Von Konstrukten Crystals - Auf dem Weg zu Strukturbestimmung von β-Fass-Außenmembranproteine

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, Milligramm-Mengen an Beta-Fass-Proteinen der äußeren Membran zu erhalten, die kristallisieren und defraktieren. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Faltung und des Transports von Membranproteinen zu beantworten, z. B. wie Beta-Fass-Proteine in Zellmembranen eingefügt werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie robust für Beta-Barrel-Proteine ist.

Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da die Auswahl der Reinigungsmittel für die Reinigung, Kristallisation und Zerlegung eine Herausforderung darstellt. Jeremy Guerin, ein Postdoc aus dem Labor von Susan Buchanan, wird das Verfahren demonstrieren, neben mir und meinen Kollegen im Labor. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Konstruktion eines T7-Expressionsvektors, der das Codon-optimierte Ziel-Außenmembranprotein (OMP-Gen) für die In-vivo-Expression auf der Membran enthält, wie im Textprotokoll beschrieben.

Verwandeln Sie das Konstrukt in einen Expressionsstamm von Bakterien für die Expression, indem Sie einen Mikroliter Plasmid in 50 Mikroliter BL21(DE3)-chemisch kompetente Zellen pipettieren und vorsichtig mischen, indem Sie auf und ab pipettieren. 30 Minuten auf Eis inkubieren. Nach der Inkubation mit einem Wasserbad 30 Sekunden lang bei 42 Grad Celsius erhitzen und dann für eine Minute wieder auf Eis legen.

Fügen Sie einen Milliliter vorgewärmtes SOC-Medium hinzu und schütteln Sie es eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius bei 1000 U/min mit einem Tischschüttel-Inkubator. Nach der Inkubation werden 100 Mikroliter Zellen auf LB-Agar-Platten mit einem geeigneten Antibiotikum aufgefüllt und über Nacht bei 37 Grad Celsius invertiert. Führen Sie als Nächstes Expressionstests in kleinem Maßstab durch, indem Sie fünf Milliliter LB, die eine Antibiotikakultur enthalten, mit einer einzigen Kolonie beimpfen.

Wiederholen Sie dies für fünf bis 10 Völker. Wachsen Sie bei 37 Grad Celsius mit Schütteln auf eine optische Dichte bei 600 Nanometern von etwa null Komma sechs. Induzieren Sie die Expression des Ziel-OMP, indem Sie fünf Mikroliter eines molaren IPTG in jedes Kulturröhrchen geben und ein bis zwei Stunden weiter wachsen lassen.

Um die Expressionsniveaus für alle Kolonien zu vergleichen, zentrifugieren Sie einen Milliliter jeder Kultur eine Minute lang bei 15.000 Mal G mit einer Mikrozentrifuge. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 200 Mikrolitern 1X SDS-PAGE Ladepuffer. Fünf Minuten lang auf 100 Grad Celsius erhitzen und dann erneut fünf Minuten lang bei 15.000 G zentrifugieren.

Analysieren Sie die Proben mit SDS-PAGE, indem Sie 20 Mikroliter eines zehnprozentigen Gels in jede Vertiefung pipettieren. Lassen Sie das Gel 35 Minuten lang bei konstanten 200 Volt laufen. Zum Schluss ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 6000 mal G für zehn Minuten.

Resuspendieren Sie die Zellen in Lysepuffer in einem Verhältnis von fünf Millilitern pro Gramm Zellpaste. Lysieren Sie die Zellen mit einer French Press oder einem Zellhomogenisator. Dann drehen Sie die lysierten Zellen 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 15.000 Mal G, um unlysierte Zellen und Zelltrümmer zu entfernen.

Den Überstand in ein sauberes Röhrchen umfüllen und erneut eine Stunde lang bei hoher Geschwindigkeit bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Das resultierende Pellet ist die Membranfraktion, die das interessierende Protein enthält. Mit einem Dounce Homogenisator wird die Membranfraktion resuspendiert.

Übertragen Sie zuerst die Membranen und fügen Sie dann Solubilisierungspuffer in 2-facher Konzentration ohne Detergens hinzu. Gießen Sie die resuspendierten Membranen in einen Messzylinder und fügen Sie Wasser hinzu, bis eine Endkonzentration von 1X Solubilisierungspuffer erreicht ist. Die Probe wird in ein Becherglas umgefüllt und das Detergens langsam bis zu einer Endkonzentration von etwa dem 10-fachen der kritischen Mizellenkonzentration zugegeben.

Rühren Sie dann 0,5 bis 16 Stunden bei vier Grad Celsius, je nachdem, wie leicht das Zielprotein aus den Membranen extrahiert wird. Zum Schluss zentrifugieren Sie die solubilisierte Probe eine Stunde lang bei 300.000 mal G bei vier Grad Celsius. Bereiten Sie eine IMAC-Säule von ein bis fünf Millilitern vor oder verwenden Sie eine vorgepackte Säule.

Führen Sie nachfolgende Chromatographieschritte bei vier Grad Celsius durch. Mit Wasser spülen, um alle Spuren von Konservierungsstoffen zu entfernen. Wenn Sie ein automatisiertes Reinigungssystem verwenden, installieren Sie die Säule gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Bereiten Sie 500 Milliliter IMAC-Puffer A ohne Imidizol und 250 Milliliter IMAC-Puffer B mit einem molaren Imidizol vor. Die IMAC-Säule wird mit 10 Säulenvolumina des IMAC-Puffers A äquilibriert. Imidizol wird der Proteinprobe bis zu einer Endkonzentration von 25 Millimolar zugegeben und gemischt. Laden Sie dann die Probe mit zwei Millilitern pro Minute auf die äquilibrierte IMAC-Säule.

Sammeln Sie den Durchfluss. Waschen Sie anschließend die IMAC-Säule mit jeweils fünf Säulenvolumina mit steigenden Konzentrationen von Imidizol unter Verwendung von Puffer B. Sammeln Sie die Waschgänge in zwei Milliliterfraktionen. Eluieren Sie die Probe mit einer Endkonzentration von 250 Millimolar für fünf Säulenvolumina und sammeln Sie die eluierte Probe in zwei Milliliterfraktionen.

Analysieren Sie den Durchfluss, die Waschfraktionen und die Elutionsfraktionen mit der SDS-PAGE-Analyse basierend auf ihrer Extinktion bei 280 Nanometern. Fassen Sie die Fraktionen zusammen, die das Ziel-Beta-Barrel-OMP enthalten, das durch SDS-PAGE-Analyse verifiziert wurde. Entfernen Sie dann den 6X-Histadin-Tag, indem Sie der gepoolten Probe TEV-Protease hinzufügen und über Nacht bei vier Grad Celsius unter leichtem Schaukeln inkubieren.

Laden Sie die Proteaselösung der Probe erneut auf eine IMAC-Säule, um das Ziel-Beta-Fass-OMP von den gespaltenen Tags und allen ungespaltenen Proben zu trennen. Der Durchfluss enthält die gespaltene Probe, bei der das Etikett fehlt. Zur Vorbereitung der Kristallisation wird die Probe auf eine Gelfiltrationssäule in einen Puffer geladen, der das für die Kristallisation zu verwendende Detergens enthält.

Sammeln Sie Ein-Milliliter-Fraktionen und analysieren Sie sie mit der SDS-PAGE-Analyse auf der Grundlage ihrer Extinktion bei 280 Nanometern. Mischen Sie die Fraktionen, die das Zielprotein enthalten, und konzentrieren Sie dann auf etwa 10 Milligramm pro Milliliter. Vor der Probenvorbereitung das Gelgerät zusammenbauen.

Verwenden Sie einen vorgekühlten Gel-Laufpuffer oder lassen Sie das Gel im Kühlraum laufen. Filtrieren Sie die Probe mit einem 0,22-Mikron-Zentrifugalfilter, um Partikel und Niederschläge zu entfernen. Pipettieren Sie dann 0,25 Mikroliter der Probe in zwei 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Beschriften Sie eines als gekocht und das andere als RT. Geben Sie anschließend 9,75 Mikroliter des Probenpuffers in jedes Röhrchen und mischen Sie es durch Pipettieren. Zu beiden Proben werden zusätzlich 10 Mikroliter 2X SDS-Ladepuffer hinzugefügt und durch Pipettieren vorsichtig gemischt. Die gekochte Probe wird fünf Minuten lang bei 95 Grad Celsius gekocht, während die RT-Probe bei Raumtemperatur belassen wird.

Dann die gekochte Probe kurz drehen. Laden Sie als Nächstes 20 Mikroliter beider Proben auf das vormontierte native Gel. Nachdem Sie das Gel 60 Minuten lang bei konstanten 150 Volt laufen gelassen haben, entfernen Sie das Gel und weichen Sie es in Färbelösung ein, um die Ergebnisse zu visualisieren.

Fahren Sie mit Kristallisationsversuchen in Detergens-, Bizellen- und Lipid-Kubic-Phase unter Verwendung zuvor veröffentlichter Jove-Methoden fort. Kristallisationsköpfe werden unter einem UV-Mikroskop visualisiert, um zu überprüfen, ob es sich bei den Kristallen tatsächlich um Proteine und nicht um gelöste Lipide oder Detergenzien handelt. Bleikristalle werden mit einer Heimquelle oder am Synchrotron gescreent, um zu sehen, ob die Kristalle defraktieren.

Verarbeiten Sie die Daten nach der Datenerfassung von Kristallen, die gut zerbrechen, mit einer Verarbeitungssoftware, z. B. HKL2000. Übertragen Sie die resultierenden Dateien auf eine Software-Suite zur Strukturbestimmung, wie z. B. Phoenix Suit, und führen Sie einen molekularen Ersatz für die anfängliche Phasenbestimmung und Strukturbestimmung durch. Die Kristallstruktur von YIUR wurde mit dieser Methode mit einer Auflösung von 2,6 Angström bestimmt.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei Wochen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie bakterielle Proteine der äußeren Membran für Strukturstudien exprimiert und gereinigt werden.