Produktion, Kristallisation und Strukturbestimmung C. difficile PPEP-1 über Microseeding und Zink-SAD

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Kristalle in Einzelgitterbeugungsqualität effizient aus rekombinantem Prolin-Prolin-Endopeptidase-1 oder rPPEP-1-Protein zu züchten. Ohne diese Methode erzeugt rPPEP-1 sofort stark verwachsene Kristalle, die für die Röntgenbeugungsanalyse nicht geeignet sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass eine große Anzahl von gut geordneten und gut beugenden Kristallen für die Strukturbestimmung von rPPEP-1 in kurzer Zeit und mit begrenztem Materialeinsatz hergestellt werden kann.

Dieses Verfahren bedient sich der Microcity-Methode und kann für jede erfolgreiche Erstkristallisationsbedingung von rPPEP-1 sowie dessen Substratpeptidkomplexen angepasst werden. Diese Methode kann angepasst werden, um gut geordnete Kristalle von praktisch jedem Protein herzustellen, das verwachsene Kristalle ergibt. Es kann auch in Cross-Seeding-Experimenten, Proteinvarianz oder in Kokristallisationsexperimenten mit kleinen Molekülen verwendet werden.

visuelle Demonstration der Handhabung von Kristallisationsmethoden ist von entscheidender Bedeutung, da bereits kleine Abweichungen einen erheblichen Einfluss auf die Beugungsqualität der Kristalle haben können. Führen Sie Kristallisationsversuche im sitzenden Tropfenformat mit handelsüblichen Bildschirmen und einem Kristallisationsroboter durch. Zuerst wird das gereinigte Protein mit einem Zentrifugal-Ultrafiltrationsgerät in Fünf-Minuten-Intervallen bei 4000 mal g und vier Grad Celsius auf 12 Milligramm pro Milliliter konzentriert.

Mischen Sie das Protein nach jedem Intervall, um Ausfällungen und Verschlimmerungen zu vermeiden. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration bei 280 Nanometern mit dem Extinktionskoeffizienten von 25.900 pro molarem Zentimeter. Nach dem Äquilibrieren des Proteins auf 20 Grad Celsius werden alle Partikel und Staub durch 10-minütige Zentrifugation bei 16000 mal g und 20 Grad Celsius entfernt.

Verwenden Sie für die Durchführung von Kristallsieben vorgefüllte Kristallisationsplatten, die versiegelt und bei vier Grad Celsius gelagert werden. Gehen Sie beim Einrichten von Versuchen schnell vor, da die kleinen Volumina schnell austrocknen. Verwenden Sie nach Möglichkeit auch eine Feuchtigkeitskammer um das Dock des Roboters.

Nachdem Sie alle Kristallisationsplatten auf 20 Grad Celsius äquilibriert haben, richten Sie das Sieb ein, indem Sie das Protein-Ent-Reservoir in die Vertiefungen zwei bis vier pipettieren. Verwenden Sie ein Tropfenvolumen von 300 Nanolitern. Verwenden Sie ein Protein-Reservoir-Verhältnis von 200:100 für Vertiefung zwei, 150:150 für Vertiefung drei und 100:200 für Vertiefung vier.

Verschließen Sie die Platte sofort und stellen Sie sie in eine Kammer bei 20 Grad Celsius. Überprüfen Sie die Tabletts nach dem Einrichten in der ersten Woche jeden Tag und folgen Sie dann mit der wöchentlichen Inspektion. Für eine Kokristallisation des Substratpeptids rPPEP-1-Komplexe mischt man rPPEP-1 bei 24 Milligramm pro Milliliter im Verhältnis 1:1 mit einem siebenfach molaren Überschuss an Peptidlösung und legt lyophilisiertes Pulver, das in Tris-gepufferter Kochsalzlösung solubilisiert ist, ab.

Nach einer 30-minütigen Inkubation bei 20 Grad Celsius werden alle Partikel und Staub durch 10-minütige Zentrifugation bei 16000 mal g und 20 Grad Celsius von allen Partikeln und Staub entfernt. Fahren Sie mit der Kristallisation unter Verwendung des gleichen Mikroseeding-Verfahrens fort wie für das ungebundene rPPEP-1-Protein. Hoch verwachsene Kristalle von rPPEP-1 erschienen nach zwei Tagen in einem Zustand, der 2,4 molare Ammoniumphosphat zweibasisch und 0,1 molare Trisapseal enthielt, pH 8,5.

Um den Anfangszustand zu optimieren, verwenden Sie eine Software zur Berechnung des Volumens und des Pipettierschemas, um zwei Milliliter jeder Bedingung zu erhalten, die 10 Optimierungsbildschirme ermöglicht. Zu den Bedingungen gehören 1,8 bis 2,55 molare Ammoniumphosphat zweibasig in Schritten von 0,15 molaren sowie 0,1 molare Trisapseal, pH 7,5 bis 9,0 in Schritten von 0,5 pH-Einheiten. Bereiten Sie ein Rasterraster mit 24 Bedingungen aus Stammlösungen vor.

Verwenden Sie das Pipettierschema, um die einzelnen Bedingungen zusammenzustellen. Pipettieren Sie 200 Mikroliter jeder Gittersieblösung in die Vertiefungen einer 24-Well-Platte und äquilibrieren Sie die Platte bei 20 Grad Celsius. Richten Sie die Kristallisationsplatte manuell ein.

Verwenden Sie ein Tropfenvolumen von drei Mikrolitern und ein Protein-Reservoir-Verhältnis von 2:1, 1,5:1:5 und 1:2. Verwenden Sie hier eine Verdrängerpipette, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden. Verschließen Sie die Platte sofort.

Stellen Sie die Platte dann in eine Kammer bei 20 Grad Celsius. Nach ein bis vier Tagen erscheinen stark verwachsene Kristalle von rPPEP-1 unter den vier Bedingungen, die 2,55 molare Ammoniumphosphat zweibasisch und 0,1 molare Trisapseal mit einem pH-Wert von 7,5 bis 9,0 enthalten, während in den restlichen 20 Bedingungen keine Kristalle gebildet werden. Führen Sie das Microseeding-Verfahren durch, um unter diesen Bedingungen Einkristalle von rPPEP-1 zu erhalten.

Um eine Mikrosamenbrühe herzustellen, wählen Sie zunächst einen einzelnen verwachsenen Kristall aus einer der erfolgreichen Bedingungen aus. Anschließend werden 50 Mikroliter der jeweiligen Mutterlauge in ein 1,5 Milliliter Röhrchen mit einer kleinen, hochglanzpolierten Glasperle und einem Mikroliter der Mutterlauge auf den Glasdeckel umgefüllt. Fischen Sie den Kristall mit einem montierten Nylon-Gleitmittel heraus und geben Sie ihn in den Tropfen auf dem Glasdeckel.

Füllen Sie dann die Flüssigkeit mit dem Kristall in das Rohr und wirbeln Sie sie 30 Sekunden lang mit hoher Geschwindigkeit auf, wobei Sie darauf achten, dass die Glasperle wirbelt. Verdünnen Sie die Samenbrühe im Verhältnis 1:1000 in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen mit dem gleichen frisch zubereiteten Zustand und wirbeln Sie sie fünf Sekunden lang gründlich ein. Entfernen Sie anschließend die Versiegelung der Platte, die die 20 Bedingungen mit klaren Tropfen abdeckt.

Pipettieren Sie 0,5 Mikroliter des Saatguts in die Vertiefungen. Verschließen Sie die Platte und stellen Sie sie in eine Kammer bei 20 Grad Celsius. Nach der Anwendung dieser Mikrosaattechnik erscheinen Einkristalle mit hoher Beugungsqualität mehrere Stunden bis mehrere Tage nach dem Aufbau unter verschiedenen Bedingungen, die 1,8 bis 2,4 molare Ammoniumphosphate und 0,1 molare Tris mit einem pH-Wert von 7,5 bis neun enthalten.

Kristalle wachsen in der größten Dimension auf eine Größe von 100 bis 200 Mikrometern. Wählen Sie die optimale Größe der Nylonschlaufe für die maximale Länge der ausgewählten Kristalle, indem Sie die Schlaufe auf dem Dichtungsband direkt über dem Kristall platzieren und nach oben und unten fokussieren. Der typische längste Zugang von rPPEP-1-Kristallen beträgt etwa 100 bis 200 Mikrometer.

Bereiten Sie auch die entsprechende Kryokondition vor. Füllen Sie die Schaumauswerfer mit flüssigem Stickstoff. Beladen Sie dann die Vial-Klemme mit einem Vial und kühlen Sie es im mit flüssigem Stickstoff gefüllten 800 Milliliter Schaumtauber vor.

Legen Sie einen Kryorohrhalter, der mit einer geeigneten Kennung gekennzeichnet ist, und einen Kryosleeve in den mit flüssigem Stickstoff gefüllten Zwei-Liter-Schaumtaufer. Beladen Sie dann den Magnetstab mit der montierten Nylonschlaufe in der richtigen Größe. Schneiden Sie anschließend das Dichtband auf der Kristallisationsplatte mit einem scharfen Skalpell auf und entfernen Sie es mit einer Pinzette.

Pipettieren Sie einen Mikroliter des Kryozustands auf den Objektträger. In diesem Schritt ist es besonders wichtig, schnell zu arbeiten, da das Austrocknen des Kristalls oder das winzige Volumen der Kryolösung in der Schleife zu Schwankungen in der Kristallqualität oder sogar zu einem vollständigen Verlust der Beugung führen kann. Alle Schritte zur Kristallmanipulation sollten unter dem Stereomikroskop durchgeführt werden.

Wenn der Kristall an der Kunststoffoberfläche kleben bleibt, lösen Sie ihn vom Boden, indem Sie den umgebenden Kunststoff mit einer Akupunkturnadel verformen. Entferne den Kristall aus dem Tropfen, indem du ihn mit der montierten Nylonschlaufe herausfischst. Übertragen Sie den Kristall schnell in den Tropfen Kryokondition und lassen Sie ihn eine Sekunde lang äquilibrieren.

Dann fischen Sie den Kristall mit der montierten Nylonschlaufe so schnell wie möglich aus dem Drop. Tauchen Sie den gewonnenen Kristall sofort in flüssigem Stickstoff ein. Wenn der flüssige Stickstoff um die montierte Schleife nicht mehr kocht, legen Sie die Schleife in die Durchstechflasche.

Stellen Sie das Fläschchen auf den Kryorohrhalter. Sobald der Halter mit sechs Fläschchen bestückt ist, legen Sie einen Kryosleeve um den Halter. Lagern Sie die Kristalle bis zur Verwendung in einem mit flüssigem Stickstoff gefüllten Tank.

Um die Datenerfassung durchzuführen, nehmen Sie den montierten Kristall vorsichtig mit einer Klemme aus dem Kryorohr und bewahren Sie ihn für den Transport in einem Schaumreiniger auf. Bewegen Sie den Strahlanschlag und den Detektor in die Parkposition und bewegen Sie die Kryodüse um einige Millimeter nach oben. Montieren Sie die Basis der Kryokappe auf dem Goniometerkopf, indem Sie die Basis mit den Fingern festhalten, während Sie das Fläschchen schnell entfernen.

Bewegen Sie dann die Kryodüse und den Strahlanschlag wieder an ihren Platz und zentrieren Sie den Kristall. Achten Sie zu jeder Zeit darauf, den Strahlanschlag oder den Detektor nicht zu berühren. Fahren Sie mit der Erfassung des 180-Grad-Datensatzes mit einem Schwingungswinkel von 0,1 Grad fort, wie hier gezeigt.

Hier sind stark verwachsene rPPEP-1-Kristalle zu sehen, die aus dem Erstscreening mit kommerziellen Kristallisationssieben in 1,4 Natriumcitrat tribasischem Dihydrat, 0,1 molar HEPES-Natrium und pH 7,5 gewonnen wurden. Hier sind Kristalle gezeigt, die aus dem ersten Screening mit 60 % Volumen-zu-Volumen-Tacsimat, pH 7,0, 0,1 molaren BIS-TRIS Propan, pH 7,0 gewonnen wurden. Kristalle traten auch in 2,4 molaren Ammoniumphosphat zweibasisch, 0,1 molaren Tris, pH 8,5 auf.

Nach Anwendung des Mikrosaatoptimierungsverfahrens wurden Einkristalle unter mehreren Bedingungen eingeschlossen, darunter 2,1 molare Ammoniumphosphat zweibasisch, 0,1 molare Tris, pH 8 und 2,25 molare Ammoniumphosphat zweibasisch, 0,1 molare Tris, pH 8. Die Kristalle, die in Nylonschleifen montiert sind, sind 100 bis 200 Mikrometer groß und scheinen bei mikroskopischer Untersuchung ein einziges Gitter zu haben. Die Röntgenbeugungsanalyse zeigt, dass diese Kristalle tatsächlich ein einzelnes Gitter aufweisen und Röntgenstrahlen mit nahezu atomarer Auflösung beugen.

Die Aufklärung der Kristallstruktur des rekombinanten PPEP-1-Substratpeptidkomplexes gibt Einblick in den Substratbindungsmodus von PPEP-1. Das Substratpeptid konnte in seiner offenen Bestätigung in die Substratbindungsgruppe von PPEP-1 diffundieren. Wenn dann der Schleifenschluss stattfindet, interagiert das Substrat mit PPEP-1 über Wasserstoffbrückenbindungen und das einzigartige aliphatisch-aromatische Seitenkettennetzwerk, das sich auf der S-Schleife befindet.

Das Substrat bindet in einer einzigartigen doppelt geknickten Konformation mit Knicken an der Sizzle-Peptidbindung und der P2-Prime-zu-P3-Prime-Peptidbindung. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man gut beugende Kristalle aus rekombinantem PPEP-1 mit einem Gitter für Strukturstudien herstellt. Ähnliche Ansätze können mit anderen Proteinen verwendet werden, was zu stark verwachsenen Kristallen und weiter variierender Inkubationstemperatur und C-Stammverdünnung führt.

Aufgrund ihrer Vielseitigkeit und einfachen Anwendung sollte diese einfache Technik in jedem Kristalloptimierungsprozess ausprobiert werden.