichtbogenmikroskopie 22 und die optische Kohärenztomographie (OCT) 16,23-26 angewendet. Vergleichsweise ist Oktober der Lage große Bildtiefe in Kleintierherzen Bereitstellung ohne Kontrastmittel verwendet werden, während eine hohe Auflösung und das einen extrem hohen Bildgebungsgeschwindigkeit zu halten, die für die Bildgebung wichtig sind lebende Tiere. Darüber hinaus hat die niedrige Kosten ein OCT-System für die Entwicklung dieser Technik zur optischen Abbildung von Proben populär. Oktober wurde für die Langzeitstudie von Drosophila erfolgreich eingesetzt. Unter Verwendung Oktober hat Herz-morphologische und funktionelle Bildgebung der Herzstrukturen zu studieren, die Func ausgeführt worden isttionale Rollen von Genen, und die Mechanismen kardiovaskulärer Defekte in mutant Modelle während der Herzentwicklung. Zum Beispiel altersabhängige Abnahme der Herzfunktion wurde mit herunterreguliert Angiotensin-Converting - Enzym-bezogenen (ACER) Gen in Drosophila mit 27. Oktober bestätigt. Phänotypisierung von Gen im Zusammenhang mit Kardiomyopathie wurde in Drosophila mit Oktober 28-33 demonstriert. Forschung unter Verwendung von Oktober zeigte auch die funktionelle Rolle des menschlichen SOX5 Gen im Herzen von Drosophila 34. Im Vergleich zu Oktober verwendet OCM ein Objektiv mit einer höheren numerischen Apertur bessere Quer Auflösung bereitzustellen. In der Vergangenheit führte die Fehlfunktion des Herzens durch ein Ortholog menschlichen zirkadianen Gen dCry / dclock Silencing wurde mit einem benutzerdefinierten OCM - System 15,16 studierte, sowie den Effekt der fett-Diät auf Kardiomyopathien in Drosophila Fettleibigkeit induzierten Mensch zu verstehen Herzerkrankungen. 15 Hier the experimentelle Protokoll wird auf den zweiten Häutungsstadium (L2), dritten Häutungsstadium (L3), puppen Tag 1 (PD1), puppen Tag 2 (PD2), puppen Tag 3 (PD3) für Langzeitstudie der Herz morphologische und funktionelle Veränderungen in Drosophila zusammengefasst , Puppe Tag 4 (PD4), Puppe Tag 5 (PD5) und Erwachsenen (Abbildung 1) mit OCM Untersuchung der menschlichen bezogenen kongenitalen Herzerkrankungen zu erleichtern. Herzfunktionsparameter, wie HR und GAP wurden in verschiedenen Entwicklungsstadien quantitativ analysiert, um die Herzentwicklung Merkmale offenbaren.

<table><tbody><tr><td>Kundenspezifisches OCM-Bildgebungssystem</td><td>Entwickelt in unserem Labor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>my Temp Mini Digital Incubator</td><td>Benchmark</td><td>H2200-HC</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas</td><td>AmScope</td><td>200PCS</td><td></td></tr><tr><td>Cotton Ball</td><td>RITE AID</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instant Drosophila Formula</td><td>CAROLINA</td><td>formula 4-24</td><td></td></tr><tr><td>Hefe</td><td>ActiveDry</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>SONY</td><td>WILD M420</td><td></td></tr><tr><td>Bürste</td><td>Loew-Cornell</td><td>245B</td><td>zum Bewegen von Proben</td></tr><tr><td>Labview-Software</td><td>National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Wiha</td><td>AA SA</td><td>zum Fixieren der Früchte FlyWings</td></tr><tr><td>FlyNap</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>4.224.898</td><td></td></tr><tr><td>Scotch Permanent Doppelseitiges Klebeband, 3 m</td><td>Scotch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette</td><td>Fisherbrand</td><td>MU18837</td><td></td></tr><tr><td>Organic Extra Coconut Oil</td><td>Spring Valley</td><td>13183</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>CapitolBrand</td><td>M3504-E</td><td></td></tr><tr><td> DrosophilaFläschchen</td><td>SEOH</td><td>8401SS</td><td></td></tr><tr><td>All-trans-retinal</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>R2500</td><td></td></tr></tbody></table>

drosophila vorbereitung und longitudinal imaging der herzfunktion in vivo unter verwendung optischer kohärenzmikroskopie (ocm)

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM)

Längsschnittuntersuchung des Herzschlags bei Kleintieren trägt zum Verständnis struktureller und funktioneller Veränderungen während der Herzentwicklung bei. Die optische Kohärenzmikroskopie (OCM) hat sich als fähig erwiesen, Kleintierherzen mit hoher räumlicher Auflösung und ultrahoher Bildgebungsgeschwindigkeit abzubilden. Der hohe Bildkontrast und die nicht-invasiven Eigenschaften machen OCM ideal für die Durchführung von Längsschnittstudien, ohne dass Gewebedissektionen oder Färbungen erforderlich sind. Drosophila wurde aufgrund ihrer hohen Anzahl orthologer menschlicher Krankheitsgene, ihrer Ähnlichkeit der molekularen Mechanismen und genetischen Signalwege mit Wirbeltieren, ihres kurzen Lebenszyklus und ihrer geringen Kulturkosten häufig als Modellorganismus in kardialen Entwicklungsstudien verwendet. Hier werden die experimentellen Protokolle für die Präparation von Drosophila und die optische Bildgebung des Herzschlags mit einem kundenspezifischen OCM-System über den gesamten Lebenszyklus der Probe beschrieben. Wenn Sie die in diesem Bericht beschriebenen Schritte befolgen, können transversale M-Mode- und 3D-OCM-Bilder aufgenommen werden, um Längsschnittstudien der kardialen Morphologie und Funktion der Drosophila durchzuführen. Die OCM-Bilder auf der Fläche und in axialen Schnitten sowie die Histogramme der Herzfrequenz (HR) und der Herzaktivitätsperiode (CAP) wurden ebenfalls gezeigt, um die strukturellen Veränderungen des Herzens zu analysieren und die Herzdynamik während der Drosophila-Metamorphose zu quantifizieren, kombiniert mit den Videos, die mit M-Mode-Bildern erstellt wurden, um die Herzaktivität intuitiv zu verfolgen. Aufgrund der genetischen Ähnlichkeit zwischen Drosophila und Wirbeltieren könnte eine Längsschnittuntersuchung der Herzmorphologie und -dynamik bei Fruchtfliegen dazu beitragen, die Ursprünge menschlicher Herzkrankheiten aufzudecken. Das Protokoll hier würde eine effektive Methode bieten, um eine breite Palette von Studien durchzuführen, um die Mechanismen von Herzerkrankungen beim Menschen zu verstehen.

Die Längsherzbildgebung wurde mit dem 24B-GAL4 / + Dehnung bei Raumtemperatur mit OCM mit den Fruchtfliegen durchgeführt. Messungen wurden bei L2, L3, und bei 8 Stunden Intervallen von PD1 bis PD4 und Erwachsenen Tag 1 durchgeführt (AD1) die Metamorphose - Verfahren (Tabelle 1) zu verfolgen. Larve, früh puppen, späte Puppe und erwachsenen Fliegen wurden auf den Glasobjektträger aufgebracht , wie in 1A gesehen. Die Segmentmerkmale des Herzens für Larven und erwachsenen Fliegen wurden in ...

Hier werden die experimentellen Protokolle für die Vorbereitung von Drosophila in verschiedenen Entwicklungsstadien und die Durchführung einer optischen Längsschnittbildgebung von Drosophila-Herzschlägen mit einem speziellen optischen Kohärenzmikroskopie-System (OCM) beschrieben. Die morphologischen und dynamischen Veränderungen des Herzens können durch die Analyse der strukturellen und funktionellen Parameter des Herzens aus OCM-Bildern quantitativ charakterisiert werden.

Drosophila Vorbereitung und Longitudinal Imaging der Herzfunktion in vivo unter Verwendung optischer Kohärenzmikroskopie (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Herzfunktion von Drosophila in vivo mit Hilfe einer optischen Kohärenzmikroskopie longitudinal abzubilden. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der kardialen strukturellen und funktionellen Entwicklung von Drosophila zu beantworten, indem sie Metriken wie Änderungen des Herzdurchmessers, der Herzfrequenz und der kardialen Aktivitätsperiode während der Drosophila-Metamorphose liefert. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die optische Kohärenzmikroskopie in der Lage ist, Kleintierherzen nichtinvasiv mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung abzubilden.Diese Technik kann dazu beitragen, die Mechanismen menschlicher Herzerkrankungen und die Beziehung zur kardialen Entwicklung aufgrund der genetischen Ähnlichkeiten, die zwischen Drosophila und Wirbeltieren bestehen, aufzudecken. Diese Methode kann auch auf andere Systeme angewendet werden, z. B. auf die optogenetische Stimulation zur Untersuchung oder Behandlung einer geschwächten Herzschrittmacherfunktion in Tiermodellen. Wenn Sie die Fliegen für dieses Experiment produzieren, lassen Sie die reproduktiven Elternfliegen sich acht Stunden lang paaren und Eier in ein frisches Fläschchen legen.So entwickelt sich das Gelege der gelegten Eier zu Fliegen ähnlichen Alters. Um eine Larve für die OCM-Bildgebung zu montieren, bereiten Sie zunächst eine saubere Seite mit einem Stück doppelseitigem Klebeband vor. Drücke alle eingeschlossenen Luftblasen unter dem Klebeband heraus.Verwenden Sie anschließend eine weiche Bürste, um eine Larve in der richtigen Größe aus dem Fläschchen zu entfernen. Legen Sie die Larve auf ein sauberes Taschentuch. Entfernen Sie anhaftende Lebensmittel mit einer angefeuchteten Bürste und lassen Sie sie anschließend trocknen.Bestätigen Sie nun unter einem Weitfeldmikroskop das Entwicklungsstadium der Larve. Positionieren Sie dann die Larve mit der Rückenseite nach oben, um sie zu montieren. Senken Sie dann den klebrigen Objektträger auf die Larve ab und üben Sie mäßigen Druck aus, um ihn auf dem Klebeband zu befestigen.Setzen Sie die montierte Larve mit der Rückenseite nach oben in y-Querrichtung auf den verstellbaren Tisch des OCM-Systems. Ein kleines Loch im Tisch verhindert, dass die Larve mit der Stagefläche in Berührung kommt. Ein breites Lumen des Herzschlauchs befindet sich von den Segmenten A5 bis A8. Ermitteln Sie anhand der Echtzeitbilder auf dem Computer den hinteren Bereich des Herzschlauchs und bewegen Sie den Tisch nach vorne, bis das A7-Segment sichtbar ist.Legen Sie nun die Parameter der Bildaufnahme fest. Verwenden Sie 100 A-Bilder pro B-Bild und 100 B-Bilder. Stellen Sie dann die Scannerspannung auf etwa 0,28 Millimeter in x-Querrichtung und auf 0 Volt in y-Querrichtung ein.Blockieren Sie als Nächstes den Probenstrahlengang mit einem dunklen Tuch und klicken Sie auf die Startschaltfläche in der Software, um Hintergrundrauschdaten für die Hintergrundsubtraktion zu erfassen. Um transversale M-Modus-Bilder zu erfassen, stellen Sie die Parameter auf 128 A-Bilder pro B-Bild ein und verwenden Sie 4.096 B-Bilder. Stellen Sie dann die Spannung so ein, dass sie wie zuvor 0,28 Millimeter in x-Richtung und 0 Volt in y-Richtung abdeckt.Nehmen Sie dann Bilder im transversalen M-Modus des A7-Segments des Fliegenherzschlauchs auf. Blockieren Sie während des Datenspeichervorgangs den Bildstrahl mit einem dunklen Tuch, um die Lichteinwirkung auf die Probenprobe zu minimieren. Bilde das Herz fünfmal ab, um eine zuverlässige Messung der Herzfunktion zu erhalten.Um dreidimensionale Bilder zu erfassen, verwenden Sie 400 A-Bilder pro B-Bild, 800 B-Bilder und verwenden Sie eine Spannung von 1,7 Millimetern auf dem x-quer und etwa 4 Millimeter auf dem y-quer. Bewegen Sie dann den Mikroskoptisch, um die gesamte Fliege zu beobachten, und stellen Sie den Fokus ein, um klare Bilder zu sehen. Um die Larve zu entfernen, verwenden Sie eine feuchte, weiche Bürste, um sie in ein neues Fläschchen mit frischem Futter für die weitere Entwicklung und Längsschnittuntersuchung zu übertragen.Das breite Lumen des Herzschlauchs verbleibt im Puppenstadium PD1 bei den Segmenten A5 bis A8. Versuchen Sie bei PD1, das A7-Segment abzubilden, wie es bei den Larven im L2- und L3-Stadium der Fall ist. Das Puppenstadium von PD1 ist an dem weißen Puparium zu erkennen.Dieses Zeitfenster ist ideal für die optische Bildgebung der frühen Puppe, da die hohe Transparenz zu einer höheren Lichtdurchdringung für die OCM-Bildgebung führt. Reinigen Sie die Puppe mit der Bürste, wenn Lebensmittel am Körper kleben. Montieren Sie die Puppe mit einer feuchten Bürste auf einen kleinen Glasschieber und halten Sie die Rückenseite nach oben.Der Objektträger sollte in ein Fliegenrohr passen, um die Entwicklung des Tieres in seiner eigenen Kammer zu erhalten. Trocknen Sie überschüssiges Wasser von der Puppe ab und legen Sie sie dann mit der Puppe nach oben auf den Tisch und fahren Sie mit dem Bild des A7-Segments fort, wie es mit der Larve geschehen ist. Übertragen Sie nach der Bildgebung den Objektträger mit der Puppe in das Röhrchen für die kontinuierliche Kultur.Nach der PD1-Phase, beginnend bei der PD2, beginnt sich zwischen den Segmenten A1 und A4 eine konische Kammer zu entwickeln. Da die Puppen zunehmend undurchsichtiger werden, verringert sich die Eindringtiefe des Bildgebungssystems. Bei PD2 wird die Puppenschale gelblich und der Körper ist weniger transparent als bei PD1.Bei PD3 ist die Farbe der Puppe noch etwas dunkler als die des PD2-Stadiums. Im PD4-Stadium sind schwarze Streifen im Inneren der Schale zu erkennen. Einige PD4 entwickeln sich zu Erwachsenen und andere treten in das PD5-Stadium ein.In der PD5-Stufe sind die schwarzen Streifen noch deutlicher. Nehmen Sie eine PD2-Puppe mit einer Pinzette auf und befestigen Sie sie auf einer Rutsche. Suchen Sie auf dem OCM-System das vordere Ende des Herzschlauchs und bewegen Sie sich dann etwa 50 Mikrometer in Richtung posterior, um das A1-Segment des Herzschlauchs zu finden.Beachten Sie, dass im PD2-Stadium die konische Kammer des Herzens sehr klein ist und möglicherweise noch nicht schlägt. Fahren Sie mit der Bildgebung wie zuvor beschrieben fort. Wiederholen Sie das gleiche Verfahren für die Bildgebung von Drosophila in den Stadien PD3, PD4 und PD5.Zu Beginn füllst du die adulte Fliege in ein leeres Fläschchen mit einem Volumen von etwa 45 Millilitern. Tauchen Sie dann einen Watteapplikator in die Anästhesielösung und stecken Sie den Zauberstab mit der Wattespitze direkt unter dem Wattestopfen in das Fläschchen. Warten Sie drei Minuten.Die erwachsene Fliege wird je nach Größe zweieinhalb bis dreieinhalb Minuten lang betäubt. Bereiten Sie nun einen Objektträger mit einem Stück doppelseitigem Klebeband vor. Bewegen Sie dann die betäubte Fliege mit einer weichen Bürste mit der Rückenseite nach oben auf den Objektträger.Trennen Sie unter einem Weitfeldmikroskop die Flügel mit einer Pinzette und kleben Sie sie auf das Klebeband, um so die Herzregion für die Bildgebung freizulegen. Verwenden Sie nun die zuvor beschriebene bildgebende Technik, um das A1-Segment des Herzens abzubilden, und opfern Sie die Fliege am Ende des Experiments. Die longitudinale kardiale Bildgebung wurde mit Stammfliegen und einer Kopie des 24B-GAL4-Treibers durchgeführt.Im Larvenstadium beginnt der Herzschlauch an der hinteren Bauchregion A8 mit einem breiteren Lumen und endet am vorderen dorsalen Segment A1 mit einem schmaleren Durchmesser. Gegen Ende der PD2 begann sich im Segment A1 bis A4 eine konische Kammer zu entwickeln. Die Herzfrequenz der Fliege wurde aus den transversalen MCM-Bildern quantifiziert.Kurioserweise hörte das Herz während der Puppenphase gelegentlich auf zu schlagen. Insgesamt verlangsamte sich der Herzschlag vom Larvenstadium bis zum Puppenstadium signifikant und stieg dann von der Puppe bis zum Erwachsenen erheblich an. Seit dieser Entwicklung hat diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Entwicklungskardiologie ein neues Werkzeug an die Hand gegeben, um die Auswirkungen verschiedener Gene auf die Herzentwicklung in Drosophila-Modellen zu untersuchen.Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Entwicklung einer Drosophila sorgfältig zu verfolgen, um Bilder in jedem Entwicklungsstadium zu erstellen.

drosophila-preparation-longitudinal-imaging-heart-function-vivo-using

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir haben eine Semi-automatische optische Heartbeat Analysemethode (SOHA) für die Analyse von optischen Hochgeschwindigkeits-Aufnahmen aus den...

Semi-automatische optische Heartbeat-Analyse von kleinen Herzen

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Vorbereitung der Embryonen für Elektronenmikroskopie der Drosophila Embryonale Herz Rohr

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Single Drosophila Ommatidium Dissection und Imaging

Dieses Protokoll stellt eine effiziente Methode zur Bildgebung des lebenden Neuroepithels des Puppenaugen von Drosophila dar. Diese Methode kompensiert Gewebebewegungen und ungleichmäßige Topologie, verbessert die Visualisierung von Zellgrenzen durch die Verwendung mehrerer GFP-markierter Verbindungsproteine und verwendet ein einfach zu montierendes Bildgebungsgerät.

Live-Bilder aus dem Drosophila Pupal Augen

Dieses Protokoll beschreibt ein detailliertes Verfahren für die langfristigen ex vivo Kultur und die Bildgebung eines Imaginalscheibe Drosophila. Es zeigt Photorezeptordifferenzierung und Ommatidienrotation innerhalb der 10 Stunden Periode von Live-Aufnahmen des Auges Scheibe. Das Protokoll ist einfach und erfordert keine teure Einrichtung erforderlich.

Langfristige Live-Imaging von<em&gt; Drosophila</em&gt; Augen Disc

Dieses Protokoll beschreibt wie hochauflösende bildgebende Verfahren wie spectral-Domain optische Kohärenztomographie und scanning Laser Ophthalmoskopie in kleine Nagetiere, mit einer ophthalmologischen Bildgebung Plattform-System, um Auskunft über genutzt werden Netzhautdicke und Microglial Zelle Verteilung, beziehungsweise.

In Vivo Darstellung der Cx3cr1GLP/Gfp Reporter Mäuse mit Spectral-Domain optische Kohärenztomographie und Scanning Laser Ophthalmoskopie

Es wird ein Protokoll vorgestellt, das die Visualisierung intakter Drosophila melanogaster in jedem Entwicklungsstadium mittels Mikrocomputed Tomographie ermöglicht.

Ganztierbildgebung von Drosophila melanogaster mittels Mikrocomputed Tomographie

Hier wird ein Protokoll zur Mikroinjektion und gleichzeitigen Abbildung mehrerer Drosophila-Embryonen während der embryonalen Entwicklung mit einem plattenbasierten, hochinhaltigen Imager vorgestellt.

Drosophila Embryo Vorbereitung und Mikroinjektion für die Live-Zellmikroskopie mit einem automatisierten High Content Analyzer durchgeführt

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Erzeugung von Drosophila melanogaster , die eNpHR2.0 oder ReaChR-Opsine im Herzen exprimieren, für die OCT-Bildgebung und die optogenetische Herzschrittbildung. Detaillierte Anweisungen für die Drosophila OCT-Bildgebung und Herzschlagmodulation, einschließlich der Simulation von wiederherstellbarem Herzstillstand, Bradykardie und Tachykardie bei lebenden Tieren in verschiedenen Entwicklungsstadien, werden berichtet.

Entwicklung von Drosophila melanogaster Modellen für die Bildgebung und optogenetische Kontrolle der Herzfunktion

Die Kontraktilität von Actomyosin spielt eine wichtige Rolle bei der Zell- und Gewebemorphogenese. Es ist jedoch schwierig, die Actomyosin-Kontraktilität in vivo akut zu manipulieren. Dieses Protokoll beschreibt ein optogenetisches System, das die Rho1-vermittelte Actomyosin-Kontraktilität in Drosophila-Embryonen schnell hemmt und den sofortigen Verlust der Epithelspannung nach der Inaktivierung von Actomyosin in vivo aufdeckt.

Optogenetische Hemmung der Rho1-vermittelten Actomyosin-Kontraktilität gekoppelt mit Messung der Epithelspannung in Drosophila-Embryonen

Das Drosophila-Protokoll für Herzschnitte und Fluoreszenzbildgebung vereinfacht die Untersuchung von Herzstrukturen und -pathologien. Dieser Ansatz beinhaltet einfaches Schneiden, Färben und Imaging, wobei das technische Know-how, das für die herkömmliche Dissektion erforderlich ist, umgangen wird. Es verbessert die Zugänglichkeit und macht Drosophila zu einem breiter nutzbaren Modell für die kardiale Forschung in der breiteren wissenschaftlichen Gemeinschaft.

Neuartige und effiziente Methode zur Fluoreszenzfärbung von Drosophila-Herzen mit Kryosektion

Erfahren Sie die optische Kohärenzmikroskopie zur longitudinalen Bildgebung der Herzfunktion von Drosophila in vivo. Diese nichtinvasive Methode ermöglicht die quantitative Analyse kardialer Parameter während der Metamorphose.

Drosophila Vorbereitung und Longitudinal Imaging der Herzfunktion in vivo unter Verwendung optischer Kohärenzmikroskopie (OCM)

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