Name: Produktion, Kristallisation und Strukturbestimmung C. difficile PPEP-1 über Microseeding und Zink-SAD (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 34 s
Description: Erfahren Sie die Kristallisation von rekombinantem PPEP-1 aus Clostridium difficile mittels Microseeding. Diese Methode liefert hochwertige Einkristalle für Röntgenbeugung und strukturbiologische Analysen.

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Wir danken dem Personal an der beamline X06DA an der Synchrotron Lichtquelle Schweiz, Paul-Scherrer-Institut, Villigen, Schweiz, für Unterstützung bei der Synchrotron-Datenerfassung. Wir sind für einen ausgezeichneten technischen Support zu Monika Gompert dankbar. Das Projekt wurde von der Universität zu Köln unterstützt und gewähren INST 216 / 682-1 fugg von der Deutschen Forschungsgemeinschaft. Ein Promotionsstipendium von der International Graduate School in Entwicklung Gesundheit und Krankheit zu CP quittiert. Die Forschung zu diesen Ergebnissen geführt haben, wurden von der Europäischen Gemeinschaft Siebten Rahmenprogramm (FP7 / 2007-2013) im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung Nr 283570 (BioStruct-X) erhalten.

<ol><li>Bouza, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consequences+of+Clostridium+difficile+infection%3A+understanding+the+healthcare+burden%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Consequences of Clostridium difficile infection: understanding the healthcare burden.</a> Clin Microbiol Infect. 18 (Suppl 6), 5-12 (2012).</li>
<li>O'Connor, J. R., Johnson, S., Gerding, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile+infection+caused+by+the+epidemic+BI%2FNAP1%2F027+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile infection caused by the epidemic BI/NAP1/027 strain.</a> Gastroenterology. 136 (6), 1913-1924 (2009).</li>
<li>Mitchell, B. G., Gardner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mortality+and+Clostridium+difficile+infection%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Resist+Infect+Control%22%5BJournal%5D)">Mortality and Clostridium difficile infection: a review.</a> Antimicrob Resist Infect Control. 1 (1), (2012).</li>
<li>George, W. L., Sutter, V. L., Finegold, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+agent-induced+diarrhea--a+bacterial+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial agent-induced diarrhea--a bacterial disease.</a> J Infect Dis. 136 (6), 822-828 (1977).</li>
<li>George, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Clostridium+difficile+as+a+cause+of+pseudomembranous+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Br+Med+J%22%5BJournal%5D)">Identification of Clostridium difficile as a cause of pseudomembranous colitis.</a> Br Med J. 1 (6114), 695(1978).</li>
<li>Bartlett, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Narrative+review%3A+the+new+epidemic+of+Clostridium+difficile-associated+enteric+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">Narrative review: the new epidemic of Clostridium difficile-associated enteric disease.</a> Ann Intern Med. 145 (10), 758-764 (2006).</li>
<li>Kelly, C. P., LaMont, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile--more+difficult+than+ever%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile--more difficult than ever.</a> N Engl J Med. 359 (18), 1932-1940 (2008).</li>
<li>Ünal, C. M., Steinert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+therapeutic+strategies+for+Clostridium+difficile+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Ther+Targets%22%5BJournal%5D)">Novel therapeutic strategies for Clostridium difficile infections.</a> Expert Opin Ther Targets. 20 (3), 269-285 (2016).</li>
<li>Kelly, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Monoclonal+Antibody%2C+Bezlotoxumab+Targeting+C.+difficile+Toxin+B+Shows+Efficacy+in+Preventing+Recurrent+C.+difficile+Infection+%28CDI%29+in+Patients+at+High+Risk+of+Recurrence+or+of+CDI-Related+Adverse+Outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">The Monoclonal Antibody, Bezlotoxumab Targeting C. difficile Toxin B Shows Efficacy in Preventing Recurrent C. difficile Infection (CDI) in Patients at High Risk of Recurrence or of CDI-Related Adverse Outcomes.</a> Gastroenterology. 150 (4), S122(2016).</li>
<li>Tsutsumi, L. S., Owusu, Y. B., Hurdle, J. G., Sun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+the+discovery+of+treatments+for+C.+difficile+infection%3A+A+clinical+and+medicinal+chemistry+review%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Progress in the discovery of treatments for C. difficile infection: A clinical and medicinal chemistry review.</a> Curr Top Med Chem. 14 (1), 152-175 (2014).</li>
<li>Hensbergen, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile+secreted+Pro-Pro+endopeptidase+PPEP-1+%28ZMP1%2FCD2830%29+modulates+adhesion+through+cleavage+of+the+collagen+binding+protein+CD2831%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile secreted Pro-Pro endopeptidase PPEP-1 (ZMP1/CD2830) modulates adhesion through cleavage of the collagen binding protein CD2831.</a> FEBS Lett. 589 (24), 3952-3958 (2015).</li>
<li>Cafardi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+zinc+metalloprotease+through+a+global+analysis+of+Clostridium+difficile+extracellular+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel zinc metalloprotease through a global analysis of Clostridium difficile extracellular proteins.</a> PLoS One. 8 (11), e81306(2013).</li>
<li>Hensbergen, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+secreted+metalloprotease+%28CD2830%29+from+Clostridium+difficile+cleaves+specific+proline+sequences+in+LPXTG+cell+surface+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A novel secreted metalloprotease (CD2830) from Clostridium difficile cleaves specific proline sequences in LPXTG cell surface proteins.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (5), 1231-1244 (2014).</li>
<li>Schacherl, M., Pichlo, C., Neundorf, I., Baumann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Basis+of+Proline-Proline+Peptide+Bond+Specificity+of+the+Metalloprotease+Zmp1+Implicated+in+Motility+of+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural Basis of Proline-Proline Peptide Bond Specificity of the Metalloprotease Zmp1 Implicated in Motility of Clostridium difficile.</a> Structure. 23 (9), 1632-1642 (2015).</li>
<li>Rawlings, N. D., Waller, M., Barrett, A. J., Bateman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEROPS%3A+the+database+of+proteolytic+enzymes%2C+their+substrates+and+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">MEROPS: the database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors.</a> Nucleic Acids Res. 42 (Release 10.0), D503-D509 (2014).</li>
<li>Bergfors, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeds+to+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Seeds to crystals.</a> J Struct Biol. 142 (1), 66-76 (2003).</li>
<li>Dauter, Z., Dauter, M., Dodson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jolly+SAD%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Jolly SAD.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 58 (Pt 3), 494-506 (2002).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XDS%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">XDS.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 2), 125-132 (2010).</li>
<li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PHENIX%3A+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66, 213-221 (2010).</li>
<li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+development+of+Coot%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+PyMOL+Molecular+Graphics+System%22">The PyMOL Molecular Graphics System</a>. , Schrödinger, LLC. (2002).</li>
<li>Pettersen, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UCSF+Chimera--a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comput+Chem%22%5BJournal%5D)">UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis.</a> J Comput Chem. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li>
<li>Wang, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+phase+ambiguity+in+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Resolution of phase ambiguity in macromolecular crystallography.</a> Methods Enzymol. 115, 90-112 (1985).</li>
<li>McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phaser+crystallographic+software%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Phaser crystallographic software.</a> J Appl Crystallogr. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).</li>
<li>Zwart, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+structure+solution+with+the+PHENIX+suite%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Automated structure solution with the PHENIX suite.</a> Methods Mol Biol. 426, 419-435 (2008).</li>
<li>Zheng, H., Handing, K. B., Zimmerman, M. D., Shabalin, I. G., Almo, S. C., Minor, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+crystallography+over+the+past+decade+for+novel+drug+discovery+-+where+are+we+heading+next%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">X-ray crystallography over the past decade for novel drug discovery - where are we heading next?</a> Expert Opin Drug Discov. 10 (9), 975-989 (2015).</li>
<li>Rubino, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+characterization+of+zinc-bound+Zmp1%2C+a+zinc-dependent+metalloprotease+secreted+by+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Inorg+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural characterization of zinc-bound Zmp1, a zinc-dependent metalloprotease secreted by Clostridium difficile.</a> J Biol Inorg Chem. 21 (2), 185-196 (2016).</li>
<li>Carson, M., Johnson, D. H., McDonald, H., Brouillette, C., Delucas, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((His-tag+impact+on+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">His-tag impact on structure.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 63 (Pt 3), 295-301 (2007).</li>
<li>Gasteiger, E., et al. Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGasteiger%2C+E+%22The+Proteomics+Protocols+Handbook%22">The Proteomics Protocols Handbook</a>. Walker, J. M. , Humana Press. 571-607 (2005).</li>
<li>Dummler, A., Lawrence, A. M., de Marco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+screening+for+the+detection+of+soluble+fusion+constructs+expressed+in+E.+coli+using+a+modular+set+of+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Simplified screening for the detection of soluble fusion constructs expressed in E. coli using a modular set of vectors.</a> Microb Cell Fact. 4, 34(2005).</li>
<li>Stura, E. A., Wilson, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+the+streak+seeding+technique+in+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Crys+Growth%22%5BJournal%5D)">Applications of the streak seeding technique in protein crystallization.</a> J Crys Growth. 110 (1), 270-282 (1991).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Röntgenkristallographie ist immer noch die schnellste und genaueste Methode zur Bestimmung dreidimensionaler nahe Strukturen mit atomarer Auflösung von Proteinen 28. Es erfordert jedoch das Wachstum von gut geordneten Einkristallen. Diese sind oft schwer zu bekommen und der kristalline Zustand ist künstlich. Ein Vergleich der Proteinstrukturen durch Röntgenkristallographie mit den durch andere Verfahren bestimmt jedoch, insbesondere NMR, zeigt im Allgemeinen eine sehr gute Übereinstimmung. Im Falle von PPEP-1...

Clostridium difficile ist eine der Hauptursachen für nosokomiale Antibiotika-assoziierter Diarrhoe Infektionen 1. Diese grampositive anaerobe Bakterium wird durch seine Sporenform über die fäkal-oral übertragen. In den letzten zehn Jahren neue &#39;&#39; Epidemie &#39;&#39; oder &#39;&#39; hyper &#39;&#39; Stämme (zB BI / NAP1 / 027) führte zu einer drastischen Zunahme der Neuinfektionen und Todesraten in Nordamerika und Europa 2. C. difficile - assoziierten Erkrankungen (CDAD) ist eine lebensbedrohliche Kolon Entzündung mit einer hohen Sterblichkeitsrate 3. Die Symptome reichen von Durchfall 4 bis Pseudomembrankolik 5 und der oft tödlich verlauf toxisches Megakolon 6. Die Behandlung von CDAD ist schwierig , da die virulente Stämme multiresistente und die Rate Wiederholung sind hoch 7. Im Moment Therapie umfasst die Antibiotika Metronidazol, Fidaxomicin oder Vancomycin oder in repetitively rezidivierende Fälle fäkale Mikrobiota Transplantation. Neue therapeutische Strategien sind dringend 8 benötigt. Einige Fortschritte als therapeutische monoklonale Antikörper Bezlotoxumab aufgezeichnet zielt, C. difficile Toxin B 9, wurde vor kurzem erfolgreich Phase III der klinischen Studien bestanden und wurde für die Zulassung bei der FDA und EMA eingereicht. Zusätzlich neue Antibiotika in verschiedenen Stadien der klinischen Versuche im Augenblick geprüft 10 werden. Zur Entwicklung wirksame Behandlung neue therapeutische Targets identifiziert werden müssen. Die vor kurzem entdeckte C. difficile - Protease - Prolin-Prolin - Endopeptidase-1 (PPEP-1; CD2830 / Zmp1; EC 3.4.24.89) ist so ein vielversprechendes Ziel, wie der Mangel an PPEP-1 in einem Knock-out - Stamm nimmt die Virulenz von C . difficile in vivo 11. PPEP-1 ist ein sekretiertes Metalloprotease 12,13 Abspalten zwei C. difficile Adhäsine an ihrem C-Terminus 13 somit die Freigabe der anhaftenden bacteria aus dem menschlichen Darmepithel. Daher ist es bei der Aufrechterhaltung des Gleichgewichts zwischen dem sessile und motile Phänotyps von C. difficile beteiligt. Zur Entwicklung selektiver Inhibitoren gegen PPEP-1 und zu verstehen, wie sie ihre Substrate intime Kenntnis der dreidimensionalen Struktur erkennt ist unverzichtbar. Wir haben die erste Kristallstruktur PPEP-1 allein und im Komplex mit einem Peptid - Substrat 14 gelöst. PPEP-1 ist der erste bekannte Protease spaltet Peptidbindungen zwischen zwei Prolinreste 15 selektiv. Es bindet das Substrat in einem zwei geknickte Weise und stabilisiert sie über einen längeren aliphatisch-aromatischen Netzwerk von Resten in der S-Schleife angeordnet, die die Protease - aktiven Stelle 14 erstreckt. Dieses Substrat-Bindungsmodus ist einzigartig für PPEP-1 und nicht in der menschlichen Proteasen bisher gefunden. Dies macht es ein vielversprechendes Medikament Ziel, und Off-Target-Effekte von Inhibitoren sehr unwahrscheinlich. Zur Entwicklung und Bildschirm selektive PPEP-1-INHibitors in der Zukunft eine große Menge an reinem und monodisperse PPEP-1-Protein benötigt. Weiterhin ist die Art der Bindung der ersten Inhibitoren, Co-Kristallstrukturen mit PPEP-1 zu bestimmen, wird bestimmt werden müssen. In unseren Händen PPEP-1 produziert ständig verwachsene Kristalle. So haben wir ein Optimierungsverfahren zur Herstellung von einzelnen Beugungs Qualität Kristalle von PPEP-1 entwickelt. In diesem Protokoll beschreiben wir ausführlich in der Produktion, Reinigung, Kristallisation und Strukturlösung von PPEP-1 14. Wir verwenden die intrazelluläre Expression in Escherichia coli einer PPEP-1 - Variante die Sekretions - Signalsequenz, Affinitätschromatographie und Grßenausschlußchromatographie unter Entfernung des Reinigungsmarkierung fehlt, gefolgt von 16 microseeding in einem Optimierungs Bildschirm und Strukturbestimmung mittels Zink Einwellenlängen-anomale Dispersion (Zink-SAD) 17. Dieses Protokoll kann für die Produktion und die Strukturbestimmung von anderen Proteinen (zB angepasst werden &lt;/ Em&gt; Metalloproteasen), insbesondere für Proteine ​​verwachsene Kristalle zu erzeugen. Auf Wunsch Plasmid-DNA des Konstruktes (pET28a-NHis-rPPEP-1) und Beugungsdaten können für Bildungszwecke zur Verfügung gestellt werden.

<table><tbody><tr><td>Gene / Vektoren / Zellstämme</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pET28a-Vektor</td><td>Merck-Millipore</td><td>69864</td><td>Thrombin spaltbarer N-terminaler His-Tag</td></tr><tr><td>E. coli Stamm BL21 (DE3) Star</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C601003</td><td>RNase H-defizientes</td></tr><tr><td>Codon-optimiertes Gen (für E. coli) von PPEP-1 (CD630_28300)</td><td>Geneart (Thermo Fisher Scientific)</td><td>benutzerdefinierte</td><td>Aminosäuren 27-220</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Comments</td></tr><tr><td><>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>beliebig</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antifoam B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5757</td><td>wässrige Silikonemulsion</td></tr><tr><td>Agar</td><td>jedes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>jedes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>AppliChem</td><td>A1008</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>AppliChem</td><td>A1087</td><td>Puffer</td></tr><tr><td>Qualität NaCl</td><td>jedes</td><td></td><td>Puffer</td></tr><tr><td>Grade DNaseI</td><td>AppliChem</td><td>A3778</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>AppliChem</td><td>A1073</td><td></td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4648</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumphosphat zweibasisch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>215996</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin 100%</td><td>jede</td><td></td><td>reinste Qualität</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>Flüssigkeit Stickstoff</td><td>alle</td><td></td><td>zur Lagerung und Kryokühlung von Kristallen</td></tr><tr><td>Name</td><td><>Unternehmen</td><td>Katalognummer<</td><td>strong>Kommentare</td></tr><tr><td><>Ausrüstung (allgemein)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schüttel-Inkubator</td><td>beliebig</td><td></td><td>mit Temperaturen von 20 &deg; C - 37 &Grad; C</td></tr><tr><td>Glaswaren</td><td>alle</td><td></td><td>Erlenmeyerkolben mit Prallwänden (50 ml - 2,8 L)</td></tr><tr><td>Zentrifuge für große Kulturvolumina</td>, <td>jede</td><td></td><td>Zentrifuge für Verarbeitungsvolumina bis zu 12 L</td></tr><tr><td>Ultraschallgerät Vibra-Cell VCX500</td><td>Sonics</td><td>SO-VCX500</td><td>oder jedes andere Ultraschallgerät / Zelldisruptor</td></tr><tr><td>Ultrazentrifuge</td><td>jede</td><td></td><td>Zentrifuge mit Geschwindigkeiten bis zu 150.000 x g</td></tr><tr><td>NiNTA Superflow-Harz</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Empty Glass Econo-Column</td><td>Bio-Rad</td><td>7371007</td><td>oder jede andere leere Glas- oder Kunststoffsäule</td></tr><tr><td>Größenausschluss Chromatographiesäule HiLoad Superdex 200 16/600</td><td>GE Healthcare</td><td>28989335</td><td></td></tr><tr><td>Chromatographiesystem & Auml; kta Purifier,</td><td>GE Healthcare</td><td>28406264</td><td>oder jedes andere Chromatographiesystem</td></tr>, <tr><td>Dialyseschläuche, Spectra/Por, 3</td>, <td>Spectrum Labs</td>, <td>132724</td><td></td></tr><tr><td>Dialyseschlauchverschlüsse,</td><td>Spectrum Labs</td><td>132738</td><td></td></tr><tr><td>Ultrafiltrationseinheiten (Konzentratoren), 10.000 NWCO,</td><td>jedes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis-Spektralphotometer</td>, <td>beliebige</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td><>Unternehmen</strong</td><td>>Katalognummer<</td><td>>Kommentare</td></tr><tr><td>Ausrüstung (Kristallographie)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette mit geringem Volumen 0,1-10 & Mikro; l</td><td>beliebige</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Verdrängerpipette Microman M10</td><td>Gilson</td><td>F148501</td><td></td></tr><tr><td>Kristallisationsroboter</td><td>beliebige</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Kristallisationsplatten TTP IQ mit drei Protein-Wells</td><td>TTP</td><td>4150-05810</td><td>oder jede andere 96-Well-Kristallisationsplatte&nbsp;</td></tr><tr><td>24-Well-CombiClover Junior Plate</td><td>Jena Bioscience</td><td>EB-CJR</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Clear Sealing Tape</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-511</td><td></td></tr><tr><td>Abdeckfolien aus silikonisiertem Glas</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-225</td><td></td></tr><tr><td>Kommerzielle Kristallisationssiebe: SaltRx, Index, PEG/Ion, Crystal</td><td>Hampton Research</td><td>diverse</td><td></td></tr><tr><td>Kommerzielle Kristallisationssiebe: Wizard, PACT++, JCSG++Jena</td> <td>Bioscience</td><td>diverse</td><td></td></tr><tr><td>JBS Beads-for-Seeds</td><td>Jena Bioscience</td><td>CO-501</td><td></td></tr><tr><td>CrystalCap SPINE HT (Nylonschlaufen)</td><td>Hampton Research</td><td>diverse</td><td>Schlaufengrößen 0,025 mm - 0,5 mm</td></tr><tr><td>CrystalCap Vial</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-904</td><td></td></tr><tr><td>Kryo-Schaum Dewar 800 ml</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-673</td><td></td></tr><tr><td>Cryogenic Foam Dewar 2 L</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-675</td><td></td></tr><tr><td>Fläschchenklemme, gerade</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-670</td><td></td></tr><tr><td>CrystalWand Magnetisch, gerade</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-729</td><td></td></tr><tr><td>CryoCane 6 Fläschchenhalter</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-711</td><td></td></tr><tr><td>CryoSleeve</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-708</td><td></td></tr><tr><td>CryoCane Farbcodierer - Weiß</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-713</td><td></td></tr><tr><td>Skalpell</td><td>beliebig</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gerade Mikrozange</td><td>beliebig</td><td></td><td>zur Manipulation von Dichtungsband. etc.</td></tr><tr><td>Akupunkturnadel</td><td>beliebig</td><td></td><td>z.B. aus der Apotheke</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>beliebig</td><td></td><td>zur Inspektion von Kristallisationsplatten und Kristalleinfassung, Vergrößerung bis zu 160X</td></tr></tbody></table>

produktion, kristallisation und strukturbestimmung<em&gt; c. difficile</em&gt; ppep-1 über microseeding und zink-sad

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Neue Therapien werden benötigt, um Clostridium difficile-Infektionen zu behandeln, die eine große Bedrohung für die menschliche Gesundheit darstellen. Die C. difficile Metalloprotease PPEP-1 ist ein Ziel für die zukünftige Entwicklung von Inhibitoren, um die Virulenz des Erregers zu verringern. Für die biophysikalische und strukturelle Charakterisierung sowie das Inhibitor-Screening werden große Mengen an reinem und aktivem Protein benötigt. Wir haben ein Protokoll für die effiziente Produktion und Reinigung von PPEP-1 unter Verwendung von E. coli als Expressionswirt entwickelt, das ausreichende Mengen und Reinheit des Proteins für die Kristallisation und Strukturbestimmung liefert. Darüber hinaus können durch Microseeding stark verwachsene Kristalle von PPEP-1 zu wohlgeordneten Kristallen gezüchtet werden, die für die Röntgenbeugungsanalyse geeignet sind. Die Methoden könnten auch zur Herstellung anderer rekombinanter Proteine und zur Untersuchung der Strukturen anderer Proteine verwendet werden, die verwachsene Kristalle erzeugen.

rPPEP-1 wird in verschiedene E. coli - Stämmen überexprimiert, mit der höchsten Ausbeute in E. coli BL21 (DE3) Star (Abbildung 1C). Nach dem ersten Chromatographieschritt NiNTA Affinität der 6xHis-Tag erfolgreich von den meisten werden können des Proteins und in dem zweiten Schritt NiNTA unverdaute Protein vollständig von Thrombin-verdautem Protein (1D) abgespalten getrennt werden können. Auf einer S200 - Säule 16/600 unmarkierte rPPEP-...

Prolin-Prolin-Endopeptidase-1 (PPEP-1) ist eine sezernierte Metalloprotease und ein vielversprechendes Wirkstoffziel aus dem humanpathogenen Clostridium difficile. Hier beschreiben wir alle Methoden, die für die Herstellung und Strukturbestimmung dieses Proteins notwendig sind.

Produktion, Kristallisation und Strukturbestimmung<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 über Microseeding und Zink-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Kristalle in Einzelgitterbeugungsqualität effizient aus rekombinantem Prolin-Prolin-Endopeptidase-1 oder rPPEP-1-Protein zu züchten. Ohne diese Methode erzeugt rPPEP-1 sofort stark verwachsene Kristalle, die für die Röntgenbeugungsanalyse nicht geeignet sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass eine große Anzahl von gut geordneten und gut beugenden Kristallen für die Strukturbestimmung von rPPEP-1 in kurzer Zeit und mit begrenztem Materialeinsatz hergestellt werden kann.Dieses Verfahren bedient sich der Microcity-Methode und kann für jede erfolgreiche Erstkristallisationsbedingung von rPPEP-1 sowie dessen Substratpeptidkomplexen angepasst werden. Diese Methode kann angepasst werden, um gut geordnete Kristalle von praktisch jedem Protein herzustellen, das verwachsene Kristalle ergibt. Es kann auch in Cross-Seeding-Experimenten, Proteinvarianz oder in Kokristallisationsexperimenten mit kleinen Molekülen verwendet werden.Die visuelle Demonstration der Handhabung von Kristallisationsmethoden ist von entscheidender Bedeutung, da bereits kleine Abweichungen einen erheblichen Einfluss auf die Beugungsqualität der Kristalle h

production-crystallization-structure-determination-c-difficile-ppep-1

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Hierin ist das Verfahren in der Caffrey Membrane Strukturelle und funktionelle Biology Group manuell einrichten Kristallisation Studien von Membranproteinen in lipidic Mesophasen implementiert beschrieben.

Crystallizing Membranproteinen zur Strukturaufklärung mittels Lipidische Mesophasen

Structure-based drug design spielt eine wichtige Rolle in der Medikamentenentwicklung. Verfolgen mehrere Ziele parallel erhöht die Chance auf Erfolg für Blei Entdeckung. Der folgende Artikel zeigt, wie die Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease eine Multi-Target-Ansatz für die Gen-to-Bestimmung der Struktur des Influenza-A-Untereinheit PB2 nutzt.

Multi-Target-Parallel Processing Ansatz zur Gene-to-Struktur Bestimmung der Influenza Polymerase PB2-Untereinheit

Quelle: Figueroa, D. M., et.al. Herstellung und Visualisierung von bakteriellen Sphäroplasten und Protoplasten zur Charakterisierung der antimikrobiellen Peptidlokalisierung. J. Vis. Exp. (2018)Dieses Video zeigt die Produktion von Escherichia coli Sphäroplasten, indem zunächst die Zellteilung gehemmt wird, um die Filamentation zu induzieren, gefolgt von einem enzymatischen Verdau der Zellwand. Der Prozess umfasst die kontrollierte Zugabe eines Chelatbildners, DNase, und eines osmotischen...

Aufbereitung von E. coli Sphäroplasten

Biophysikalische und biochemische Untersuchungen der Wechselwirkungen zwischen den membranständigen eingebettet Proteindomänen stehen viele technische Herausforderungen, von denen der erste Abschluß einer entsprechenden Studie Material ist. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Herstellung und Reinigung Disulfid-stabilisierten Transmembran-Peptid-Komplexe, die geeignet für die Strukturanalyse durch Lösungspolymerisation Kernspinresonanz (NMR) und andere analytische Anwendungen sind.

Produktion von Disulfid-stabilisierte Transmembrane Peptid-Komplexe für Structural Studies

β-barrel outer membrane proteins (OMPs) erfüllen viele Funktionen innerhalb der äußeren Membranen von gramnegativen Bakterien, Mitochondrien und Chloroplasten. Hier hoffen wir, einen bekannten Engpass in Strukturstudien zu entschärfen, indem wir Protokolle für die Herstellung von β-Zylinder-OMPs in ausreichender Menge für die Strukturbestimmung mittels Röntgenkristallographie oder NMR-Spektroskopie vorstellen.

Von Konstrukten Crystals - Auf dem Weg zu Strukturbestimmung von β-Fass-Außenmembranproteine

Eine optimierte Protokoll für die Durchführung einer umfangreichen biochemischen und strukturelle Charakterisierung von ein Kohlenhydrat-Substrat-Bindeprotein von Streptococcus Pneumoniae wird vorgestellt.

Biochemische und strukturelle Charakterisierung von Kohlenhydrat Transport Substrat-Bindeprotein SP0092

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um Gramnegative Escherichia coli (E. Coli) produzieren Spheroplasts und gram-positiven Bacillus Megatherium (B. Megatherium) Protoplasten deutlich sichtbar zu machen und schnell charakterisieren Peptid-Bakterien Interaktionen. Dies bietet eine systematische Methode zur Membran Lokalisierung und translocating Peptide zu definieren.

Produktion und Visualisierung von bakteriellen Spheroplasts und Protoplasten antimikrobielle Peptide Lokalisierung zu charakterisieren

Wir beschreiben Protokolle zur Strukturbestimmung der IKK-bindungsdomäne von NEMO durch Röntgenkristallographie. Die Methoden umfassen Proteinexpression, Reinigung und Charakterisierung sowie Strategien zur erfolgreichen Kristalloptimierung und Strukturbestimmung des Proteins in seiner ungebundenen Form.

Produktion, Kristallisation und Strukturbestimmung der IKK-bindungsdomäne von NEMO

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um den Dimer-Dodecamer-Übergang von TmPep1050, einer M42-Aminopeptidase, auf struktureller Ebene zu untersuchen. Es ist eine einfache Pipeline, die von der Proteinreinigung bis zur Röntgendatenverarbeitung reicht. Crystallogenese, Datensatzindexierung und molekularer Ersatz wurden durch einen Studienfall, TmPep1050H60A H307A Variante, betont.

Röntgenkristallographie zur Untersuchung des oligomeren Zustandsübergangs der Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

Es wird ein vielseitiges mikrofluidisches Gerät beschrieben, das die Kristallisation eines Enzyms mittels der Gegendiffusionsmethode, das Einbringen eines Substrats in die Kristalle durch Einweichen und die 3D-Strukturbestimmung des Enzyms:Substrat-Komplex durch eine serielle Analyse von Kristallen im Inneren des Chips bei Raumtemperatur ermöglicht.

Kristallisation und strukturelle Bestimmung eines Enzyms: Substratkomplex durch serielle Kristallisation in einem vielseitigen mikrofluidischen Chip

Die Strukturbestimmung makromolekularer Komplexe mittels KryoEM ist für bestimmte Klassen von Proteinen und Komplexen zur Routine geworden. Hier wird diese Pipeline zusammengefasst (Probenvorbereitung, Screening, Datenerfassung und -verarbeitung) und die Leser werden auf weitere detaillierte Ressourcen und Variablen geleitet, die bei anspruchsvolleren Proben geändert werden können.

Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopie: Von der Probe zur Struktur

Erfahren Sie die Kristallisation von rekombinantem PPEP-1 aus Clostridium difficile mittels Microseeding. Diese Methode liefert hochwertige Einkristalle für Röntgenbeugung und strukturbiologische Analysen.

Produktion, Kristallisation und Strukturbestimmung

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