Name: Von Konstrukten Crystals - Auf dem Weg zu Strukturbestimmung von β-Fass-Außenmembranproteine (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Lernen Sie die Produktion von β-Fass-Außenmembranproteinen für strukturbiologische Studien. Diese robuste Methode ermöglicht Kristallisation und Röntgenbeugung zur Aufklärung von Membranproteinfaltung.

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Wir möchten Herve Celia vom CNRS für die Bereitstellung der UV-Bilder und Chris Dettmar und Garth Simpson vom Department of Chemistry an der Purdue University für die Bereitstellung der SONICC-Bilder danken. Wir möchten uns für die Finanzierung durch das National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases und das Intramural Research Program an den National Institutes of Health bedanken. Darüber hinaus möchten wir uns für zusätzliche Mittel des National Institute of General Medical Sciences (A.M.S. und C.J.), des National Institute of Allergy and Infectious Diseases (N.N. 1K22AI113078-01) und des Department of Biological Sciences an der Purdue University (N.N.) bedanken.

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

β-Fass OMP dienen wesentliche Rollen in Gram-negativen Bakterien, Mitochondrien und Chloroplasten und sind wichtige Ziele für die Strukturanalyse, die eine Fülle von Informationen über die wesentlichen molekularen Mechanismen, die an den äußeren Membranen dieser jeweiligen Organellen bieten. Jedoch reicht Probe für die Strukturanalyse der Herstellung nicht immer einfach, und daher eine allgemeine Rohrleitung für die Erzeugung von ausreichenden Mengen von Ziel-β-barrel OMPs zur Strukturbestimmung dargestellt, erläutern i...

β-barrel OMPs kann nur in den äußeren Membranen von Mitochondrien, Chloroplasten und Gram-negative Bakterien 1-3 gefunden werden. Während sie ähnliche Rollen wie α-helicalen Proteinen dienen, sie haben eine sehr unterschiedliche Falte, bestehend aus einem zentralen Membran eingebetteten Domäne β-Fass im Bereich 8-26 antiparallelen β-Strängen mit jeder Strang eng mit den beiden benachbarten Stränge verbunden sind, (Figuren 1 und 2). Die ersten und letzten Stränge der β-Faß Domäne dann miteinander, fast ausschließlich in einer antiparallelen Art und Weise (mit Ausnahme der mitochondrialen VDAC) interagieren die β-Fass-Domäne von der umgebenden Membran zu schließen und abzudichten. Alle β-barrel OMPs haben extrazellulären Schleifen unterschiedlicher Sequenz und Länge, die eine wichtige Rolle bei der Liganden-Wechselwirkungen und / oder Protein-Protein-Kontakte spielen, wobei diese Schleifen manchmal so groß wie 75-Reste sind, wie in Neisseria-Transferrin-Bindungs ​​pro gefundentein A (TbpA) 4. β-Fass OMP kann auch N-terminalen oder C-terminalen periplasmatischen Erweiterungen haben , die als zusätzliche Domänen für das Protein die funktionalen Zweck dienen (zB BamA 5-7, FimD 8,9, FadL 10). Während viele Arten von β-Barrel OMP 11 existieren, sind zwei der häufigsten Arten werden im Folgenden als Beispiele für diejenigen , die weniger vertraut mit dem Gebiet beschrieben, (1) TonB-abhängige Transporter und (2) Autotransporter. TonB-abhängige Transporter (zB FepA, TbpA, BTub, Cir, etc.) sind von wesentlicher Bedeutung für die Nährstoff Import und enthalten eine N-terminale Domäne Stecker bestehend aus ~ 150 Reste , die in einem C-terminalen versteckt gefunden wird 22 Strang - β- Fass - Domäne in die äußere Membran 12 (Figur 3) eingebettet ist . Während dieses Plug-Domäne Substrat verhindert, frei durch die Fass-Domäne vorbei, induziert Substratbindung innerhalb der Plug-Domäne eine Konformationsänderung thbei Zuleitungen Bildung (entweder durch Steck Umlagerung oder durch teilweise / vollständige Ausstoßen des Stopfens) zu Pore, die dann Substrattransport durch die äußere Membran in das Periplasma erleichtern kann. TonB-abhängige Transporter sind besonders wichtig für das Überleben einiger pathogener Stämme von Gram-negativen Bakterien, wie Neisseria meningitidis , die spezialisierte Transport entwickelt haben , die Nährstoffe wie Eisen fallen direkt von menschlichen Wirtsproteine ​​4,13,14. Autotransporter gehören der Typ V-Sekretionssystem von Gram-negativen Bakterien und sind ß-barrel OMPs, die aus einem β-Fass-Domäne bestehen (in der Regel 12-Stränge wie bei ESTA und ESPP) und einem Passagierdomäne, die entweder sezerniert oder an die vorgestellte Oberfläche der Zelle 15,16 (Abbildung 3). Diese β-barrel OMPs dienen oft eine wichtige Rolle in der Zellüberlebens und der Virulenz der Passagierdomäne dient entweder als eine Protease, Adhäsin, und / oder andere effector dass vermittelt Pathogenese. Konstruktionsverfahren, wie Röntgenkristallographie, NMR-Spektroskopie und Elektronenmikroskopie (EM) ermöglichen es uns, Modelle für die OMPs mit atomarer Auflösung zu bestimmen, welche wiederum verwendet werden können, genau zu entschlüsseln, wie sie innerhalb der äußeren Membran funktionieren. Diese wertvollen Informationen kann dann gegebenenfalls für Arzneimittel und die Entwicklung von Impfstoffen verwendet werden. Beispielsweise Transferrin - Bindungsprotein A (TbpA) wird auf der Oberfläche von Neisseria gefunden und ist für die Pathogenese erforderlich , da er direkt menschliches Transferrin bindet und extrahiert dann und importiert die Eisen für ihre eigene Überleben. Ohne TbpA kann Neisseria nicht Eisen aus dem menschlichen Wirt binden und sind nicht pathogen gemacht. Nachdem die Kristallstruktur von Transferrin humanen an TbpA gebunden 4 gelöst wurde, wurde es viel deutlicher , wie die beiden Proteine ​​verbunden sind , welche Regionen von TbpA die Wechselwirkung vermittelt, welche Reste für die Eisenextraktion durch TbpA wichtig waren, undwie könnte man Therapeutika gegen Neisseria Targeting TbpA entwickeln. Daher ist die Bedeutung der β-Barrel OMPs in Gram-negativen Bakterien, die für das Überleben und die Pathogenese gegeben, sowie in Mitochondrien und Chloroplasten-Funktion, und die Notwendigkeit für zusätzliche strukturelle Informationen über diese einzigartige Klasse von Membranproteinen und den Systemen, in denen sie funktionieren , allgemeine Protokolle werden mit dem Gesamtziel der Expression und Reinigung Ziel OMP auf hohem Niveau für die Charakterisierung von strukturellen Methoden vorgestellt.

<table><tbody><tr><td>Kristallisationsroboter</td><td>TTP Labtech, Art Robbins-Jeder</td><td></td> <td>sollte hier arbeiten, außer LCP Kristallisation</td></tr><tr><td>PCR Thermocycler</td><td>Eppendorf, BioRad-Media</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Shaker</td><td>New Brunswick, Infors HT-UV-vis</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Spektrometer</td><td></td> Eppendorf-SDS-PAGE <td></td><td></td></tr><tr><td>Gerät</td><td>BioRad</td><td>1645050, 1658005</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE und native Gele</td><td>BioRad, Life Technologies</td><td>4561084, EC6035BOX (BN1002BOX)</td><td></td></tr><tr><td>AkTA Prime</td><td>GE</td> <td>Healthcare-AkTA</td><td></td></tr> <tr><td>Purifier</td><td>GE</td><td></td> Healthcare-Mikrozentrifuge <td></td></tr><tr>Eppendorf-Zentrifuge<td></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>(niedrige bis mittlere Drehzahl)</td><td>Beckman-Coulter-Ultrazentrifuge</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>(hohe Geschwindigkeit) </td><td>Beckman-Coulter-SS34</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Rotor</td><td>Sorvall-Typ</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>45 Ti Rotor</td><td>Beckman-Coulter-Typ</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>70 Ti Rotor</td><td>Beckman-Coulter-Dounce</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Homogenisator</td><td>Fisher Scientific</td><td>06 435C</td><td></td></tr><tr><td>Emulsiflex</td><td>Avestin-Dialyseschlauch</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>D9652</td><td></td></tr><tr><td>LCP-Werkzeuge</td><td>Hamilton, TTP Labtech-VDX</td> <td>24-Well-Platten</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Hampton Research</td><td>HR3-172</td><td></td></tr><tr><td>Sandwichplatten</td><td>Hampton Research, Molecular Dimensions</td><td>HR3-151, MD11-50 (MD11-53)</td><td></td></tr><tr><td>Grace Kristallisationsplatten</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>875238</td><td></td></tr><tr><td>HiPrep S300 HR Säule</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1167-01</td><td></td></tr><tr><td>Q-Sepharose-Säule</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0510-01</td><td></td></tr><tr><td>Kristallisationssiebe</td><td>Hampton Research, Qiagen, Molecular</td> <td>Dimensions-Gasdichte</td><td></td></tr> <tr><td>Spritze (100 ml)</td><td>Hamilton&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

von konstrukten crystals - auf dem weg zu strukturbestimmung von β-fass-außenmembranproteine

From Constructs to Crystals &#8211; Towards Structure Determination of &#946;-barrel Outer Membrane Proteins

Membranproteine erfüllen wichtige Funktionen in Zellen wie Nährstofftransport, Motilität, Signalübertragung, Überleben und Virulenz, machen aber nur ~1% Prozent der bekannten Strukturen aus. Es gibt zwei Arten von Membranproteinen, α-helikale und β-Fass-Proteine. Während α-helikale Membranproteine in fast allen zellulären Membranen zu finden sind, sind β-Fass-Membranproteine nur in den äußeren Membranen von Mitochondrien, Chloroplasten und gramnegativen Bakterien zu finden. Ein häufiger Engpass bei Strukturstudien von Membranproteinen im Allgemeinen besteht darin, genügend reine Proben für die Analyse zu erhalten. In der Hoffnung, denjenigen helfen zu können, die daran interessiert sind, die Struktur ihres bevorzugten β-Fass-Außenmembranproteins (OMP) zu entschlüsseln, werden allgemeine Protokolle für die Herstellung von Ziel-β-Fass-OMPs auf einem Niveau vorgestellt, das für die Strukturbestimmung durch Röntgenkristallographie und/oder NMR-Spektroskopie nützlich ist. Hier skizzieren wir das Konstruktdesign sowohl für die native Expression als auch für die Expression in Einschlusskörpern, die Reinigung mit einem Affinitätstag und die Kristallisation mit Detergenz-Screening, Bicelle und Lipid-Kubic-Phasen-Techniken. Diese Protokolle wurden getestet und haben sich bei den meisten OMPs von gramnegativen Bakterien als wirksam erwiesen. Es gibt jedoch einige Ziele, insbesondere für Mitochondrien und Chloroplasten, die möglicherweise andere Methoden zur Expression und Reinigung erfordern. Daher sollten die hier aufgeführten Methoden für die meisten Projekte anwendbar sein, die OMPs von gramnegativen Bakterien beinhalten, jedoch variieren die Expressionsniveaus und die Menge der gereinigten Probe je nach Ziel-OMP.

YiuR ist ein TonB abhängig Eisen Transporter, der ein mutmaßliches Impfstoff Ziel gegen Yersinia pestis ist. Es wurde ursprünglich identifiziert einen Microarray - Assay. Dabei sind die Schritte, die unternommen wurden , um die Struktur von YiuR Verwendung Röntgenkristallographie zu bestimmen , werden beschrieben (Abbildung 9). Zur Klonierung der DNA-Sequenz von YiuR (minus der N-terminalen Signalsequenz) wurde PCR aus genomischer DNA amplifiziert und subklonier...

β-barrel outer membrane proteins (OMPs) erfüllen viele Funktionen innerhalb der äußeren Membranen von gramnegativen Bakterien, Mitochondrien und Chloroplasten. Hier hoffen wir, einen bekannten Engpass in Strukturstudien zu entschärfen, indem wir Protokolle für die Herstellung von β-Zylinder-OMPs in ausreichender Menge für die Strukturbestimmung mittels Röntgenkristallographie oder NMR-Spektroskopie vorstellen.

Von Konstrukten Crystals - Auf dem Weg zu Strukturbestimmung von β-Fass-Außenmembranproteine

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, Milligramm-Mengen von äußeren Membran-Beta-Fass-Proteinen zu erhalten, die kristallisieren und diffraktieren können. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Faltung und des Transports von Membranproteinen zu beantworten, beispielsweise wie Beta-Fass-Proteine in Zellmembranen eingebaut werden. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt in ihrer Robustheit gegenüber Beta-Fass-Proteinen.Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten, da die Auswahl der Detergenzien für die Reinigung, Kristallisation und Defraktion herausfordernd ist. Jeremy Guerin, ein Postdoktorand aus dem Labor von Susan Buchanan, wird das Verfahren demonstrieren, zusätzlich zu mir selbst und Kollegen im Labor. Beginnen Sie dieses Verfahren mit dem Aufbau eines T7-Expressionsvektors, der das kodonoptimierte Gen für das Ziel-Oberflächenmembranprotein oder OMP-Gen enthält, zur in vivo-Expression in die Membran, wie im Textprotokoll beschrieben.Transformieren Sie das Konstrukt in einen Expressionsstamm von Bakterien, indem Sie ein Mikroliter Plasmid in 50 Mikroliter chemisch kompetente BL21(DE3)-Zellen

from-constructs-to-crystals-towards-structure-determination-barrel

Research

Forschung

JoVE Journal

Chemistry

Chemie

Hierin ist das Verfahren in der Caffrey Membrane Strukturelle und funktionelle Biology Group manuell einrichten Kristallisation Studien von Membranproteinen in lipidic Mesophasen implementiert beschrieben.

Crystallizing Membranproteinen zur Strukturaufklärung mittels Lipidische Mesophasen

Auswertung zweidimensionaler (2D) Kristallisation Studien für die Bildung geordneter membrane protein-Arrays ist eine höchst kritische und schwierige Aufgabe in Elektronenkristallographie. Hier beschreiben wir unseren Ansatz in Screening und Identifizierung von 2D-Kristallen von überwiegend kleinen Membranproteine ​​im Bereich von 15 - 90kDa.

Die Beurteilung Zweidimensionale Kristallisation Trials of Small Membranproteinen für Strukturbiologie Studien Electron Crystallography

Hierin wird eine Roboter-Ansatz zur Hochdurchsatz-Kristallisation von Membranproteinen in lipidische Mesophasen zur Verwendung in Strukturbestimmung mittels makromolekularen Röntgenkristallographie beschrieben. Drei Roboter in der Lage Umgang mit dem viskosen und klebrigen Protein-beladenen Mesophase integraler Bestandteil der Methode eingeführt werden.

Einsatz eines Roboters für High-Throughput-Kristallisation von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen

Hierin wird Verfahren im Caffrey Membrane Strukturelle und Funktionelle Biology Group zu ernten und Kryo-cool Membranprotein Kristalle in Lipid kubische und Schwamm Phasen für den Einsatz in der Struktur-Bestimmung mit makromolekularen Röntgenkristallographie gewachsen implementiert beschrieben.

Ernte-und Cryo-Kühlung Kristalle von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen zur Strukturaufklärung von Makromolekulare Kristallographie Grown

Structure-based drug design spielt eine wichtige Rolle in der Medikamentenentwicklung. Verfolgen mehrere Ziele parallel erhöht die Chance auf Erfolg für Blei Entdeckung. Der folgende Artikel zeigt, wie die Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease eine Multi-Target-Ansatz für die Gen-to-Bestimmung der Struktur des Influenza-A-Untereinheit PB2 nutzt.

Multi-Target-Parallel Processing Ansatz zur Gene-to-Struktur Bestimmung der Influenza Polymerase PB2-Untereinheit

Wir beschreiben einen Rahmen, der einfache biochemische und rechnerische Analysen umfasst, um die Charakterisierung und Kristallisation von großen Coiled-Coil-Domänen zu leiten. Dieser Rahmen kann für globuläre Proteine angepasst oder um eine Vielzahl von Hochdurchsatztechniken erweitert werden.

Nass- und Trockenlabortechniken Die Kombination der Kristallisation von Large Coiled-Coil-Proteine ​​enthalten, zu Führer

Diese Methode beschreibt die Klonen, Ausdruck und Reinigung von rekombinanten Nsa1 zur Strukturaufklärung durch Röntgen-Kristallographie und kleine Winkel Röntgenstreuung (SAXS) und gilt für die Hybrid-Strukturanalyse von anderen Proteinen mit beiden bestellt und Domänen ungeordnet.

Kombination von Röntgen-Kristallographie mit kleinen Winkel Röntgenstreuung, unstrukturierte Regionen der Nsa1 aus S. Cerevisiae zu modellieren

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um den Dimer-Dodecamer-Übergang von TmPep1050, einer M42-Aminopeptidase, auf struktureller Ebene zu untersuchen. Es ist eine einfache Pipeline, die von der Proteinreinigung bis zur Röntgendatenverarbeitung reicht. Crystallogenese, Datensatzindexierung und molekularer Ersatz wurden durch einen Studienfall, TmPep1050H60A H307A Variante, betont.

Röntgenkristallographie zur Untersuchung des oligomeren Zustandsübergangs der Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

Lipidmonoschichten werden seit Jahrzehnten als Grundlage für die Bildung von zweidimensionalen (2D) Proteinkristallen für Strukturstudien verwendet. Sie sind an der Luft-Wasser-Grenzfläche stabil und können als dünnes Trägermaterial für die Elektronenbildgebung dienen. Hier stellen wir die bewährten Schritte zur Herstellung von Lipidmonolayern für biologische Studien vor.

Probenvorbereitung mit einer Lipid-Monolayer-Methode für elektronenkristallographische Untersuchungen

Dieses Protokoll beschreibt einen Aufbau für die Kristallisation des Steroltransporters ABCG5/G8. ABCG5/G8 wird für die Hängetropfenkristallisation in Bizellen rekonstituiert. Das Protokoll erfordert keine speziellen Materialien oder Substrate, so dass es in jedem Labor zur Bestimmung der Proteinstruktur durch Röntgenkristallographie zugänglich und einfach angepasst werden kann.

ABCG5/G8-Kristallisation in einer lipidischen Bizellenumgebung für die Röntgenkristallographie

Lernen Sie die Produktion von β-Fass-Außenmembranproteinen für strukturbiologische Studien. Diese robuste Methode ermöglicht Kristallisation und Röntgenbeugung zur Aufklärung von Membranproteinfaltung.

Von Konstrukten Crystals - Auf dem Weg zu Strukturbestimmung von β-Fass-Außenmembranproteine

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