Crystallizing Membranproteinen zur Strukturaufklärung mittels Lipidische Mesophasen

Hallo und herzlich willkommen in der Arbeitsgruppe Membranstruktur- und Funktionsbiologie. Mein Name ist Martin Caffery. Im Mittelpunkt unserer Forschung steht die biologische Membran, deren Schema auf der ersten Folie dargestellt ist, die Membran, die die Zelle und die subzellulären Organellen umgibt, wenn vorhanden, eine molekular dünne Struktur, nur zwei Lipidmoleküle breit und mit Proteinen übersät.

Wir interessieren uns für die Struktur und Funktionen, die sowohl auf Lipide als auch auf Proteine angewendet werden. Für die Zwecke dieser JO-Serie werde ich mich jedoch auf Membranproteine beschränken. Wir versuchen aus zwei Gründen zu verstehen, wie diese Membranproteine auf molekularer Ebene funktionieren.

Da ist zunächst die intellektuelle Befriedigung, zu wissen, wie etwas funktioniert. Zweitens, wenn Sie wissen, wie es funktioniert, genau wie Ihr Fahrrad oder Auto, besteht die Aussicht, es zu reparieren, wenn es nicht richtig funktioniert. Das Design von Medikamenten ist ein offensichtliches Ergebnis dieser Art von Arbeit.

Der Ansatz, den wir verfolgen, um herauszufinden, wie ein Membranprotein auf molekularer Ebene funktioniert, besteht darin, seine kristallographische Struktur zu bestimmen. Dabei wird die Position aller Atome oder zumindest aller Nicht-Wasserstoffatome, aus denen das Protein besteht, im dreidimensionalen Raum festgelegt. Die Methode, die wir zu diesem Zweck anwenden, wird als makromolekulare Röntgenkristallographie, kurz MX, bezeichnet.

Hier sehen wir ein Beispiel für ein Membranprotein, dessen Struktur mit MX bestimmt wurde, wobei ein Kristall der Fraktionsqualität des Proteins erforderlich ist, um mx durchzuführen. Wie Sie sich vorstellen können, gibt es viele Schritte bei der strukturierten Bestimmung mit Hilfe der makromolekularen Kristallographie, wie dargestellt. Hier. Dazu gehören in der Regel die Identifizierung eines Membranproteinziels und die anschließende Herstellung, Reinigung und Kristallisation.

Beugungsmessungen werden am Kristall mit einer Heim- oder einer Synchrotron-Röntgenquelle durchgeführt. Die Beugungsdaten werden verarbeitet, so dass eine Elektronendichtekarte erstellt wird, die dann mit einem molekularen Modell versehen wird. Wenn das Modell verfeinert ist, kann es verwendet werden, um den Wirkmechanismus des Proteins zu erforschen und für das strukturbasierte Wirkstoffdesign.

Der Schwerpunkt dieses JO-Artikels liegt darauf, Ihnen zu zeigen, wie wir Kristalle von Membranproteinen in Fraktionsqualität unter Verwendung von Lipid-Mesophasen nach der sogenannten In-Meso-Methode herstellen. Eine aktuelle Übersicht über die Methode und ihren Anwendungsbereich ist in der ersten Referenz verfügbar. Das Schritt-für-Schritt-Protokoll, dem wir hier folgen werden, wird unter Bezugnahme auf ein Flussdiagramm beschrieben, das die Schritte und die erforderliche Zeit für die Einrichtung eines Kristallisationsversuchs mit Endmesomembran-Proteinen zusammenfasst.

In diesem Video werden diese Schritte beschrieben, die von gestrichelten roten Linien umschlossen sind. Die Punkte, die Sie bei der Mesokristallisation im manuellen Modus ausführen müssen, werden hier angezeigt. Sie umfassen eine konzentrierte Lösung des gereinigten Membranproteinlipids zur Erzeugung des Wirtsmoleküls, normalerweise Monoöl, um das Lipid deutlicher zu machen.

In diesem Video wurde es mit roten Farbstofffällungslösungen, gereinigten Wasserpfeifen-Streichelvorrichtungen und Einwegspitzen dotiert, sowie mit einer Auswahl an gastdichten Hamilton-Spritzen, einige mit abnehmbaren Nadeln, einer Kupplung mit schmaler Bohrung, die zum Mischen der Proteinlösung mit dem Lipid verwendet wird, um das Mease herzustellen. Ein Repeating-Dispenser von Hamilton Glasmikroskop-Objektträger und Deckgläser. Ideal siloisiertes, perforiertes Doppelstab-Abstandsband für Pinzetten, abgebrochenes Eisgewebe, einen Taschenrechner und vor allem für Ihr Labornotizbuch.

Das folgende Verfahren wird verwendet, um eine Glas-Sandwich-Kristallisationsplatte vorzubereiten. Legen Sie zum Laden einen siloisierten Objektträger auf die Bank. Entfernen Sie die Schutzpapierabdeckung von einer Oberfläche eines Streifens perforiertes Doppelstab-Abstandsband.

Legen Sie das Klebeband mit der klebrigen Seite nach unten in Kontakt mit der Oberfläche des Schiebedrucks. Versiegeln Sie das Klebeband mit der Folie. Mit einem Brayer oder einer Rolle kann Aluminiumfolie zwischen dem Band und der Walze platziert werden, um den Boden der Vertiefungen zu schützen.

Entfernen Sie die zweite Papierabdeckung vom Klebeband, um die obere klebrige Oberfläche freizulegen. Durch dieses Verfahren wird eine Glasplatte erzeugt, die für die Verladung und die anschließende Decke bereit ist, sobald die Verladung abgeschlossen ist. Individuelle siloisierte Deckgläser in unmittelbarer Nähe der Platte für eine schnelle und effiziente Decke von Brunnen.

Legen Sie das Lipid drei Minuten lang bei 45 Grad Celsius in einen temperaturkontrollierten Block, um es schmolzen zu lassen. Beachten Sie, dass das verwendete Lipid typischerweise Monoland ist. In diesem Video wird dem Lipid ein roter Farbstoff hinzugefügt, um die Sichtbarkeit zu erhöhen, während das Lipid schmilzt.

Bereiten Sie zwei gasdichte 100-Mikroliter-Hamilton-Spritzen für den Gebrauch vor Entfernen Sie im Schritt zum Mischen des Lipidproteins das Teflonfellöl aus der Spritze, die die Proteinlösung enthält. Lege die Spritze, die das Lipid hält, daneben. In diesem Fall wird der fal an Ort und Stelle belassen.

Platzieren Sie die Kupplung mit schmaler Bohrung zwischen den beiden Spritzen und verbinden Sie die Kupplung dann mit dem Finger der Lipidspritze. Ziehen Sie die Kupplung an der Spritze fest, aber ziehen Sie sie nicht zu fest an. Entfernen Sie den Kolben aus dem Zylinder der Lipidspritze.

Stellen Sie sicher, dass das Lipid geschmolzen ist. Stellen Sie die Pipette auf 30 Mikroliter ein und nehmen Sie langsam 30 Mikroliter geschmolzene Lipidkappe auf. Das Lipidfläschchen.

Das Lipid sollte unter Stickstoff oder Argon bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden. Geben Sie langsam so viel wie möglich von dem geschmolzenen Lipid in das offene Ende der Spritze. Achten Sie darauf, keine Luftspalte einzuführen.

Setzen Sie den Kolben in den Zylinder ein, der mit dem geschmolzenen Leoparden in Berührung kommt, und schieben Sie den Kolben langsam in den Zylinder nach oben, wobei Sie die Spritze senkrecht halten. Wie gezeigt, steigt die eingeschlossene Luftblase dabei versehentlich auf und wird freigesetzt. Wir haben jetzt einen Pfropfen aus geschmolzenem Lipid im Fass, dessen Volumen Sie genau bestimmen müssen.

Dies kann durch Ablesen der Markierungen auf dem Spritzenzylinder erfolgen. In diesem Fall beträgt das Volumen 23 Mikroliter, was im Labornotizbuch aufgezeichnet wird. Schieben Sie das Fell auf die Nadel, die von der Kupplung ausgeht.

Verwenden Sie den Kolben, um das geschmolzene Lipid in den Zylinder zu drücken und langsam und sanft in die Nadel im Kern des Kupplers zu drücken. Wenn die Nadel leicht überfüllt ist, sieht man, wie das Lipid an seinem offenen Ende ausschlägt. Durch leichtes Zurückziehen des Kolbens kann das überschüssige Lipid in die Kupplung zurückgezogen werden, bis es gerade noch bündig mit der Spitze der Kupplungsnadel abschließt.

In diesem Fall ist die Spritzenkopplereinheit voll beladen und bereit, mit der Proteinspritze kombiniert zu werden. Die Lösung sollte 10 Minuten lang bei 14.000 g und fünf bis 10 Minuten bei vier Grad Celsius geschleudert werden, um große Aggregate zu entfernen. Bevor Sie Kristallisationsversuche durchführen, nehmen Sie die Proteinlösung aus dem Eiskübel und äquilibrieren Sie sie bei Raumtemperatur.

Berechnen Sie das Volumen des Proteins, also die Lösung, die zur Bildung der kubischen Phase bei oder nahe der vollständigen Hydratation für Olean bei 20 Grad Celsius verwendet wird. Die vollständige Hydratation mit Wasser erfolgt bei fast 40 Gew.-% des Wassers, wie im Phasendiagramm dargestellt. Zur Erinnerung: Wir haben die Lipidspritze mit 23 Mono mit einer Dichte von 0,94 Milligramm pro Mikroliter beladen.

Dies entspricht 21,6 Milligramm Lipid, also 21,6 mal vier geteilt durch sechs oder 14,4 Milligramm oder 14,4 Mikroliter Proteinlösung. Mit einer 25 oder 50 Mikroliter Hamilton-Spritze wird das erforderliche Volumen der Proteinlösung aufgenommen, die Lösung auf die Teflonspitze des Kolbens in den Zylinder der Proteinlösung übertragen. Achten Sie darauf, Luftblasen zu vermeiden, ziehen Sie die Nadel vorsichtig zurück und messen Sie das Volumen der Proteinlösung in der Spritze. Er sollte mit dem Wert übereinstimmen, der im vorherigen Schritt geliefert wurde.

Zur Vorbereitung auf die Kombination mit der lipidgeladenen Spritze. Schiebe die Proteinlösung vorsichtig in den Zylinder, bis sie bündig mit dem offenen Ende abschließt. Dies kann beobachtet werden, indem man durch das Ende des Laufanschlusses nach unten schaut.

Die Lipin-Proteinlösung, beladene Spritzen sind nun bereit, kombiniert zu werden, um Mex vorzubereiten. Um dies zu tun, schrauben Sie die Proteinspritze in das offene Ende des an der Lipidspritze befestigten Kupplers. Nachdem zwei Spritzen über die Kupplung kombiniert wurden. Es sollte ein kontinuierliches Flüssigkeitsvolumen vom Lipid in einer Spritze durch den Kuppler bis zur Proteinlösung in der anderen Spritze vorhanden sein.

Zur Vorbereitung des Mischens wird die zusammengebaute Einheit mit einer Spritze in der rechten und der anderen in der linken Hand gehalten. Das Drehmoment wird auf beide Zylinder bis zur Kupplung ausgeübt, wobei mit den Fingern und dem Daumen beider Hände sichergestellt wird, dass die Dichtung gegen die Furchen in der Kupplung beim Festziehen intakt bleibt. Die zu diesem Zeitpunkt zusammengebaute Mischvorrichtung beschädigt die ALS und führt zu Undichtigkeiten, die beim Anziehen ebenfalls zu Undichtigkeiten führen.

Es ist eine Frage der Erfahrung mit dem unvermeidlichen Ausprobieren und gelegentlichen Verlust von Proben. Es lohnt sich daher, mit Lipid und Wasser oder Pufferlösung zu üben, um ein Gefühl für das System zu bekommen, bevor man mit der Verwendung wertvoller Proteinlösung zur Beeinflussung des Mischens beginnt, den Kolben auf der Proteinseite der zusammengesetzten Mischeinheit mit Daumen oder Zeigefinger bis an seine Grenzen zu schieben und die Proteinlösung aus der Proteinspritze durch den Kuppler in die Lipidspritze zu treiben. Wenn das Gerät effektiv abgedichtet wurde, bewirkt diese Aktion eine gleichmäßige und entgegengesetzte Bewegung des Kolbens auf der Lipidseite.

Über den Kolben auf der Lipidseite wird nun der Inhalt der Lipidspritze durch die Hülle zurück in die Proteinspritze getrieben. Dieser Vorgang wird viele Male wiederholt. Gelegentlich sind hundert Passagen oder mehr erforderlich, um eine homogene Misa-Phase zu erzeugen.

Zu Beginn des Mischens kann die Bewegung des Materials durch die Kupplung ungleichmäßig sein, und manchmal ist zusätzliche Kraft erforderlich, um das Mischen zu bewirken. Das ist zu erwarten. Das anfängliche Mischen geht in der Regel mit der Entwicklung einer ungleichmäßigen Trübungen in der Probe einher und ist wiederum zu erwarten.

Mit fortschreitender Homogenisierung. Die Textur, die durch die Kraft wahrgenommen wird, die erforderlich ist, um die Kolben hin und her zu bewegen, wird gleichmäßiger und charakteristischer für die kubische Phase des Eingeweides, ebenso wie das visuelle Erscheinungsbild der entstehenden kubischen Phase. Wenn die Bedingungen geeignet sind und sich die kubische Phase bildet, sollte die Dispersion im Spritzenzylinder optisch transparent erscheinen.

So sollten die Markierungen auf dem Spritzenzylinder durch die Mesophase im Zylinder hindurch gut lesbar sein. Bei farbigen Proteinen hat die Mesophase die Farbe des Proteins, ist aber optisch transparent. Eine sehr leichte Abkühlung der Probe während des Mischens, indem der Spritzenmischer für kurze Zeit auf Eis gestellt wird, kann die Homogenisierung und das Erreichen der Transparenz beschleunigen.

Es ist jedoch wichtig, die Probe nicht zu übertreiben und darauf zu achten, dass eine extrem starke Vermischung vermieden wird, da dies zu einem Anstieg der Probentemperatur durch Reibungserwärmung führen kann. Zu diesem Zeitpunkt hat sich die kubische Misa-Phase gebildet und das Protein wird zum Lipid Blay rekonstituiert. Die Misa-Phase ist nun bereit für die Dispensation in einzelne Vertiefungen der Kristallisationsplatten.

Zunächst muss jedoch die Mesophase auf eine 10-Mikroliter-Hamilton-Spritze übertragen werden, die auf einem Repeating-Dispenser montiert ist. Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie die Spritze dünn an den Spender ankoppeln. Laden Sie die Spritze mit dem cubic mease.

Entfernen Sie die Nadel und den Kolben von der Spritze. Lassen Sie den Teflon fal an Ort und Stelle. Entfernen Sie die Haltemutter mit Hilfe einer kleinen Münze aus dem Spender.

Mit vollständig eingefahrenem Ratschenarm. Führen Sie die Spritze ohne Kolben und Nadel durch den Haltering des Spenders. Setzen Sie die Halteknotendichtungsseite zur Spritze wieder auf und schrauben Sie sie fest an das offene Ende der Spritze.

sollte darauf geachtet werden, dass die Spritze richtig im Haltering zentriert ist und dass der Zylinder parallel zum Ratschenarm ausgerichtet ist. Beide können anhand von I beurteilt werden. Diese beiden Anforderungen sind wichtig, denn wenn der Kolben nicht frei läuft und sich durch Druck in der Quellspritze während des Ladens aufbaut und es zu Leckagen kommen kann. Führen Sie den Kolben mit der Greifermutter durch den Greifring, schrauben Sie ihn einige Umdrehungen ab und führen Sie den Kolben in das offene Ende der Spritze.

Drücken Sie den Ratschenarm ganz durch, bewegen Sie den Kolben in den Lauf und prüfen Sie, ob er sich frei und durchgelassen im Lauf bewegt. Wenn die Schraube und die Führungsschiene gelöst wurden, ziehen Sie sie wieder fest und prüfen Sie erneut, ob sich der Stößel frei bewegt. I Die Dosierspritze ist nun bereit zum Beladen.

Bewegen Sie den Kolben auf einer Seite der montierten Mischeinheit bis zur Null-Mikroliter-Graduierung. Zur Übertragung der Mesophase auf die andere Spritze und den Koppler. Trennen Sie die leere Spritze mit aufgesetztem UL von der Mischeinheit und verbinden Sie die beladene Spritze sofort mit der Kupplung, die am Gewindeanschluss der 10-Mikroliter-Dosierspritze befestigt ist.

Der Grad der Dichtheit, mit dem die Kopplung erfolgt, ist entscheidend. Wie bereits erwähnt, wird die Dosierspritze durch Drücken des Kolbens der 100-Mikroliter-Spritze geladen, so dass die Mesophase durch die Kupplung übertragen wird. Wenn die Kupplung fest sitzt und der Kolben in der Dosierspritze frei läuft, sollte sich der Kolben in Bewegungsrichtung des Ladekolbens zu bewegen beginnen, wenn sich die Dosierspritze füllt.

Trennen Sie die Ladespritze mit der an der Abgabespritze befestigten Kupplung. Befestigen Sie eine kurze Nadel mit flacher Spitze am Stahlanschluss der Dosierspritze und ziehen Sie sie vorsichtig fest. Klemmen Sie den Stößel an den Ratschenarm, indem Sie den Knoten im Greifring festziehen.

Es sollte darauf geachtet werden, den Knoten nicht zu fest zu ziehen. Da dies den Stößel beschädigen und verformen kann, wird er unbrauchbar. Es ist wichtig, dass der Verfahrbereich des Ratschenarms im geklemmten Zustand auf nicht mehr als einen Zoll begrenzt wird.

Wie darüber hinaus gezeigt, neigt der Kolben dazu, sich zu verbiegen und die Abgabe kann versagen. L Drücken Sie die Ratschentrommel mehrmals, um den Kolben im Lauf vorzuschieben und so den Hohlraum der Nadel zu füllen und die Nadel zu laden. Dieser Schritt sollte bis zu 10 Mal wiederholt werden, bis ein kontinuierlicher Strang der Mesa-Phase aus der Spitze der Nadel austritt.

Die Nadel ist nun bereit für den Aufbau von Kristallisationsversuchen, die sofort beginnen sollen. Es ist nicht ratsam, die proteinbeladene kubische Phase zu lange zu halten, bevor die Kristallisationsversuche durchgeführt werden. Da einige Proteine in der kubischen Phase ohne Zusatz von Fällungsmittel instabil sind, legen Sie eine Multiwell-Kristallisationsplatte und einen Deckglas auf eine Oberfläche, die einige Zentimeter über der Bank liegt, um das Laden zu erleichtern.

Optimaler Kontrast und verbesserte Sichtbarkeit werden erreicht, wenn die Oberfläche leicht dunkel ist. Homogenisieren Sie die Fällmittellösungen und öffnen Sie die Deckel der Fläschchen. Stellen Sie die Fällmittelabgabe auf einen Mikroliter ein, halten Sie die Dosierspritze senkrecht in einer Hand, positionieren Sie die Nadelspitze mit der freien Hand in der Mitte und direkt über dem Boden der Vertiefung.

Nummer eins. Drücken Sie den Knopf an der Ausgabe des Repeating-Spenders, um einen Bolus Mease auf die Glasoberfläche auszustoßen. Das Bolusvolumen beträgt 200 Nanoliter.

Wenn der Standard-Repetierspender mit einer 10-Mikroliter-Spritze verwendet wird, sollte sich die Spitze der Nadel nicht mehr als einige hundert Mikrometer über dem Boden der Vertiefung befinden. Um eine ordnungsgemäße Abgabe zu gewährleisten, ist eine reproduzierbare Abgabe leicht zu erreichen. Es braucht nur ein wenig Übung. Nachdem die vier benachbarten Vertiefungen mit Mease beladen wurden, geben Sie einen Mikroliter Fällungslösung auf jeden Mease-Bolus.

Verwenden Sie so schnell wie möglich zwei Mikroliter pro Patent und Standard-Einwegspitzen und legen Sie einen Deckschirm direkt über die gefüllten Vertiefungen, um sie gleichmäßig abzudecken und eine wasserdichte Abdichtung zu erzielen. Üben Sie mit einem Spachtel Druck auf den Deckglas aus, wo er mit der freiliegenden klebrigen Oberfläche des Abstandsbandes in Kontakt kommt. Der Vorgang der Mahl- und Fällmitteldosierung kann so lange wiederholt werden, bis alle Vertiefungen auf der Platte beladen und versiegelt sind.

Die Platte ist nun bereit für die Inspektion und für die Inkubation. Beschriften Sie das Schild deutlich zur Nachverfolgung. Lichtempfindliche Proteine werden in der Regel gehandhabt, indem die Platten in Aluminiumfolie eingewickelt werden, bevor sie in die Inkubationskammer gelegt werden.

Diese können entnommen und unter dem Mikroskop bei gedämpftem oder farblich abgestimmtem Licht untersucht werden. Stellen Sie die Platten in eine klimatisierte Kammer, in der Regel bei etwa 20 Grad Celsius, nach einem regelmäßigen Zeitplan. Untersuchen Sie die Wände mit einem Polarisationslichtmikroskop mit einem 10- oder 20-fachen Met auf Kristallwachstum.

Ziel, der im Labor des Autors verwendete Zeitplan lautet wie folgt: Tag 0 1 2 3 5 7 14 21 30 Beitragssatz. Inspizieren Sie den Mease-Bolus sorgfältig. Einstellen der Schärfentiefe innerhalb der 140 Mikrometer dicken Probe.

Die Untersuchung sollte sowohl bei normalem Licht als auch zwischen kreuzgekreuzten Polarisatoren durchgeführt werden, d. h. farblosen Membranproteinkristallen, die in der kubischen Phase wachsen, wenn sie mit normalem Licht betrachtet werden. Sehen Sie so aus. Farblose Membranproteinkristalle, die in Meso wachsen, wenn sie mit polarisiertem Licht betrachtet werden, sehen so aus, oder diese natürlich gefärbten Membranproteine, die in Meso wachsen, sehen bei normalem Licht so oder so aus.

Die nächsten Schritte im Gesamtprozess der strukturierten Bestimmung sind die Ernte und Kryokühlung der Kristalle sowie die Aufzeichnung und Verarbeitung der Röntgenbeugung von ihnen. Diese Themen werden in separaten JoVE-Artikeln dieser Serie behandelt.