Von Konstrukten Crystals - Auf dem Weg zu Strukturbestimmung von β-Fass-Außenmembranproteine

Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, Milligramm-Mengen von äußeren Membran-Beta-Fass-Proteinen zu erhalten, die kristallisieren und diffraktieren können. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Faltung und des Transports von Membranproteinen zu beantworten, beispielsweise wie Beta-Fass-Proteine in Zellmembranen eingebaut werden. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt in ihrer Robustheit gegenüber Beta-Fass-Proteinen.

Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten, da die Auswahl der Detergenzien für die Reinigung, Kristallisation und Defraktion herausfordernd ist. Jeremy Guerin, ein Postdoktorand aus dem Labor von Susan Buchanan, wird das Verfahren demonstrieren, zusätzlich zu mir selbst und Kollegen im Labor. Beginnen Sie dieses Verfahren mit dem Aufbau eines T7-Expressionsvektors, der das kodonoptimierte Gen für das Ziel-Oberflächenmembranprotein oder OMP-Gen enthält, zur in vivo-Expression in die Membran, wie im Textprotokoll beschrieben.

Transformieren Sie das Konstrukt in einen Expressionsstamm von Bakterien, indem Sie ein Mikroliter Plasmid in 50 Mikroliter chemisch kompetente BL21(DE3)-Zellen pipettieren und vorsichtig durch Auf- und Abpipettieren mischen. Inkubieren Sie 30 Minuten auf Eis. Nach der Inkubation erfolgt ein Hitzeschock bei 42 Grad Celsius für 30 Sekunden in einem Wasserbad, danach wird die Probe für eine Minute zurück auf Eis gestellt.

Geben Sie ein Milliliter vorgewärmtes SOC-Medium hinzu und schütteln Sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius mit 1000 U/min in einem schüttelnden Inkubator. Nach der Inkubation impfen Sie 100 Mikroliter der Zellen auf LB-Agar-Platten mit einem geeigneten Antibiotikum aus und inkubieren sie über Nacht bei 37 Grad Celsius verkehrt herum. Führen Sie anschließend Expressions-Testansätze im kleinen Maßstab durch, indem Sie fünf Milliliter LB-Medium mit Antibiotikum mit einer einzelnen Kolonie beimpfen.

Wiederholen Sie dies für fünf bis 10 Kolonien. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius unter Schütteln, bis eine optische Dichte bei 600 Nanometern von etwa 0,6 erreicht ist. Induzieren Sie die Expression des Ziel-OMP, indem Sie fünf Mikroliter einer einmolarigen IPTG-Lösung zu jedem Kulturrohr hinzufügen, und lassen Sie die Kulturen weitere eine bis zwei Stunden wachsen.

Um die Expressionslevel aller Kolonien zu vergleichen, zentrifugieren Sie ein Milliliter jeder Kultur eine Minute lang bei 15.000 × g mithilfe einer Mikrozentrifuge. Entfernen Sie das Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 200 Mikroliter 1× SDS-PAGE-Ladepuffer. Erhitzen Sie die Probe fünf Minuten lang auf 100 °C und zentrifugieren Sie erneut fünf Minuten lang bei 15.000 × g.

Analysieren Sie die Proben mittels SDS-PAGE, indem Sie 20 Mikroliter in jedes Loch eines zehnprozentigen Gels pipettieren. Laufen Sie das Gel 35 Minuten lang bei konstanten 200 Volt. Schließlich gewinnen Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 6000 × g für zehn Minuten.

Suspendieren Sie die Zellen in Puffer zur Zelllyse im Verhältnis von fünf Milliliter pro Gramm Zellpaste. Lyse die Zellen mithilfe einer French-Press oder eines Zellhomogenisators. Anschließend werden die lysierten Zellen bei vier Grad Celsius 30 Minuten lang mit 15.000 × g zentrifugiert, um unlysierte Zellen und Zelltrümmer zu entfernen.

Überführen Sie das Überstand in ein sauberes Gefäß und zentrifugieren Sie erneut eine Stunde lang mit hoher Geschwindigkeit bei vier Grad Celsius. Das erhaltene Pellet ist der Membrananteil, der das Protein von Interesse enthält. Resuspendieren Sie den Membrananteil unter Verwendung eines Dounce-Homogenisators.

Zunächst die Membranen übertragen und dann Solubilisierungspuffer in 2X-Konzentration ohne Detergens hinzufügen. Die resuspendierten Membranen in einen Messzylinder gießen und Wasser hinzufügen, bis eine Endkonzentration von 1X Solubilisierungspuffer erreicht ist. Die Probe in ein Becherglas überführen und Detergens langsam bis zu einer Endkonzentration von etwa 10-facher kritischer Mizellenkonzentration zugeben.

Anschließend 0,5 bis 16 Stunden bei vier Grad Celsius umrühren, abhängig davon, wie leicht das Zielprotein aus den Membranen extrahiert werden kann. Abschließend die solubilisierte Probe eine Stunde lang bei vier Grad Celsius mit 300.000 × g zentrifugieren. Eine IMAC-Säule mit einem Volumen von ein bis fünf Milliliter vorbereiten oder eine vorgepackte Säule verwenden.

Führen Sie nachfolgende Chromatographieschritte bei vier Grad Celsius durch. Spülen Sie mit Wasser, um Rückstände von Konservierungsstoffen zu entfernen. Wenn ein automatisiertes Reinigungssystem verwendet wird, installieren Sie die Säule gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Stellen Sie 500 Milliliter IMAC-Puffer A ohne Imidazol und 250 Milliliter IMAC-Puffer B mit einmolarer Imidazollösung her. Puffern Sie die IMAC-Säule mit 10 Säulenvolumina IMAC-Puffer A. Geben Sie Imidazol zur Proteinpulverprobe hinzu, um eine Endkonzentration von 25 Millimolar zu erreichen, und mischen Sie gründlich. Laden Sie die Probe anschließend mit einer Geschwindigkeit von zwei Milliliter pro Minute auf die gepufferte IMAC-Säule auf.

Sammlen Sie den Durchlauf. Waschen Sie die IMAC-Säule anschließend mit jeweils fünf Säulenvolumina ansteigender Konzentrationen an Imidazol unter Verwendung von Puffer B. Sammeln Sie die Waschfraktionen in 2-Milliliter-Aliquote. Eluieren Sie die Probe mit einer Endkonzentration von 250 Millimolar über fünf Säulenvolumina und sammeln Sie die eluierte Probe in 2-Milliliter-Fraktionen.

Analysieren Sie das Durchflussvolumen, die Waschfraktionen und die Elutionsfraktionen mittels SDS-PAGE-Analyse basierend auf ihrer Absorption bei 280 Nanometern. Vereinigen Sie die Fraktionen, die das gewünschte Beta-Fass-Omp enthalten, wie durch SDS-PAGE-Analyse bestätigt. Entfernen Sie anschließend den 6X-Histidin-Tag, indem Sie TEV-Protease zur vereinigten Probe hinzufügen und diese über Nacht bei vier Grad Celsius unter leichtem Schütteln inkubieren.

Laden Sie die Probenprotease-Lösung erneut auf eine IMAC-Säule, um das Ziel-Beta-Fass-Membranprotein von den abgespaltenen Tags und nicht gespaltenen Anteilen zu trennen. In der Durchflussfraktion befindet sich die gespaltene Probe ohne Tag. Zum Vorbereiten der Kristallisation wird die Probe auf eine Gelfiltrationssäule in einem Puffer aufgetragen, der das für die Kristallisation verwendete Detergens enthält.

Sammeln Sie Fraktionen zu je einem Milliliter und analysieren Sie diese mittels SDS-PAGE basierend auf ihrer Absorption bei 280 Nanometern. Vereinigen Sie die Fraktionen, die das Zielprotein enthalten, und konzentrieren Sie diese anschließend auf etwa 10 Milligramm pro Milliliter. Bevor Sie die Proben vorbereiten, bauen Sie die Gelelektrophoreseapparatur zusammen.

Verwenden Sie vorab gekühlten Elektrophoresepuffer oder führen Sie die Gelelektrophorese im Kühlraum durch. Filtern Sie die Probe mithilfe eines 0,22-Mikrometer-Zentrifalfilters, um Partikel und Ausfällungen zu entfernen. Danach pipettieren Sie 0,25 Mikroliter der Probe in zwei 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Bezeichnen Sie eine als „gekocht“ und die andere als „RT“. Geben Sie anschließend 9,75 µL Puffer für die Probenpräparation in jedes Röhrchen und mischen Sie durch Pipettieren. Fügen Sie beiden Proben außerdem jeweils 10 µL 2X SDS-Lade-Puffer hinzu und mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren. Erhitzen Sie die Probe „gekocht“ fünf Minuten lang auf 95 °C, während die Probe „RT“ bei Raumtemperatur belassen wird.

Dann kurz die gekochte Probe zentrifugieren. Anschließend 20 Mikroliter beider Proben auf das vormontierte native Gel laden. Nach dem Laufen des Gels 60 Minuten lang bei konstanten 150 Volt das Gel entfernen und in Färbelösung geben, um die Ergebnisse sichtbar zu machen.

Fahren Sie mit Kristallisationsversuchen in Detergens, Bi-Zellen und lipidischer kubischer Phase unter Verwendung zuvor veröffentlichter JoVE-Methoden fort. Kristallisationsansätze werden unter einem UV-Mikroskop untersucht, um zu überprüfen, ob es sich bei den Kristallen tatsächlich um Protein und nicht um gelöste Lipide oder Detergens handelt. Führende Kristalle werden entweder an einer Laborquelle oder an einem Synchrotron untersucht, um festzustellen, ob die Kristalle diffraktieren.

Nach der Datensammlung von Kristallen mit guter Beugung werden die Daten mit einer Verarbeitungssoftware wie HKL2000 verarbeitet. Die resultierenden Dateien werden in eine Software-Suite zur Strukturbestimmung, beispielsweise Phoenix Suit, übertragen, und ein molekularer Ersatz für die initiale Phasenbestimmung und Strukturaufklärung durchgeführt. Die Kristallstruktur von YIUR wurde mit einer Auflösung von 2,6 Å mit dieser Methode bestimmt.

Wenn man diese Technik einmal beherrscht, kann sie in zwei Wochen durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie bakterielle äußere Membranproteine für strukturelle Untersuchungen exprimiert und gereinigt werden können.