Optische Mapping von Aktionspotentialen und Calcium Transienten in der Maus Herz
13. September 2011
Dieses Papier beschreibt die Präparation Verfahren, Instrumental-Setup, und experimentellen Bedingungen bei der optischen Abbildung von Transmembranpotential (Vm) und intrazellulären Calcium-Transienten (CAT) in intakten isolierten Langendorff perfundierten Maus Herzen.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, das transmembranäre Potential und die intrazelluläre Kalziumtransient gleichzeitig optisch in intakten, isolierten, LOR-perfudierten Mausherzen abzubilden. Dies wird erreicht, indem zunächst das intakte Mausherz entnommen, dann die Aorta kaniert und die LOR-Perfusion begonnen wird. Der nächste Schritt besteht darin, das Herz zu immobilisieren, indem ein Erregungs-Kontraktions-Koppler geladen und das Herz anschließend in der Perfusionskammer fixiert wird.
Die letzten Schritte bestehen darin, die optischen Farbstoffe aufzutragen und Vorbereitungen zu treffen, um Bewegungsartefakte während des Experiments zu minimieren. Optische Bilder werden gewonnen, indem das vom Herzen emittierte Licht mit den My-Cam-Ultima-LC-Moss-Kameras gesammelt wird. Hallo, mein Name ist Di.
Ich bin Doktorand an der Washington University. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie der Mikroelektrode, besteht darin, dass die optische Abbildung eine höhere räumliche Auflösung über die gesamte Oberfläche des Herzens ermöglicht. Hallo, ich bin Matt Sulkin.
Ich bin Doktorand an der Washington University. Diese Methode kann, wenn sie korrekt durchgeführt wird, dabei helfen, viele Fragen der kardialen Elektrophysiologie zu beantworten, beispielsweise die Grundlagen der Arrhythmogenese. Beginnen Sie damit, eine peristaltische Pumpe so einzurichten, dass sie die Lösungen mit 40 Milliliter pro Minute zirkulieren lässt.
Danach eine zweite peristaltische Pumpe auf 80 Milliliter pro Minute einstellen. Diese Pumpe leitet das Perfusat zurück in das Halte- und Sauerstoffreservoir. Die Pumpen einschalten und das System 30 Minuten lang mit einem Liter 70 %igem Ethanol bei Rückführung spülen.
Führen Sie diesen Schritt mit zwei Litern entionisiertem Wasser ohne Rezirkulation durch. Sobald das Wasser abgepumpt ist, leiten Sie zwei Liter Tyro-Lösung im Kreislauf und lassen sie durch einen Fünf-Mikrometer-Filter laufen. Erwärmen Sie das Perfusat mit einer Wasserjacke auf acht bis 37 Grad Celsius und bläsen Sie mit einem Zirkulator Sauerstoffgas in die Lösung.
Stellen Sie die Gasbläschenrate so ein, dass der pH-Wert bei 7,35 ± 0,05 gehalten wird. Überwachen Sie während des Experiments sowohl den pH-Wert als auch die Temperatur. Die duale optische Abbildungsvorrichtung besteht aus zwei Hochgeschwindigkeits-C-moss-Kameras, die ein Bild mit 100 mal 100 Pixeln mit 3000 Bildern pro Sekunde erfassen können.
Befestigen Sie einen Bandpassfilter an der Kalzium-Bildgebungskamera und einen Langpassfilter an der Spannungs-Bildgebungskamera an einem Doppelkamera-Halter. Befestigen Sie einen DIC-Spiegel und eine Linse, sodass das Emissionslicht, das vom Herzen kommt, durch die Linse auf den Spiegel fokussiert wird. Bringen Sie außerdem zwei Kameras am Halter an und richten Sie sie so an, dass sie senkrecht zueinander stehen.
Als Nächstes richten Sie das Anregungslicht ein. Das Licht wird von einer Halogenlampe erzeugt und über einen flexiblen Lichtleiter gelenkt. Leiten Sie das Licht durch einen Wärmefilter, einen Verschluss zur Begrenzung der Belichtung und einen Anregungs-Wellenlängen-Filter.
Bereiten Sie abschließend Silber- und Silberchloridelektroden vor, indem Sie diese in der Kammer installieren. Nach erneuter Überprüfung und Anpassung der Einstellungen an den Verstärkern und Filtern ist die Versuchsanordnung bereit für ein Herz. Verwenden Sie vor dem Fortfahren ein Gemisch aus Ketamin und Xylazin mit 100 Einheiten Heparin, um eine Maus zu anästhesieren.
Stellen Sie sicher, dass das Tier keinen Schmerzreflex auf eine Zehenquetschung zeigt. Nach einer medianen Sternotomie entfernen Sie schnell das Herz und das umgebende Gewebe. Identifizieren Sie dann mithilfe eines Präparationsmikroskops rasch die Aorta und führen Sie einen sauberen Schnitt durch die aufsteigende Aorta unterhalb der rechten Arteria subclavia durch.
Jetzt befestigen Sie einen kurzen Abschnitt der Aorta mit vier schwarzen chirurgischen Seidenfäden (4-0) an einer speziell angefertigten 21-Gauge-Kanüle. Nach der Kanülierung perfundieren und überströmen Sie das Herz retrograd mit Tyro-Lösung. Stellen Sie die Flussrate so ein, dass der aortale Druck zwischen 60 und 80 Millimeter Quecksilber beträgt, gemessen mit einem Druckmesswandler.
Nun dissezieren und entfernen Sie das umgebende Lungen-, Thymus- und Fettgewebe. Führen Sie nun einen Silikon-Schlauch durch die Lungenvenen in den linken Ventrikel ein. Nähen Sie den Schlauch an das benachbarte Bindegewebe an.
Dieser sehr wichtige Schritt verhindert eine Stauung und Ansäuerung des Perfusat acht, das in der linken Herzkammer eingeschlossen ist, insbesondere nach der Unterdrückung ventrikulärer Kontraktionen. Um hergspezifische Bewegungen durch Perfusat acht zu vermeiden, befestigen Sie das Herz an seiner Spitze mit einer Nadel am Boden der mit Sill Guard beschichteten Perfusionskammer. Zudem sollten die rechte und linke Ohrläppchen ausgedehnt und fixiert werden, um die Oberfläche der Vorhöfe in der aufrechten Konfiguration zu vergrößern.
Dadurch wird die Aufzeichnungsfläche maximiert. Um die Reizsetzungen durchzuführen, befestigen Sie eine selbstgefertigte Elektrode an der Oberfläche des Herzens. Um Bewegungsartefakte zu verringern, fixieren Sie ein kleines Deckglas über dem Herzen an der Lösungsoberfläche.
Stellen Sie dies sicher, indem Sie das Glas zwischen mehrere Stifte klemmen. Als letzte Vorbereitung richten Sie das Anregungslicht auf das Herz aus und positionieren die Kameras, um ein optisches Bild zu erhalten, bevor Sie mit dem Beladen mit Farbstoff beginnen, während Sie gleichzeitig die Formen beladen. Überwachen Sie kontinuierlich die EKG-Aufzeichnungen, um die normale elektrische Funktion des Herzens sicherzustellen.
Beginnen Sie damit, die BLEs-Statin auf Raumtemperatur aufzuwärmen. Anschließend mischen Sie ein halbes Milliliter BLEs-Statin in das reichliche Acht im Haltereservoir und verdünnen das verbleibende Zehntelmilliliter BLEs-Statin in ein Milliliter Tyros-Lösung. In den nächsten 20 Minuten injizieren Sie langsam die BLEs-Statin in Tyros über eine Medikamentenanschlussstelle in der Nähe der Kanüle.
Die BLEs-Statin wird den Bewegungsartefakt allmählich verringern. Verdünnen Sie anschließend 30 Mikroliter spannungsabhängiges Farbstoff in eine Milliliter Tyro-Lösung und injizieren Sie diese Mischung langsam über fünf bis sieben Minuten in denselben Medikamentenzufuhranschluss. Danach stellen Sie dieselbe Mischung erneut her.
Dieses Mal weitere 30 Mikroliter Kalziumindikator hinzufügen. Diese Mischung langsam über fünf bis 10 Minuten durch denselben Port applizieren. Nach der Injektion des Kalziumindikators weitere fünf bis 10 Minuten warten, bis der BLEs-Statin die Bewegung vollständig unterdrückt hat und die Farbstoffe in die Zellen eingedrungen sind, bevor das Experiment fortgesetzt wird.
Diese Herzpräparation wurde angefertigt. Gemäß dem Protokoll wurden EKG-Signale während der ventrikulären Stimulation von S1 bis S1 aufgezeichnet. Aktionspotentiale und Kalzium-Transienten-Signale wurden vom linken Vorhof und den rechten Ventrikeln aufgezeichnet.
Der Pfeil zeigt die Stelle, an der Signalstreuung aus den Ventrikeln auftrat. Durch Bündelung der Aufzeichnungen der Kamera in Einheiten von drei Pixeln mal drei Pixeln kann ein Array von Kalziumtransienten und Aktionspotentialen aus den Array-Daten dargestellt werden. Eine Abbildung der Leitung des Aktionspotentials kann erstellt werden. Daten aus drei aufeinanderfolgenden Punkten auf der transversalen und longitudinalen Achse zeigen die Amplitudenänderung während der Ausbreitung des Aktionspotentials über eine ventrikuläre Oberfläche.
Ebenso kann eine Abbildung, die die Dauer von Aktionspotentialen und Kalziumtransienten zeigt, erstellt werden. Auf der linken Seite ist eine Kontrollbedingung dargestellt, auf der rechten Seite. Dem Herz wurde eine Injektion von Isoproterenol verabreicht, wodurch die Dauer sowohl der Kalziumtransienten als auch der Aktionspotentiale deutlich verkürzt wird.
Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie innerhalb von zwei bis drei Stunden nach dieser Vorgehensweise abgeschlossen werden. Andere Methoden wie ein Reizfrequenz-Protokoll können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen zu beantworten, beispielsweise solche bezüglich der Refraktärzeit des AV-Knotens.
Übersicht
Diese Studie stellt ein detailliertes Verfahren für die optische Abbildung des transmembranen Potentials und der intrazellulären Kalziumtransienten in isolierten, langendorff-perfudierten Mausherzen vor. Die Methode verbessert im Vergleich zu herkömmlichen Techniken die räumliche Auflösung und liefert Erkenntnisse zur kardialen Elektrophysiologie.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Kardiale Elektrophysiologie
- Optische Abbildungstechniken
- Maus-Herzmodelle
Hintergrund
- Mit der optischen Kartierung können gleichzeitig das Membranpotenzial (Vm) und der Kalzium-Transiente (CaT) gemessen werden.
- Herkömmliche Methoden wie Mikroelektroden weisen Einschränkungen in der räumlichen Auflösung auf.
- Diese Technik kann zur Erforschung der Arrhythmogenese beitragen.
- Die Langendorff-Perfusion erhält die Lebensfähigkeit des Herzens für Experimente.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer zuverlässigen Methode für die optische Kartierung in Mausherzen.
- Verbesserung des Verständnisses der elektrischen Herzaktivität.
- Erleichterung der Forschung zu den Mechanismen von Arrhythmien.
Verwendete Methoden
- Ausschneiden und Kanülieren des Mausherzens zur Perfusion.
- Verwendung von Hochgeschwindigkeitskameras zur Aufnahme optischer Bilder.
- Laden von optischen Farbstoffen zur Visualisierung des transmembranären Potentials und von Kalzium-Transienten.
- Überwachung von pH-Wert und Temperatur während des Experiments.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche optische Abbildung von Vm und CaT im isolierten Herzen.
- Nachgewiesene Verringerung von Bewegungsartefakten durch Farbstoffapplikation.
- Effektive Aufzeichnung von Aktionspotentialen und Kalzium-Transienten-Signalen.
- Methode für zukünftige elektrophysiologische Studien validiert.
Schlussfolgerungen
- Die optische Kartierungstechnik bietet eine hohe räumliche Auflösung.
- Diese Methode kann die Forschung in der kardialen Elektrophysiologie voranbringen.
- Zukünftige Studien können diese Technik nutzen, um die Arrhythmogenese zu erforschen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die optische Abbildung des transmembranen Potentials und der Kalziumtransienten in Mausherzen liefert hochauflösende räumliche und zeitliche Daten, die für die mechanistische Entschärfung von Risiken bei der Validierung kardiovaskulärer Zielstrukturen entscheidend sind. Dieser Ansatz ermöglicht eine quantitative Beurteilung elektrophysiologischer Phänotypen und stützt die Vorhersagekraft präklinischer Modelle für Arrhythmien und Herzinsuffizienz. Durch die gleichzeitige Erfassung der Dynamik von Vm und CaT verbindet die Methode die Entdeckungsbiologie mit der translationalen Abstimmung von Biomarkern in krankheitsrelevanten Systemen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch die Abbildung von Aktionspotential- und Kalziumtransienten-Dynamiken im Herzgewebe.
- Operativer Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung durch gleichzeitige Visualisierung der Parameter der Erregungs-Kontraktions-Kopplung.
- Predictiver Wert: Steigert die Zielgenauigkeit, indem molekulare Störungen mit funktionellen elektrophysiologischen Ausgangsgrößen verknüpft werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Bereitet validierte biologische Systeme für die nachgeschaltete Verbindungsevaluierung mittels standardisierter optischer Signalakquisition vor.
- Quantitative Ausgaben: Erzeugt reproduzierbare Messungen der Aktionspotentiale-Dauer, Leitungsgeschwindigkeit und Kalziumtransienten-Amplitude.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht die Wiederverwendung der Plattform über mehrere kardiale Krankheitsmodelle hinweg durch konsistente Langendorff-Perfusions- und Farbstofflade-Protokolle.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Anwendbar auf Studien zu Herzinsuffizienz, Arrhythmien und Stoffwechselerkrankungen unter Verwendung genetisch modifizierter Mausmodelle.
- Translationskontinuität: Verbindet mechanistische Erkenntnisse aus der Entdeckungsphase mit der präklinischen Validierung durch erhaltene Gewebearchitektur und physiologische Perfusion.
- Risikoadjustierte Entscheidungen: Unterstützt die Festlegung von Weiterentwicklungskriterien, indem elektrophysiologische Risiken früh im Entdeckungsprozess quantifiziert werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der Testung der Zielhypothese über die Identifizierung von Leitstrukturen bis hin zur Beurteilung der präklinischen Wirksamkeit und ermöglicht eine iterative Verbesserung kardiovaskulärer Kandidaten basierend auf funktionellen elektrophysiologischen Messwerten.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Aufklärung von Signalwegen und die mechanistische Risikominderung, indem genetische oder pharmakologische Interventionen mit räumlichen elektrophysiologischen Mustern korreliert werden.
- Screening: Bietet Standardisierung von Assays und quantitative Ausgaben, die für ein zuverlässiges Substanz-Screening bei der Entdeckung von Ionenkanälen und Modulatoren unerlässlich sind.
- Analytik: Ermöglicht raumzeitliche Messungen von Vm und CaT, die einen vergleichenden Analysenansatz über experimentelle Bedingungen und Genotypen hinweg ermöglichen.
- Translationale Forschung: Bewahrt die physiologische Relevanz durch Langendorff-Perfusion und unterstützt die Übertragung auf Reaktionen intakter Organe.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare elektrophysiologische Phänotypisierungskapazität, die in mehreren kardiovaskulären Projekten und Zielstrukturen eingesetzt werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem mechanistische Unklarheiten in der kardialen Elektrophysiologie verringert werden.
- Operationaler Wert: Gewährleistet Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch definierte Perfusions-, Farbstofflade- und Bildgebungsparameter.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch, indem elektrophysiologische Risiken vor erheblichen Investitionen identifiziert werden.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von Kandidaten basierend auf quantitativen Aktionspotential- und Kalziumtransient-Profilen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der kardialen Dissektion, der Langendorff-Perfusion und den optischen Abbildungssystemen.
- Benötigt Hochgeschwindigkeits-CMOS-Kameras, Anregungslichtquellen und optische Filteranordnungen für die Zweikanaldetektion.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams hinsichtlich der Farbstoffanwendung und Strategien zur Reduktion von Bewegungsartefakten.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen bei der Übertragung auf verschiedene Mausstämme oder Krankheitsmodelle mit veränderter Herzphysiologie.
- Umfasst praktische Einschränkungen wie die Toxizität des Farbstoffs, Photobleichen und die Notwendigkeit einer sorgfältigen Unterdrückung von Bewegungen, um die Datenqualität aufrechtzuerhalten.
