Crystallizing Membranproteinen zur Strukturaufklärung mittels Lipidische Mesophasen

Hallo und herzlich willkommen in der Arbeitsgruppe für membranäre Struktur und Funktion. Mein Name ist Martin Caffery. Der Schwerpunkt unserer Forschung liegt auf der biologischen Membran, deren Schema auf der ersten Folie dargestellt ist. Die Membran, die die Zelle und – falls vorhanden – die Organellen umgibt, ist eine molekular dünne Struktur, gerade zwei Lipidmoleküle dick, und mit Proteinen besetzt.

Wir beschäftigen uns mit der Struktur und Funktion von sowohl Lipiden als auch Proteinen. Im Rahmen dieser JO-Reihe beschränke ich mich jedoch auf Membranproteine. Wir verfolgen das Ziel, die Funktion dieser Membranproteine auf molekularer Ebene aus zwei Gründen zu verstehen.

Zunächst einmal ergibt sich eine intellektuelle Befriedigung daraus, zu wissen, wie etwas funktioniert. Zweitens besteht, ähnlich wie bei einem Fahrrad oder Auto, durch das Verständnis der Funktionsweise die Möglichkeit, es zu reparieren, falls es nicht richtig funktioniert. Die Arzneimittelentwicklung ist ein offensichtliches Ergebnis dieser Art von Arbeit.

Der von uns verfolgte Ansatz, um herauszufinden, wie ein Membranprotein auf molekularer Ebene funktioniert, besteht darin, seine kristallographische Struktur zu bestimmen. Dies beinhaltet die Ermittlung der Lage aller Atome im dreidimensionalen Raum oder zumindest aller Nicht-Wasserstoffatome, aus denen das Protein aufgebaut ist. Die Methode, die wir dafür verwenden, wird als makromolekulare Röntgenkristallographie bezeichnet, kurz MX.

Hier sehen wir ein Beispiel für ein Membranprotein, dessen Struktur mittels Röntgenbeugung (MX) bestimmt wurde. Für die Durchführung von MX ist ein kristalliner Bruchteil des Proteins erforderlich. Wie Sie sich vorstellen können, sind viele Schritte an der Strukturaufklärung mittels makromolekularer Kristallographie beteiligt, wie hier veranschaulicht. Typischerweise umfassen diese Schritte die Identifizierung eines Membranproteintargets sowie die Herstellung, Reinigung und Kristallisation des Proteins.

Beugungsmessungen an dem Kristall werden mithilfe einer Labor- oder Synchrotron-Röntgenquelle durchgeführt. Die Beugungsdaten werden verarbeitet, wodurch eine Elektronendichtekarte entsteht, die anschließend mit einem molekularen Modell angepasst wird. Das verfeinerte Modell kann verwendet werden, um den Wirkmechanismus des Proteins zu untersuchen und für die strukturbasierte Wirkstoffentwicklung.

Der Schwerpunkt dieses JoVE-Artikels liegt darin, Ihnen zu zeigen, wie wir hochwertige Kristalle von Membranproteinen mithilfe lipidbasierter mesophaser Phasen nach der sogenannten In-Meso-Methode herstellen. Ein aktueller Überblick über die Methode und ihren Anwendungsbereich ist in Quelle eins verfügbar. Der hier beschriebene Schritt-für-Schritt-Protokoll wird anhand eines Flussdiagramms erläutert, das die beteiligten Schritte sowie den zeitlichen Aufwand für die Einrichtung eines In-Meso-Kristallisationsversuchs mit Membranproteinen zusammenfasst und hier dargestellt ist.

Dieses Video behandelt die Schritte, die durch gestrichelte rote Linien hervorgehoben sind. Die Materialien, die Sie für die meso-Kristallisation im manuellen Modus benötigen, sind hier dargestellt. Dazu gehören eine konzentrierte Lösung des gereinigten Membranproteins und Lipid zur Herstellung der Wirtsmatrix, üblicherweise Monooleat, um das Lipid deutlicher sichtbar zu machen.

In diesem Video wurde es mit rot gefärbten Fällungslösungen, Reinwasserleitungs-Pipettiergeräten und Einwegspitzen sowie einer Auswahl gastdichter Hamilton-Spritzen, von denen einige mit abnehmbaren Nadeln ausgestattet sind, einem dünnwandigen Kupplungsstück zum Mischen der Proteinlösung mit dem Lipid zur Herstellung der Mease, einem wiederholenden Dosierer von Hamilton, Glasobjektträgern und Deckgläsern, idealerweise silanisierter perforierter Doppelseiten-Klebespacerfolie zur Erstellung von Vertiefungen, Pinzette, Eiswürfeln, Tüchern und einem Taschenrechner sowie, am wichtigsten, Ihrem Laborbuch versehen.

Das folgende Verfahren dient zur Herstellung einer Kristallisationsplatte aus Glasplättchen. Zum Befüllen legen Sie eine silanisierte Objektträgerplatte auf die Arbeitsfläche. Entfernen Sie die Schutzpapierschicht von einer Seite eines Streifens perforierten doppelseitigen Klebeband-Abstandhalters.

Legen Sie das Klebeband mit der klebrigen Seite nach unten auf die Oberfläche des Objektträgers und drücken Sie es fest an. Versiegeln Sie das Klebeband auf dem Objektträger. Um die Basis der Vertiefungen zu schützen, kann zwischen das Klebeband und die Walze eine Rolle oder ein Aluminiumfolie gelegt werden.

Entfernen Sie die zweite Papierschutzfolie vom Klebeband, um die obere klebrige Oberfläche freizulegen. Dieses Verfahren erzeugt eine Glasplatte, die sofort nach Abschluss des Beladens zum Abdecken bereit ist. Platzieren Sie einzelne silanisierte Deckgläser in unmittelbarer Nähe zur Platte, um eine schnelle und effiziente Abdeckung der Vertiefungen zu ermöglichen.

Stellen Sie das Lipid drei Minuten lang in einen temperaturgeregelten Block bei 45 Grad Celsius, um es zu verflüssigen. Beachten Sie, dass das verwendete Lipid in der Regel Mono Land ist. In diesem Video wurde dem Lipid ein roter Farbstoff zugesetzt, um die Sichtbarkeit während des Schmelzvorgangs zu verbessern.

Bereiten Sie zwei gasdichte Hamilton-Spritzen mit je 100 Mikroliter für den Schritt zur Lipid-Protein-Mischung vor und entfernen Sie das Teflon-Fettöl aus der Spritze, die die Proteiniösung enthalten wird. Stellen Sie die Spritze, die das Lipid aufnehmen soll, daneben. In diesem Fall verbleibt das FAL an Ort und Stelle.

Platzieren Sie den Schlauchadapter mit engem Durchmesser zwischen die beiden Spritzen und verbinden Sie anschließend den Adapter mit dem Spritzenhalter für die Lipidspritze. Ziehen Sie den Adapter an der Spritze fest, übertreiben Sie das Anziehen jedoch nicht. Entfernen Sie den Kolben aus dem Zylinder der Lipidspritze.

Stellen Sie sicher, dass das Lipid geschmolzen ist. Stellen Sie die Pipette auf 30 Mikroliter ein und saugen Sie langsam 30 Mikroliter geschmolzenes Lipiddeckel auf. Das Lipidfläschchen.

Das Lipid sollte unter Stickstoff oder Argon bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden. Langsam so viel geschmolzenes Lipid wie möglich in das offene Ende der Spritze einfüllen. Dabei darauf achten, keine Luftblasen einzuschließen.

Bringen Sie den Kolben in den Zylinder ein, sodass er mit dem geschmolzenen Leoparden in Kontakt steht, und bewegen Sie den Kolben langsam nach oben, während die Spritze senkrecht gehalten wird. Wie gezeigt, steigt die versehentlich eingeschlossene Luftblase während des Vorgangs auf und entweicht. Nun befindet sich ein Pfropfen aus geschmolzenem Lipid im Zylinder, dessen Volumen Sie genau bestimmen müssen.

Dies kann durch Ablesen der Markierungen am Spritzenzylinder erfolgen. In diesem Fall beträgt das Volumen 23 Mikroliter, das im Laborbuch vermerkt wird. Schieben Sie das Fell auf die Nadel, die sich vom Kupplungselement erstreckt.

Verwenden Sie den Kolben, um die geschmolzene Lipidsubstanz durch den Zylinder nach oben und langsam und vorsichtig in die Nadel im Inneren des Kupplungsstücks zu drücken. Wenn die Nadel leicht überfüllt ist, wird man sehen, wie die Lipidsubstanz an ihrem offenen Ende hervorquillt. Durch leichtes Zurückziehen des Kolbens kann das überschüssige Lipid in das Kupplungsstück zurückgezogen werden, bis es bündig mit der Spitze der Nadel im Kupplungsstück abschließt.

In diesem Fall ist die Spritzenkupplungseinheit vollständig beladen und bereit, mit der Proteinspritze verbunden zu werden. Die Lösung sollte bei 14.000 G für 10 min, fünf bis 10 Minuten bei vier Grad Celsius, zentrifugiert werden, um große Aggregate zu entfernen. Vor dem Einrichten der Kristallisationsversuche sollte die Proteinsolution aus dem Eisbehälter genommen und auf Raumtemperatur ausgeglichen werden.

Berechnen Sie das Volumen des Proteins, das verwendet werden muss, um die kubische Phase bei oder nahe der vollständigen Hydratation bei 20 Grad Celsius zu bilden. Die vollständige Hydratation mit Wasser erfolgt bei etwa 40 Gewichtsprozent Wasser, wie im Phasendiagramm dargestellt. Beachten Sie, dass die Lipidspritze mit 23 Mono bei einer Dichte von 0,94 Milligramm pro Mikroliter beladen wurde.

Dies entspricht 21,6 Milligramm Lipid, daher werden 21,6 mal vier geteilt durch sechs oder 14,4 Milligramm bzw. 14,4 Mikroliter Proteinslösung benötigt. Mit einer 25- oder 50-Mikroliter-Hamilton-Spritze wird das erforderliche Volumen der Proteinslösung aufgenommen, die Lösung auf die Teflonspitze des Kolbens im Zylinder der Proteinslösung überführt. Unter sorgfältiger Vermeidung von Luftblasen wird die Nadel vorsichtig zurückgezogen und das Volumen der Proteinslösung in der Spritze gemessen. Es sollte dem im vorherigen Schritt berechneten Wert entsprechen.

Zur Vorbereitung auf die Kombination mit der lipidgefüllten Spritze. Bewegen Sie die Proteiniösung vorsichtig im Zylinder nach oben, sodass sie bündig mit dem offenen Ende abschließt. Dies kann beobachtet werden, indem man durch das Ende des Zylinders hindurchschaut.

Die Lipin-Proteiniösung, die beladenen Spritzen sind nun bereit, kombiniert zu werden, um die Herstellung von Mex vorzubereiten. Dazu die Proteinspritze in das offene Ende des an der Lipidspritze befestigten Kopplers einschrauben. Nachdem die beiden Spritzen über den Koppler verbunden wurden, sollte ein kontinuierliches Flüssigkeitsvolumen von dem Lipid in der einen Spritze über den Koppler bis zur Proteiniösung in der anderen Spritze vorhanden sein.

Zur Vorbereitung des Mischvorgangs wird die montierte Einheit mit einer Spritze in der rechten Hand und der anderen in der linken gehalten. Auf beide Spritzenkörper wird über den Kupplungsadapter Drehmoment ausgeübt, wobei die Finger und Daumen beider Hände verwendet werden, um sicherzustellen, dass die Abdichtung gegen die Rillen im Kupplungsadapter auch beim Anziehen intakt bleibt. Die montierte Mischeinrichtung kann in diesem Stadium die ALS beschädigen, und unzureichendes Anziehen führt ebenfalls zu Leckagen.

Es handelt sich um eine Frage der Erfahrung, die mit unvermeidlichen Versuchen und Fehlern sowie gelegentlichem Probenverlust einhergeht. Daher lohnt es sich, zunächst mit Lipid und Wasser oder Pufferlösung zu üben, um ein Gefühl für das System zu bekommen, bevor wertvolle Proteinsolution verwendet wird, um die Mischung herbeizuführen. Drücken Sie den Kolben auf der Proteinsite der zusammengesetzten Mischeinheit mit dem Daumen oder Zeigefinger bis an die Grenze vor, wodurch die Proteinsolution aus der Proteinspritze über den Kuppler in die Lipidspritze gedrückt wird. Falls die Einheit wirksam abgedichtet wurde, führt diese Aktion zu einer gleich großen, entgegengesetzten Bewegung des Kolbens auf der Lipidseite.

Der Kolben auf der Lipidseite wird nun verwendet, um den Inhalt der Lipidspritze erneut durch den Kolben und zurück in die Proteinspritze zu drücken. Dieser Vorgang wird mehrere Male wiederholt. Gelegentlich sind hundert Durchläufe oder mehr erforderlich, um eine homogene Mischaufschüttung zu erzeugen.

Zu Beginn des Mischvorgangs kann die Bewegung des Materials hin und her durch den Kuppler ungleichmäßig sein, und gelegentlich ist zusätzliche Kraft erforderlich, um das Mischen zu bewirken. Dies ist zu erwarten. Das anfängliche Mischen geht gewöhnlich mit der Bildung einer nicht gleichmäßigen Trübung in der Probe einher, was ebenfalls erwartet wird.

Während die Homogenisierung fortschreitet, wird die Textur, wie sie durch die Kraft spürbar ist, die erforderlich ist, um die Kolben hin und her zu bewegen, zunehmend einheitlich und charakteristisch für die viskose kubische Phase, ebenso wie das visuelle Erscheinungsbild der entstehenden kubischen Phase. Unter geeigneten Bedingungen und bei Bildung der kubischen Phase sollte die Dispersion im Spritzenzylinder optisch transparent erscheinen.

Daher sollten die Markierungen auf dem Spritzenzylinder durch die Meso-Phase im Zylinder deutlich lesbar sein. Im Fall gefärbter Proteine weist die Meso-Phase die Farbe des Proteins auf, ist jedoch optisch transparent. Eine sehr leichte Abkühlung der Probe während des Mischvorgangs, indem der Spritzenmischer für kurze Zeit auf Eis gestellt wird, kann die Homogenisierung und das Erreichen der Transparenz beschleunigen.

Allerdings ist es wichtig, die Probe nicht zu stark zu belasten; es sollte darauf geachtet werden, eine äußerst heftige Vermischung zu vermeiden, da diese eine Erhöhung der Probentemperatur aufgrund von Reibungserwärmung verursachen kann. An diesem Punkt wurde die kubische Mischphase gebildet und das Protein in die Lipiddoppelschicht reinkorporiert. Die Mischphase ist nun bereit zur Verteilung in die einzelnen Vertiefungen der Kristallisationsplatten.

Zunächst muss die mesogene Phase jedoch in eine 10-Mikroliter-Hamilton-Spritze überführt werden, die an einem Wiederholungsdispenser montiert ist. Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie die Spritze mit dem Dispenser verbinden. Füllen Sie die Spritze mit der kubischen Mesphase.

Entfernen Sie die Nadel und den Kolben aus der Spritze. Lassen Sie den Teflonstößel an seiner Stelle. Entfernen Sie die Sicherungsmutter vom Spender mit Hilfe einer kleinen Münze.

Bei vollständig zurückgezogenem Ratschenarm wird die Spritze ohne Kolben und Nadel durch den Haltering des Spenders geschoben. Die Haltemutter wird mit der Dichtungsseite zur Spritze ausgerichtet und fest auf das offene Ende der Spritze geschraubt.

Es ist darauf zu achten, dass die Spritze korrekt in dem Haltering zentriert ist und dass der Zylinder parallel zum Ratschenarm ausgerichtet ist. Beides kann man visuell überprüfen. Diese beiden Voraussetzungen sind wichtig, da andernfalls der Kolben nicht frei laufen kann und während des Befüllens ein Druck in der Quellspritze aufbauen kann, was zu Leckagen führen kann. Führen Sie den Kolben durch den Haltering mit der Greifermutter, die einige Umdrehungen gelockert ist, und leiten Sie den Kolben in das offene Ende der Spritze ein.

Drücken Sie den Ratschenarm vollständig, um den Kolben in den Zylinder zu bewegen, und prüfen Sie, ob er sich frei und vollständig innerhalb des Zylinders bewegt. Falls die Schraube und die Führungsschiene gelockert wurden, ziehen Sie diese erneut fest und überprüfen Sie erneut, ob sich der Kolben frei bewegt. Die Dosierspritze ist nun betriebsbereit und kann befüllt werden.

Bewegen Sie den Kolben auf einer Seite der montierten Mischvorrichtung bis zur Null-Mikroliter-Markierung. Um die Mesophase in die andere Spritze und in den Kuppler zu überführen. Trennen Sie die leere Spritze mit UL an Ort und Stelle von der Mischvorrichtung und schließen Sie unmittelbar die befüllte Spritze mit dem Kuppler an das Gewindeende der 10-Mikroliter-Dosierspritze an.

Der Grad der Dichtheit, mit der die Kupplung erfolgt, ist entscheidend. Wie bereits erwähnt, wird die Dosierspritze gefüllt, indem der Kolben der 100-Mikroliter-Spritze niedergedrückt wird, sodass die Mesophase durch die Kupplung übertritt. Wenn die Kupplung dicht ist und der Kolben in der Dosierspritze sich frei bewegen kann, sollte sich der Kolben in Richtung der Bewegung des Ladekolbens bewegen, während die Dosierspritze sich füllt.

Trennen Sie die Ladespritze mit dem angebrachten Kupplungsstück von der Dosierspritze. Befestigen Sie eine kurze Nadel mit flacher Spitze an der metallischen Endverbindung der Dosierspritze und ziehen Sie sie vorsichtig fest. Klemmen Sie den Kolben an den Ratchenarm, indem Sie den Knoten im Greifring festziehen.

Es sollte darauf geachtet werden, den Knoten nicht übermäßig festzuziehen, da dies den Kolben beschädigen und verformen kann, wodurch er unbrauchbar wird. Es ist wichtig, dass der Bewegungsbereich, der dem Ratschenarm im festgeklemmten Zustand zur Verfügung steht, auf nicht mehr als einen Zoll begrenzt ist.

Wie oben dargestellt, neigt der Kolben dazu, sich zu verbiegen, und die Abgabe kann fehlschlagen. Drücken Sie die Ratschentrommel mehrmals nach unten, um den Kolben im Zylinder voranzubewegen, wodurch das Totvolumen der Nadel gefüllt und die Nadel beladen wird. Dieser Schritt sollte bis zu 10-mal wiederholt werden, bis ein durchgehender Faden der Mesa-Phase aus der Nadelspitze austritt.

Die Nadel ist nun bereit für die Einrichtung von Kristallisationsversuchen, die unmittelbar beginnen sollten. Es ist nicht ratsam, die mit Protein beladene kubische Phase zu lange aufzubewahren, bevor die Kristallisationsversuche durchgeführt werden. Da einige Proteine in der kubischen Phase ohne zugesetztes Präzipitans instabil sind, stellen Sie eine Mehrfach-Well-Kristallisationsplatte und einen Deckglaser auf eine um einige Zoll über die Bank erhöhte Oberfläche, um das Beladen zu erleichtern.

Ein optimaler Kontrast und eine verbesserte Sichtbarkeit werden erreicht, wenn die Oberfläche leicht dunkel ist. Homogenisieren Sie die Präzipitationsmittel-Lösungen und öffnen Sie die Gefäße. Stellen Sie die Präzipitationsmittel-Dosierpipette auf einen Mikroliter ein, wobei die Dosierspritze senkrecht in einer Hand gehalten wird; verwenden Sie die freie Hand, um die Nadelspitze mittig und direkt über dem Boden des Wells zu positionieren.

Nummer eins. Drücken Sie die Taste am Dispen des Wiederholungsdispensers, um einen Bolus von Mease auf die Glasoberfläche abzugeben. Das Bolusvolumen beträgt 200 Nanoliter.

Wenn der standardmäßige Wiederholungsdispenser mit einer 10-Mikroliter-Spritze verwendet wird, sollte die Nadelspitze nicht mehr als einige hundert Mikrometer über dem Boden der Vertiefung liegen. Um eine korrekte und reproduzierbare Applikation sicherzustellen, ist dies leicht erreichbar. Es erfordert lediglich etwas Übung. Nachdem die vier benachbarten Vertiefungen mit Mease beladen wurden, geben Sie einen Mikroliter Präzipitationslösung auf jeden Mease-Tropfen.

Platzieren Sie mithilfe von zwei Mikrolitern pro Patrone und standardmäßigen Einwegspitzen so schnell wie möglich einen Deckgläsern genau über die gefüllten Vertiefungen, um sie gleichmäßig abzudecken und eine wasserdichte Abdichtung zu erzielen. Verwenden Sie einen Spatel, um Druck auf das Deckglas an der Stelle auszuüben, an der es mit der freiliegenden klebrigen Oberfläche des Abstandsklebebands in Kontakt steht. Der Vorgang des Auftragens von Mease und Präzipitant kann wiederholt werden, bis alle Vertiefungen der Platte befüllt und versiegelt sind.

Die Platte ist nun bereit zur Untersuchung und zum Inkubieren. Beschriften Sie die Platte zur besseren Nachverfolgung deutlich. Lichtempfindliche Proteine werden üblicherweise dadurch gehandhabt, dass die Platten vor dem Einbringen in die Inkubationskammer mit Aluminiumfolie umwickelt werden.

Diese können entfernt und unter dem Mikroskop bei abgedunkeltem oder geeignet gefärbtem Licht untersucht werden. Stellen Sie die Platten in eine temperaturgeregelte Kammer, üblicherweise bei etwa 20 Grad Celsius, in regelmäßigen Abständen. Untersuchen Sie die Wände auf Kristallwachstum mit einem polarisierten Lichtmikroskop mit 10- oder 20-facher Vergrößerung.

Zielsetzung, der im Labor der Autoren verwendete Zeitplan sieht wie folgt aus: Tag 0, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 21, 30 nach Set. Untersuchen Sie den Mease-Bolus sorgfältig. Passen Sie die Fokustiefe innerhalb der 140 Mikrometer dicken Probe an.

Die Untersuchung sollte sowohl im normalen Licht als auch zwischen gekreuzten Polarisatoren durchgeführt werden: farblose Membranproteinkristalle, die in der kubischen Phase wachsen, sehen im normalen Licht wie folgt aus. Farblose Membranproteinkristalle, die in Meso wachsen, sehen im polarisierten Licht wie dies oder dies aus; natürlich gefärbte Membranproteine, die in Meso wachsen, sehen im normalen Licht wie dies oder dies aus.

Die nächsten Schritte im Gesamtverfahren der Strukturaufklärung bestehen darin, die Kristalle zu gewinnen und kryogenisch abzukühlen sowie Röntgenbeugungsdaten von ihnen aufzuzeichnen und zu verarbeiten. Diese Themen werden in separaten JoVE-Artikeln dieser Reihe behandelt.