Optische Mapping von Aktionspotentialen und Calcium Transienten in der Maus Herz

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, das Transmembranpotential und das intrazelluläre Calciumtransient in intakten isolierten LOR-perfundierten Mausherzen gleichzeitig optisch zu kartieren. Dies wird erreicht, indem zuerst das intakte Mausherz herausgeschnitten, dann die Aorta kanüliert und mit der LOR-Perfusion begonnen wird. Der nächste Schritt besteht darin, das Herz zu immobilisieren, indem eine Erregungskontraktion auf den Koppler geladen und dann das Herz an die Perfusionskammer angeheftet wird.

Die letzten Schritte bestehen darin, die optischen Farbstoffe zu laden und Vorbereitungen zu treffen, um Bewegungsartefakte während des Experiments zu reduzieren. Optische Bilder werden erhalten, indem ich das vom Herzen emittierte Licht mit meinen Cam Ultima LC Moss-Kameras sammle. Hey, mein Name ist di.

Ich bin Doktorand an der Washington University. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z. B. Mikroelektroden, besteht darin, dass die optische Kartierung eine höhere räumliche Auflösung über die gesamte Oberfläche des Herzens ermöglicht. Hallo, ich bin Matt Sulkin.

Ich bin Doktorand an der Washington University. Diese Methode kann, wenn sie richtig durchgeführt wird, dazu beitragen, viele Fragen der kardialen Elektrophysiologie zu beantworten, wie z. B. die Grundlagen der Arrhythmogenese. Beginnen Sie mit der Konfiguration einer Schlauchpumpe, um die Lösungen mit 40 Millilitern pro Minute zu zirkulieren.

Stellen Sie dann eine zweite Schlauchpumpe auf 80 Milliliter pro Minute ein. Diese Pumpe führt die Perfuse Acht zurück in das Halte- und Sauerstoffreservoir. Schalten Sie die Pumpen ein und waschen Sie das System mit einem Liter, 70% Ethanol für 30 Minuten mit Umwälzung.

Folgen Sie dieser Wäsche mit zwei Litern entionisiertem Wasser ohne Umwälzung. Sobald das Wasser evakuiert ist, zirkulieren zwei Liter Tyro-Lösung und lassen Sie sie durch einen Fünf-Mikron-Filter leiten. Erwärmen Sie die Perfusion mit einem Wassermantel auf acht bis 37 Grad Celsius und blasen Sie sauerstoffreiches Gas in die Lösung.

Passen Sie die Geschwindigkeit der Gasblase an, um den pH-Wert bei 7,35 plus oder minus 0,05 zu halten. Überwachen Sie sowohl den pH-Wert als auch die Temperatur während des Experiments. Die duale optische Kartierungsvorrichtung besteht aus zwei Hochgeschwindigkeits-C-Mooskameras, die ein Bild von 100 x 100 Pixeln mit 3000 Bildern pro Sekunde aufnehmen können.

Befestigen Sie einen Bandpassfilter an der Calcium-Imaging-Kamera und befestigen Sie einen Langpassfilter an der Spannungsbildkamera an einer Dual-Kamerahalterung. Bringen Sie einen diic-Spiegel und eine Linse so an, dass das vom Herzen kommende Emissionslicht von der Linse auf den Spiegel fokussiert wird. Befestigen Sie außerdem zwei Kameras an der Halterung und ordnen Sie sie senkrecht zueinander an.

Richten Sie als Nächstes das Anregungslicht ein. Das Licht wird von einer Halogenlampe erzeugt und durch einen flexiblen Lichtleiter gelenkt. Lassen Sie das Licht durch einen Wärmefilter, einen Verschluss zur Begrenzung der Belichtung und einen Anregungsbandpassfilter leiten.

Bereiten Sie abschließend Silber- und Silberchloridelektroden vor, indem Sie sie in der Kammer installieren. Nach dem Überprüfen und Einstellen der Pegel an den Verstärkern und Filtern ist das Setup bereit für ein Herz. Verwenden Sie einen Cocktail aus Ketamin und Xylazin mit 100 Einheiten Heparin, um eine Maus zu betäuben, bevor Sie fortfahren.

Stellen Sie sicher, dass das Tier keinen Schmerzreflex hat, indem Sie die Zehen kneifen. Nachdem Sie einen mittleren Sternumschnitt gemacht haben, entfernen Sie schnell das Herz und das umgebende Gewebe. Identifizieren Sie dann mit dem Präpariermikroskop schnell die Aorta und machen Sie einen sauberen Schnitt durch die aufsteigende Aorta unterhalb der rechten Schlüsselbeinarterie.

Befestigen Sie nun einen kurzen Abschnitt der Aorta an einer maßgefertigten 21-Gauge-Kanüle mit vier oh schwarzen geflochtenen Seidennähten Nach der Kanülierung Retro stark perfu und super fusion das Herz. Mit der Tyro-Lösung können Sie die Durchflussrate so einstellen, dass der Aortendruck zwischen 60 und 80 Millimetern gehalten wird. Quecksilber, gemessen mit einem Druckmessumformer.

Präparieren und entfernen Sie nun das umliegende Lungen-, Thymus- und Fettgewebe. Führen Sie nun einen Silikonschlauch durch die Lungenvenen in die linke Herzkammer ein. Nähen Sie den Schlauch an das nahe gelegene Bindegewebe.

Dieser sehr wichtige Schritt verhindert eine Stauung und Übersäuerung der im linken Ventrikel eingeschlossenen Perfunde acht, insbesondere nach der Unterdrückung ventrikulärer Kontraktionen. Um durch Perfusion acht induzierte Herzbewegungen zu verhindern, stecken Sie das Herz an seiner Spitze an den Boden der mit einem Schwellerschutz bedeckten Perfusionskammer. Dehnen und fixieren Sie außerdem die rechten und linken Vorhofanhänge, um die Oberfläche der Vorhöfe in der aufrechten Konfiguration zu vergrößern.

Dadurch wird die Aufnahmeoberfläche maximiert. Um die Stimulation der Stimulation durchzuführen, befestigen Sie eine speziell angefertigte Elektrode an der Oberfläche des Herzens. Um Bewegungsartefakte zu reduzieren, befestigen Sie ein kleines Deckglas über dem Herz auf der Lösungsoberfläche.

Verkeilen Sie dazu das Glas zwischen mehreren Stiften. Als letzte Vorbereitungen fokussieren Sie das Anregungslicht auf das Herz und positionieren die Kameras, um ein optisches Bild zu erhalten, und beginnen dann mit dem Laden des Farbstoffs, während die Chips geladen werden. Kontinuierliche Überwachung von EKG-Aufzeichnungen, um die normale elektrische Funktion des Herzens sicherzustellen.

Beginnen Sie mit dem Erwärmen von BLEs-Statinen auf Raumtemperatur. Mischen Sie dann einen halben Milliliter BLEs-Statin in die üppige Acht im Fäkalienbehälter und verdünnen Sie den restlichen 10. Milliliter BLEs-Statin in einen Milliliter Tyros-Lösung. Injizieren Sie in den nächsten 20 Minuten langsam das BLEs-Statin in Tyros durch einen Wirkstoffanschluss in der Nähe der Kanüle.

Das BLEs-Statin reduziert das Bewegungsartefakt allmählich. Verdünnen Sie als nächstes 30 Mikroliter spannungsempfindlichen Farbstoff in eine Milliliter-Tyrolösung und injizieren Sie diese Mischung langsam über fünf bis sieben Minuten in denselben Wirkstoffport. Dann die gleiche Mischung noch einmal herstellen.

Diesmal werden zusätzliche 30 Mikroliter Kalziumindikator hinzugefügt. Tragen Sie diese Mischung langsam über fünf bis 10 Minuten durch denselben Port auf. Warten Sie nach der Injektion des Kalziumindikators weitere fünf bis 10 Minuten, bis das BLEs-Statin die Bewegung vollständig unterdrückt und die Farbstoffe in die Zellen eingedrungen sind, bevor Sie mit dem Experiment fortfahren.

Dieses Herzpräparat wurde hergestellt. Dem Protokoll zufolge wurden EKG-Signale während der ventrikulären Stimulation von S one S One S One aufgezeichnet. Aktionspotentiale und transiente Calciumsignale wurden aus den Vorhöfen links und den Ventrikeln rechts aufgezeichnet.

Der Pfeil zeigt, wo die Signalstreuung von den Ventrikeln aufgetreten ist, indem die Aufzeichnungen von der Kamera in Einheiten von drei x drei Pixeln unterteilt werden, kann ein Array von Kalziumtransienten und Aktionspotentialen aus den Daten aus den Array-Daten angezeigt werden. Es kann eine Abbildung konstruiert werden, die die Handlungspotentialleitung zeigt. Daten von drei aufeinanderfolgenden Punkten auf der Quer- und Längsachse zeigen die Amplitudenänderung mit der Ausbreitung des Aktionspotentials über eine ventrikuläre Fläche.

Ebenso kann eine Abbildung konstruiert werden, die das Aktionspotenzial und die transienten Calciumdauern zeigt. Dies zeigt eine Kontrollbedingung links auf rechts. Es wurde eine Injektion von Isoproterenol in das Herz verabreicht, wodurch die Dauer sowohl der Calciumtransienten als auch der Aktionspotentiale deutlich verkürzt wird.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei bis drei Stunden abgeschlossen werden. Nach diesem Verfahren kann sie abgeschlossen werden. Andere Methoden, wie z.B. das Pacing-Protokoll, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die zur Refraktärzeit des AV-Knotens.