Name: Kartierung der Bindungsstelle eines Aptamer auf ATP Mit Micro Thermophorese (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-07T18:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Erfahren Sie die Charakterisierung von Aptamer-Kleinstmolekül-Interaktionen mittels MicroScale Thermophoresis. Diese Methode ermöglicht die quantitative Bestimmung von Bindungsparametern wie Affinität und Stöchiometrie.

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1. Vorbereitung der Aptamer-Funktion Stock <ol><li> Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers und lösen das Oligonukleotid (5-Cy5-CCTG GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3, Sequenz aus Referenz 18) in Wasser, einer 100-uM Endkonzentration zu erreichen. </li><li> Bereiten Sie die Aptamer - Arbeitslösung durch Verdünnen des Oligonukleotid - Lager auf 200 nM mit Bindungspuffer (20 mM Tris, pH 7,6; 300 mM NaCl, 5 mM MgCl 2; 0,01% Tween 20). </li><li> Inkubieren Sie die Mischung für 2 min bei 90 ° C, lassen Sie sofort die Probe auf Eis abkühlen, und die Probe bei Raumtemperatur verwenden. </li></ol> 2. Herstellung der Ligand Verdünnungsreihe <ol><li> Für jeden Liganden (Adenosin-Triphosphat (ATP), Adenosindiphosphat (ADP), Adenosinmonophosphat (AMP), Adenin, Guanosin-Triphosphat (GTP), Cytosin-triphosphat (CTP), Desoxyadenosintriphosphat (dATP) und S-Adenosylmethionin (SAM) ; jeweils) 10 mM Lager, bereiten Sie einen 16-stufigen seriellen dilutiauf in 200 &amp; mgr; l Mikroreaktionsröhrchen. HINWEIS: Die Zentrifugation von Ligand Bestände für 5 min bei 14000 xg helfen können Aggregate zu entfernen. Geringes Volumen, geringe Bindungsreaktionsrohre werden empfohlen Adsorption von Molekülen an den Rohrwänden zu vermeiden. </li><li> Beginnen mit einer maximalen Konzentration von mindestens 50 mal höher ist als die geschätzte Affinität und Verringerung um 50% in jedem Verdünnungsschritt die Ligandenkonzentration. HINWEIS: Die Konzentration finder Werkzeug in die Steuerungssoftware implementiert simuliert Bindungsdaten und hilft bei der richtigen Konzentrationsbereich für die Verdünnungsreihe finden. </li><li> Füllen Sie 20 ul des Liganden Lager (10 mM) in Rohr 1. Fügen Sie 10 ul Aptamer-Bindungspuffer in Mikroreaktionsrohre 2 bis 16. </li><li> Transfer 10 ul Rohr 1 bis Rohr 2 und ordnungsgemäß durch Auf- und Abpipettieren mehrmals mischen. Übertragen Sie 10 &amp; mgr; l in die nächste Röhre und wiederholen Sie diese Verdünnung für die verbleibenden Rohre. </li><li> Entsorgen Sie die 10 ul Überschuss aus dem letzten Rohr. Vermeiden Sie bUffer Verwässerungseffekte. Der Puffer in Rohr 1 und in Röhrchen 2-16 müssen identisch sein. </li></ol> 3. Herstellung der endgültigen Reaktions Mix <ol><li> Bereiten Sie die einzelnen Bindungsreaktionen mit einem Volumen von 20 &amp; mgr; l (10 &amp; mgr; l Arbeitslösung Aptamer + 10 &amp; mgr; l des jeweiligen Liganden Verdünnung) Pipettierfehler zu minimieren. Ein Volumen von nur 4 ul reicht aus ll die Kapillare zu fi nden. </li><li> In 10 ul der 200 nM Aptamer-Arbeitslösung zu 10 &amp; mgr; l jedes Liganden Verdünnung und mischen richtig durch Auf- und Abpipettieren mehrmals. </li><li> Inkubiere die Proben für 5 min bei Raumtemperatur und fi ll die Proben in Standard-Kapillaren durch die Kapillaren in die Probe eingetaucht wird. Längere Inkubationszeiten können für einige Wechselwirkungen erforderlich sein; jedoch 5 min ist ausreichend für die meisten. Berühren die Kapillaren nur an den Seiten, nicht auf dem mittleren Teil, wo die optische Messung genommen wird. </li><li> Legen Sie die Kapillaren auf the Kapillar-Fach und die MST-Gerät starten. </li></ol> 4. Starten des MST-Gerät HINWEIS: Das Gerät verfügt über zwei vorinstallierte Software-Pakete, die &#39;&#39; control &quot;Software für den technischen Aufbau der experimentellen Bedingungen und der &#39;&#39; Analyse&quot; Software für die Interpretation der erzeugten Daten. <ol><li> Vor der Platzierung der Kapillare Fach in die MST-Gerät, starten Sie die Steuerungssoftware und stellen Sie die gesamte gewünschte Temperatur von &#39;Auswahl von&#39; ermöglichen Steuerung manueller Temperatur &quot;in der &#39;&#39; Temperaturregelung&quot; Drop-Down-Menü. Einstellen der Temperatur auf 25 ° C in dieser Weise. HINWEIS: Die MST Instrumente können von 22 bis 45 ° C temperiert werden. </li><li> Warten, bis die Temperatur das erwartete Niveau zu erreichen, und legen Sie dann die Kapillare Fach in die MST-Gerät. </li><li> Stellen Sie den LED-Kanal &#39;&#39; rot &quot;für Cy5 Farbstoffen und stellen Sie die LED-Leistung ein fl uorescenc zu gewinnene Signal von 300 bis 1000 Fluoreszenzeinheiten an der MST-Gerät mit einem Standard-Sensor. 25% LED-Leistung wird in dieser Studie verwendet. HINWEIS: 6.000 bis 18.000 Fluoreszenzeinheiten für die MST mit einem hochempfindlichen Sensor empfohlen. </li></ol> 5. Kapillar-Scan <ol><li> Führen Sie eine Kapillare Scan verschiedene Qualitätsaspekte der Probe zu überprüfen, indem die Kapillare Position auf der &quot;Control&quot; Software ein und klicken auf &quot;Start Kappe scan&quot; bevor die MST-Messung starten. </li><li> Überprüfen Sie die Kapillar-Scan für Fluoreszenzverstärkung / Lösch- und Klebeeffekte (U-förmige oder abgeflachte Spitzen) in der Software. HINWEIS: Weitere Informationen über die Erkennung und Behandlung von Fluoreszenz und Klebeeffekte können in der Diskussion zu finden. </li></ol> 6. MST Mess HINWEIS: Vor der Messung MST beginnen, stellen Sie sicher, dass Effekte, Verbesserung / Löscheffekte auszuschließen kleben, oderPipettierfehler, und sicherzustellen, dass die Kapillare Scan zeigt, dass die Fluoreszenz- Signal reicht aus. Weitere Details, die Diskussion. <ol><li> Ordnen die Ligandenkonzentrationen aus der Verdünnungsreihe auf die jeweilige Kapillare Position in der &#39;&#39; control &quot;Software Betrachten der Verdünnungsschritt das Aptamer und dem Liganden zu mischen. (1: 1). </li><li> Geben Sie die höchste Konzentration an Ligand (5 mM) für kapillare # 1, wählen Sie die richtige Verdünnung (hier 1: 1), klicken Sie auf die maximale Konzentration, und verwenden Sie die Drag-Funktion, um automatisch die verbleibenden Konzentrationen in Kapillaren zuweisen # 2- 16. Die niedrigste Konzentration ist 152,6 nM. </li><li> Geben Sie die Konzentration des Fluoreszenz- Aptamer (hier 100 nM) in dem jeweiligen Abschnitt der Steuerungssoftware. </li><li> Verwenden Sie die Standardeinstellungen, die die fluoreszenz für 5 Sekunden erkennen, notieren Sie die MST für 30 Sekunden, und notieren Sie die Fluoreszenz für weitere 5 Sekunden nach der Inaktivierung des Lasers t<html> o die Rückdiffusion von Molekülen zu überwachen. </li><li> Stellen Sie die Laserleistung auf 20% in dem jeweiligen Abschnitt der Steuersoftware. ANMERKUNG: Um das beste Signal-zu-Rausch-Verhältnis zu erhalten und zu unspezifischen Effekte zu vermeiden, wird eine Laserleistung von 20-40% empfohlen. In bestimmten Fällen kann eine höhere Laserleistung eine gute Trennung von ungebundenen und gebundenen Moleküle zu erhalten erforderlich. </li><li> Speichern Sie das Experiment nach den Zielordner auswählen und auf die MST Messung starten durch Drücken der &#39;&#39; Start MST Messung &quot;-Taste. HINWEIS: Die .ntp Datei im Zielordner erzeugt wird. Mit diesem Setup dauert eine Messung 10-15 min. </li><li> Wiederholen Sie die experimentellen Verfahren mindestens zweimal für eine genauere Bestimmung des Wertes 50 EC. HINWEIS: Um die technische Reproduzierbarkeit zu testen, können die gleichen Kapillaren mehrmals gescannt werden (technische Wiederholungen). </li></ol> 7. MST Datenanalyse nt &quot;&gt; Hinweis: Die Analyse - Software die Analyse von Daten über die fl y während der Messung ermöglicht die Analyse - Software , die MST Zeit Spuren und Veränderungen in der normierten Fluoreszenz- (F Norm) gegen die Ligandenkonzentration 37 aufgetragen ist .. <ol><li> Starten Sie die MST-Analyse-Software (MO.Affinity Analysis) und laden Sie die .ntp Datei aus dem Zielordner. Wählen Sie &quot;MST&quot; als Analysetyp in der Datenauswahlmenü. HINWEIS: Bei Liganden-abhängige Fluoreszenzeffekte kann die anfängliche Fluoreszenz zur Analyse ausgewählt werden. </li><li> Fügen Sie die entsprechenden technischen oder biologischen Lauf (s) einer neuen Analyse per Drag-and-Drop oder über die Schaltfläche &quot;+&quot; unterhalb der jeweiligen Versuchslauf drücken. </li><li> Drücken Sie die Informationstaste unterhalb der jeweiligen Versuchslauf zu erhalten Informationen über die Eigenschaften des Experiments MST Spuren, Kapillar-Scan, Kapillar-Form, anfängliche Fluoreszenz und Bleichrate. Hinweis: Diese Rohdaten können also in späteren Schritten der Analyse überprüft werden. </li><li> die MST Spuren für die Aggregation und Fällung Effekte sichtbar, wie Beulen und Spikes einer Sichtprüfung. HINWEIS: Weitere Informationen über die Erkennung und Behandlung von Aggregationseffekten, lesen Sie die Diskussion. </li><li> die kapillare Scan und die kapillare Form Overlay für Adsorptionseffekten, sichtbar als abgeflacht oder U-förmigen Spitzen Sichtprüfung. Eine Sichtprüfung des Kapillar-Scan und die anfängliche Fluoreszenz für Fluoreszenzeffekte. Sichtprüfung für Photobleaching Auswirkungen der Bleichrate. </li><li> Wechseln Sie auf die Dosis-Wirkungs-Modus und ändern Sie die Analyse-Einstellung auf &quot;Experten&quot; -Modus indem Sie die entsprechende Taste drücken. Wählen Sie &quot;T-Jump&quot;, wie die MST Bewertungsstrategie. </li><li> Wählen Sie den &quot;Hügel&quot; Modell für die Kurve Armatur. Die Bindungsparameter werden automatisch berechnet. Normalisieren der Daten durch die jeweilige Art der Normalisierung in der &quot;vergleichen Sie die Ergebnisse&quot; Menü wählen. exportieren Sie dieDaten entweder als .xls oder .pdf. HINWEIS: Die unten stehende Tabelle der Bindungs ​​Diagramm fasst die berechneten Bindungsparameter. </li></ol>

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</ol>

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Qualitätskontrollen: Unspezifische Klebe- / Adsorption von Probenmaterial an Oberflächen sowie Aggregationseffekte, haben einen dramatischen Einfluss auf die Qualität der Affinitätsdaten. Doch nur wenige state-of-the-art Technologien bieten genaue und schnelle Möglichkeiten zu überwachen und diese Effekte zu vermeiden. MST bietet integrierte Qualitätskontrollen, die erkennen und helfen, diese Probleme zu überwinden, so dass für die schrittweise Optimierung der technischen Einrichtung. Wichtige ...

Wechselwirkung zwischen Molekülen ist die Basis der Natur. Daher Wissenschaftler in vielen Bereichen der Grundlagen- und angewandten Forschung versuchen die grundlegenden Prinzipien der molekularen Wechselwirkungen verschiedener Arten zu verstehen. Micro Thermophorese (MST) können Wissenschaftler die schnelle, präzise und kosteneffiziente und qualitätskontrollierte Charakterisierung von molekularen Wechselwirkungen in Lösung durchzuführen, mit einer freien Wahl von Puffern. Es gibt bereits mehr als 1.000 Publikationen MST mit, ab 2016 allein, beschreibt verschiedene Arten von Analysen, einschließlich Bibliothek Vorführungen, Ereignis Validierungen Bindung, kompetitive Assays, und Experimente mit mehreren Bindungspartnern 1-8. Im Allgemeinen erlaubt MST die Untersuchung der klassischen Bindungsparameter wie Bindungsaffinität (pM bis Mm), Stöchiometrie und Thermodynamik, der jede Art von molekularen Wechselwirkungen. Ein großer Vorteil der MST ist die Fähigkeit, Bindungsereignisse unabhängig von der Größe der Interaktionspartner zu studieren. Auch Heraus-fordernd Wechselwirkungen zwischen kleinen Nukleinsäure-Aptamere (15-30 nt) und Ziele wie kleine Moleküle, Medikamente, Antibiotika oder Metaboliten quantifiziert werden können. Aktuelle state-of-the-art Technologien Aptamer-Target - Wechselwirkungen sind entweder im Labor intensiv und sehr komplex zu charakterisieren oder scheitern Aptamer-kleines Molekül 9,10 Wechselwirkungen zu quantifizieren. Oberflächenplasmonresonanz (SPR) -basierte Assays 11,12 und wirklich markierungsfreie kalorimetrischen Ansätze wie Isothermen Titrations - Kalorimetrie (ITC) 13-15, isokratische Elution 16, Gleichgewicht Infiltrations 17,18, in-line Sondieren 19, Gel- Shift - Assays, Stopped fl ow Fluoreszenz- Spektroskopie 20,21, Fluoreszenzanisotropiemessungen (FA) 22,23, Einzelmolekül - Fluoreszenz - Bildgebung 24,25 und Bio-Schicht - Interferometrie (BLI) 26 sind ebenfalls entweder ungenau oder nicht kompatibel mit Aptamer-kleines Molekül Wechselwirkungen. Andere principal Probleme dieser Verfahren sind eine geringe Empfindlichkeit, hohe Probenverbrauch, Immobilisation, Massentransportbeschränkungen auf Oberflächen und / oder Puffer Einschränkungen. Nur wenige dieser Technologien bieten integrierte Kontrollen für die Aggregation und Adsorption Effekte. MST stellt ein leistungsfähiges Werkzeug für Wissenschaftler , diese Einschränkung zu überwinden , um die Wechselwirkungen zwischen Aptamere und kleine Moleküle , 27-29, sowie andere Ziele, wie Proteine 30-33 zu studieren. Die Technologie beruht auf der Bewegung von Molekülen durch Temperaturgradienten. Diese gerichtete Bewegung, die so genannte &quot;Thermophorese,&quot; hängt von der Größe, der Ladung und Hydrathülle des Moleküls 34,35. Die Bindung eines Liganden an das Molekül direkt an mindestens einen dieser Parameter zu verändern, in einer veränderten thermophoretische Mobilität führt. Liganden mit kleinen Größen haben nicht erhebliche Auswirkungen in Bezug auf die Größenänderung von der ungebundenen zum gebundenen Zustand, aber sie können dr haben<html> amatic Auswirkungen auf die Hydrathülle und / oder Ladung. Die Veränderungen in der thermophoretische Bewegung der Moleküle nach der Wechselwirkung mit dem Bindungspartner ermöglicht die Quantifizierung der Grundbindungsparameter 2,7,34,36,37. Wie in 1A dargestellt ist , besteht der MST Vorrichtung eines Infrarotlasers auf die Probe innerhalb der Glaskapillaren fokussiert die gleiche Optik wie für die Fluoreszenzdetektion. Die thermophoretischer Bewegung von Proteinen über die Eigenfluoreszenz von Tryptophane 6 oder eines fluoreszierend 3,8 Interaktionspartner markiert überwacht werden kann , während der Laser einen Temperaturgradienten (AT von 2-6 ° C) herstellt. Die sich ergebende Temperaturdifferenz im Raum, &amp; Delta; T, führt zur Verarmung oder Anreicherung von Molekülen im Bereich der erhöhten Temperatur, die durch die Soret quantifiziert werden kann Koeffizienten (S T): g &quot;/&gt; c hot stellt die Konzentration in dem erwärmten Bereich, und c kalt ist die Konzentration in dem anfänglichen Kaltbereich. Wie in 1B gezeigt , um eine typische MST Versuchsergebnisse in einer MST Bewegungsprofil (Zeitverlauf), die aus verschiedenen Phasen, die durch ihre jeweiligen Zeitrahmen getrennt werden können. Die anfängliche Fluoreszenz wird in den ersten 5 s in Abwesenheit des Temperaturgradienten gemessen, um die genaue Start Fluoreszenz zu definieren und für Photobleaching oder photoenhancement zu überprüfen. Der Temperatursprung (T-Jump) repräsentiert die Phase, in der die Fluoreszenzänderungen vor thermophoretischer Bewegung. Diese anfängliche Abnahme der Fluoreszenz hängt von wärmeabhängige Veränderungen von fl uorophore Quantenausbeute. Die Thermophorese Phase folgt, in der die Fluoreszenz abnimmt (oder zunimmt) aufgrund der thermophoretische Bewegung der Moleküle, bis die Stationärzustandsverteilung erreicht wird.Die umgekehrte TJump und die gleichzeitige Rückdiffusion der fluoreszierenden Moleküle können wie in 1B angegeben beobachtet werden , nachdem der Laser ausgeschaltet ist. Um grundlegende Bindungsparameter, verschiedene Molverhältnisse der Interaktionspartner für den Zugriff werden analysiert und verglichen. Typischerweise werden 16 unterschiedliche Verhältnisse in einem MST Experiment untersucht, wohingegen der optische sichtbaren Molekül konstant gehalten wird und mit zunehmender Menge des unmarkierten Liganden zugeführt wird. Die Wechselwirkung zwischen den beiden Bindungspartner induziert Veränderungen in der Thermophorese, und somit in der normalisierten Fluoreszenz, F Norm, die wie folgt berechnet wird: <img alt="Gleichung" src="/files/ftp_upload/55070/55070eq2.jpg" /> F heiß und F kalt stellen Intensitäten fluoreszenz bei de fi nierten Zeitpunkte der MST Spuren gemittelt. Bindungsaffinitäten (K d oder EC 50 -Werte) können durch curv berechnet werdene Fitting (1C). Insgesamt ist MST ein leistungsfähiges Werkzeug molekularen Wechselwirkungen jeglicher Art zu studieren. Dieses Manuskript bietet ein Protokoll das herausfordernde Interaktion zwischen dem kleinen Molekül Adenosintriphosphat (ATP; 0,5 kDa) zu charakterisieren und die 25-nt kurze ssDNA Aptamer DH25.42 (7,9 kDa). Im Laufe des Manuskripts wird die Bindungsstelle des Aptamers an das ATP-Molekül an die Adenin-Gruppe des ATP kartiert unten.

<table><tbody><tr><td>Aptamer-Bindungspuffer</td><td></td><td></td><td>20 mM Tris pH 7,6; 300 mM NaCl; 5 mM MgCl2; 0,01% Tween-20</td></tr><tr><td>Fluoreszenzmarkiertes ATP-Aptamer</td><td>IDT, Leuven, Belgien</td><td></td><td>Sequenz: DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT- ATTGCGGAGGAAGG-3</td></tr><tr><td></td><td>ATP Sigma Aldrich, Deutschland&nbsp;</td><td>A2383</td><td>10 mM Stammlösungen gelagert bei - 20 &deg; C</td></tr><tr><td>ADP</td><td>Sigma Aldrich, Deutschland&nbsp;</td><td>A2754</td><td>10 mM Stammlösungen gelagert bei - 20 &deg; C</td></tr><tr><td>AMP</td><td>Sigma Aldrich, Deutschland&nbsp;</td><td>A2252</td><td>10 mM Stammlösungen, gelagert bei - 20 &deg; C</td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Sigma Aldrich, Deutschland&nbsp;</td><td>A8626</td><td>10 mM Stammlösungen gelagert bei - 20 &/�; C</td></tr><tr><td>SAM</td><td>Sigma Aldrich, Deutschland&nbsp;</td><td>A7007</td><td>10 mM Stammlösungen gelagert bei - 20 &deg; C</td></tr><tr><td>dATP</td><td>Sigma Aldrich, Deutschland&nbsp;</td><td>11934511001</td><td>10 mM Stammlösungen, gelagert bei - 20 &Grad; C</td></tr><tr><td></td><td>CTP Sigma Aldrich, Deutschland&nbsp;</td><td>C1506</td><td>10 mM Stammlösungen gelagert bei - 20 &deg; C</td></tr><tr><td>GTP</td><td>Sigma Aldrich, Deutschland&nbsp;</td><td>G8877</td><td>10 mM Stammlösungen gelagert bei - 20 &deg; C</td></tr><tr><td>Monolith NT.115&nbsp;</td><td>NanoTemper Technologies, München, Deutschland</td><td>MO-G008</td><td>Blau/Roter Kanal MST-Baustein mit Standarddetektor, Monolith NT115 pico ist ein MST-Baustein mit hochempfindlichem Detektor</td></tr><tr><td>Monolith NT.115 Kapillaren Standard</td><td>NanoTemper Technologies, München, Deutschland</td><td>MO-K002</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf PCR-Röhrchen</td><td>Eppendorf, Deutschland</td><td>30124537</td><td></td></tr><tr><td>Monolith Steuerungssoftware. 2.1.33, vorinstalliert auf das Gerät</td><td>NanoTemper Technologies, München, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MO.Affinitätsanalyse v2.1.1</td><td>NanoTemper Technologies, München, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaleidagraph 4.5.2</td><td>Synergy Software</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kartierung der bindungsstelle eines aptamer auf atp mit micro thermophorese

Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis

Die Charakterisierung molekularer Wechselwirkungen in Bezug auf grundlegende Bindungsparameter wie Bindungsaffinität, Stöchiometrie und Thermodynamik ist ein wesentlicher Schritt in der Grundlagen- und angewandten Wissenschaft. Die mikroskalige Thermophorese (MST) ist eine empfindliche biophysikalische Methode, um diese wichtigen Informationen zu erhalten. Basierend auf einem physikalischen Effekt namens Thermophorese, der die Bewegung von Molekülen durch Temperaturgradienten beschreibt, ermöglicht diese Technologie die schnelle und präzise Bestimmung von Bindungsparametern in Lösung und die freie Wahl der Pufferbedingungen (von Puffer bis zu Lysaten/Seren). MST macht sich die Tatsache zunutze, dass ein ungebundenes Molekül eine andere thermophoretische Bewegung zeigt als ein Molekül, das sich im Komplex mit einem Bindungspartner befindet. Die thermophoretische Bewegung wird im Moment der molekularen Wechselwirkung aufgrund von Änderungen der Größe, der Ladung und der Hydrathülle verändert. Durch den Vergleich der Bewegungsprofile verschiedener molekularer Verhältnisse der beiden Bindungspartner können quantitative Informationen wie die Bindungsaffinität (pM bis mM) bestimmt werden. Selbst schwierige Wechselwirkungen zwischen Molekülen kleiner Größe, wie Aptameren und kleinen Verbindungen, können mit MST untersucht werden. Unter Verwendung der gut untersuchten Modellinteraktion zwischen dem DNA-Aptamer DH25.42 und ATP bietet dieses Manuskript ein Protokoll zur Charakterisierung von Aptamer-Kleinmolekül-Wechselwirkungen. Diese Studie zeigt, dass MST hochsensitiv ist und die Kartierung der Bindungsstelle des 7,9 kDa DNA-Aptamers auf das Adenin von ATP ermöglicht.

In dieser Studie wurde MST die Bindungsstelle des DNA - Aptamer DH25.42 18 an ATP zu charakterisieren aufgetragen. Im Gegensatz zu anderen Studien , die die Wechselwirkung von ATP oder ATP-nachahmt kleine Moleküle mit Proteinen zufällig markiert mit einem oder mehreren Fluorophoren 38-40 charakterisierenden umfasst diese Studie eine markierte Version des 7,9 kDa ssDNA Aptamer mit einem Cy5 - Molekül am 5&#39;Ende . Verschiedenen ATP-Derivate und verwandte Moleküle, ...

MicroScale Thermophorese (MST) ist eine empfindliche Technologie zur Charakterisierung von Aptamer-Ziel-Wechselwirkungen. Dieses Manuskript beschreibt ein MST-Protokoll zur Charakterisierung von Aptamer-Kleinmolekül-Wechselwirkungen.

Kartierung der Bindungsstelle eines Aptamer auf ATP Mit Micro Thermophorese

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die Wechselwirkungen zwischen DNA-Aptameren und kleinen Molekülen, einschließlich der Abbildung der Bindungsstelle, mittels mikroskaliger Thermophorese zu charakterisieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zu den grundlegenden Bindungsparametern molekularer Wechselwirkungen zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technologie liegt darin, dass sie unabhängig von der Größe der Interaktionspartner ist und somit Qualitätskontrolldaten für anspruchsvolle Wechselwirkungen zwischen Aptameren und kleinen Molekülen gewonnen werden können.Obwohl diese Methode Einblicke in Wechselwirkungen zwischen Aptameren und kleinen Molekülen ermöglichen kann, ist sie ebenfalls auf andere molekulare Wechselwirkungen wie Arzneimittel-Wirkstoffziel- oder Antigen/Antikörper-Wechselwirkungen anwendbar. Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie eine 100 µM Stammlösung des mit Cy5 markierten DNA-Aptamers DH25.42 in destilliertem Wasser herstellen. Verdünnen Sie anschließend die Aptamer-Stammlösung mit Bindungspuffer auf 200 nmol/L.Die Arbeitslösung des Aptamers zwei Minuten bei 90 Grad Celsius inkubieren. Die Lösung auf Eis auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Danach niedrigbindende 200-Mikroliter-Mikrozentrifugenröhrchen für eine 16-stufige serielle Verdünnung des zu testenden Liganden beschriften und bereitstellen.Pipettieren Sie 20 Mikroliter einer 10-Millimolar-Stammlösung des Liganden und Bindungspuffer in Röhrchen 1. Pipettieren Sie 10 Mikroliter Bindungspuffer in die Röhrchen 2 bis 16. Übertragen Sie anschließend 10 Mikroliter der Liganden-Stammlösung aus Röhrchen 1 in Röhrchen 2 und mischen Sie gründlich mit der Pipette. Übertragen Sie 10 Mikroliter der verdünnten Mischung in Röhrchen 3 und mischen Sie gründlich. Fahren Sie auf diese Weise mit der seriellen Verdünnung fort, und berücksichtigen Sie gegebenenfalls die Pufferverdünnungseffekte. Entsorgen Sie nach Fertigstellung die überschüssigen 10 Mikroliter aus Röhrchen 16. Geben Sie 10 Mikroliter der Aptamer-Arbeitslösung zu jeder Verdünnung hinzu und mischen Sie gründlich mit der Pipette.Inkubieren Sie die Proben fünf Minuten bei Raumtemperatur. Ziehen Sie dann jedes Gemisch in eine saubere Standardkapillare ein, wobei Sie die Kapillare nur an den Enden berühren sollten. Stellen Sie die Kapillaren in den Probenträger in absteigender Reihenfolge der Konzentration.Schalten Sie das MST-Gerät ein und öffnen Sie die Instrumentensteuerungssoftware. Aktivieren Sie die manuelle Temperatursteuerung und stellen Sie die Instrumententemperatur auf 25 Grad Celsius ein. Sobald das Instrument die korrekte Temperatur erreicht hat, setzen Sie das Kapillartray ein.Stellen Sie den LED-Kanal auf Rot für das mit Cy5 markierte Aptamer ein. Stellen Sie die LED-Leistung so ein, dass ein Fluoreszenzsignal von 500 Einheiten erreicht wird. Führen Sie anschließend einen Kapillarscan durch, um die Kapillarpositionen zu ermitteln, und überprüfen Sie die Probenqualität.Wenn die resultierenden Peaks U-förmig oder abgeflacht sind, bereiten Sie neue Proben in codierten Kapillaren vor, um Adhäsionseffekte zu minimieren. Geben Sie in der MST-Instrumentensoftware die Ligandenkonzentration und den Verdünnungstyp für die erste Kapillare ein. Klicken und ziehen Sie, um die Konzentrationen und Verdünnungen für die verbleibenden Kapillaren auszufüllen.Geben Sie die Konzentration des Aptamers in der Endmischung ein. Stellen Sie sicher, dass die Experimentmethode so eingestellt ist, dass fünf Sekunden lang die Fluoreszenz detektiert, dann 30 Sekunden lang die MST aufgezeichnet und anschließend fünf Sekunden lang nach dem Abschalten des Lasers die Fluoreszenz erfasst wird. Stellen Sie die Laserleistung auf 20 % ein. Legen Sie den Dateipfad fest und speichern Sie die Versuchsdatei.Starten Sie dann die MST-Messung. Führen Sie auf diese Weise mindestens drei Messungen durch. Öffnen Sie zur Datenanalyse die MST-Analyse-Software und laden Sie die Versuchsdatei.Wählen Sie MST als Analysenart aus. Die Analyse-Software ermöglicht den Vergleich technischer Wiederholungen, bei denen alle Messungen an demselben Satz von Kapillaren durchgeführt wurden. Biologische Wiederholungen aus einem anderen Satz von Kapillaren können ebenfalls zur Analyse hinzugefügt werden.Klicken Sie auf die Informations-Schaltfläche unter der ersten Messung. Überprüfen Sie die MST-Spuren auf Unebenheiten oder Spitzen, die auf Aggregation oder Ausfällungseffekte hindeuten. Untersuchen Sie anschließend die Kapillarscan- und Kapillarform-Überlagerung auf abgeflachte oder U-förmige Peaks, die auf Anhaftungs- oder Absorptionseffekte hinweisen.Da Aggregate und Absorptionseffekte in der MST schnell nachweisbar sind, ermöglicht die Methode eine schnelle Optimierung des technischen Set-ups, um eine optimale Datenqualität sicherzustellen. Prüfen Sie im Kapillar-Scan und bei der anfänglichen Fluoreszenz auf ligandenabhängige Fluoreszenzlöschung oder -verstärkung. Untersuchen Sie die Fluoreszenzänderung über die Zeit auf Anzeichen von Photo-Bleaching oder Photo-Verstärkung.Nachdem die Datenqualität überprüft wurde, wechseln Sie in den Dosis-Wirkungs-Modus. Wählen Sie die Experten-Analyseeinstellung in der T-Jump-MST-Auswertungsstrategie aus. Anschließend wählen Sie das Hill-Modell für die Kurvenanpassung, um die Bindungsparameter automatisch zu berechnen.Wählen Sie im Menü „Ergebnisse vergleichen“ einen Normalisierungstyp aus. Exportieren Sie die normalisierten Daten als Tabellenkalkulations- oder PDF-Datei. In diesem Verfahren wurde die MST verwendet, um die Bindungswechselwirkungen eines einzelsträngigen DNA-Aptamers mit einer Auswahl kleiner Molekül-Liganden zu untersuchen.Die MST-Kurven wurden mit der Hill-Gleichung angepasst und die halbmaximalen effektiven Konzentrationswerte wurden bestimmt. In fünf unabhängigen biologischen Wiederholungsmessungen des Aptamers mit ATP zeigte die Wechselwirkung zwischen ATP und Aptamer eine negative Bindungsamplitude von 6 bis 13 Einheiten sowie einen durchschnittlichen EC50-Wert von etwa 52,3 Mikromolar. Die Daten für jeden Liganden wurden auf den Bruchteil gebundener Moleküle normalisiert und anschließend verglichen.Die EC50-Werte für ADP, AMP und SAM im Vergleich zu ATP deuten darauf hin, dass die Anzahl der Phosphatgruppen allenfalls einen geringen Einfluss auf das Bindungsverhalten des Aptamers hat. Der Entzug der Hydroxylgruppe am C2-Rest des Ribosezuckers zeigte ebenfalls nur einen geringen Effekt auf die Bindungsaffinität des Aptamers. Der Aptamer bindet nicht in Abwesenheit einer komplementären Base oder wenn die komplementäre Base zu Guanin verändert wird.Der Aptamer bindete tatsächlich an Adenin allein, was weiter darauf hindeutet, dass die Adeningruppe die Hauptbindungsstelle für den Aptamer darstellt. Wenn man diese Technik erst einmal beherrscht, kann sie innerhalb von Minuten bis Stunden wesentliche Informationen über grundlegende Bindungsparameter liefern, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

SELEX-Protokolle umfassen mehrere Runden der Selektion, von denen jeder Regeneration von Liganden, die wiederum erfordern feste Primersequenzen flankierenden die zufällige Bibliothek Regionen erfordern. Diese festen Primersequenzen können mit der Auswahl (false positive und negative) stören. Hier präsentieren wir eine Grundierung-free-Protokoll.

Primer-Free Aptamer Selection mit einem zufälligen DNA-Bibliothek

Dieses Video demonstriert die mikroskalige Thermophorese zur Untersuchung der Protein-Lipid-Wechselwirkung. Der Assay detektiert die Wechselwirkung zwischen Molekülen, indem er die thermophoretische Bewegung von fluoreszenzmarkierten Proteinen als Reaktion auf einen Temperaturgradienten quantifiziert. Das fluoreszierende Molekül wird mit unterschiedlichen Konzentrationen der nicht fluoreszierenden Lipidmoleküle gemischt, und das Molekülgemisch in der Lösung wird in Kapillaren geladen. Dabei...

Mikroskalige Thermophorese zur Untersuchung von Protein-Lipid-Wechselwirkungen in Lösung

Microscale Thermophorese (MST) kann in weiten Bereichen zur Bestimmung der Bindungsaffinität werden ohne Reinigung des Zielproteins aus Zelllysaten. Das Protokoll umfasst die Überexpression des GFP-Fusionsprotein, Zell-Lyse in nicht-denaturierenden Bedingungen, sowie Erkennung MST Signal in der Gegenwart von variierenden Konzentrationen des Liganden.

Protein Purification-freie Methode der Bindungsaffinität Bestimmung durch Microscale Thermophorese

Es wird ein Protokoll zur Auswahl von strukturwechselnden Aptameren für kleine Molekülziele bereitgestellt, basierend auf einer einstellbaren Methode zur Auswahl magnetischer Beads. Aptamere, die mit strukturwechselnden Eigenschaften ausgewählt wurden, sind vorteilhaft für Assays, die eine Konformationsänderung erfordern, um das Vorhandensein eines Ziels zu signalisieren, wie z. B. der beschriebene Goldnanopartikel-Assay.

Ein Verfahren zur Auswahl Struktur-Schalt Aptamere zu einem Farbmetrik Gold-Nanopartikeln Assay angewandt

Ein Protokoll für die in-vitro- Selektion und Charakterisierung von gruppenspezifischen Phthalsäure Acid Ester-Bindung DNA Aptameren wird vorgestellt. Die Anwendung von der ausgewählten Aptamer in einem elektrochemischen Aptasensor ist ebenfalls enthalten.

Phthalsäure Acid Ester-Bindung DNA-Aptamer Auswahl, Charakterisierung und Anwendung eines elektrochemischen Aptasensor

Die mikroskalige Thermophorese erhält schnell Bindungskonstanten bei geringen Materialkosten. Entweder gekennzeichnete oder markierungsfreie mikroskalige Thermophorese ist kommerziell erhältlich; Die markierungsfreie Thermophorese ist jedoch nicht in der Lage, die Vielfalt der Wechselwirkungsmessungen zu erreichen, die mit fluoreszierenden Markierungen durchgeführt werden können. Wir bieten ein Protokoll für markierte Thermophoresemessungen an.

Einsatz der mikroskaligen Thermophorese zur Messung von Protein-Lipid-Wechselwirkungen

Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Messung der Adenin-Nukleotid-Bindung an Rezeptoren in Echtzeit in einer zellulären Umgebung vor. Die Bindung wird als Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) zwischen Trinitrophenylnukleotidderivaten und Proteinen, die mit einer nicht-kanonischen, fluoreszierenden Aminosäure markiert sind, gemessen.

Messung der Nukleotidbindung an intakte, funktionelle Membranproteine in Echtzeit

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Verwendung der isothermen Titrationskalorimetrie (ITC) zur Analyse der Assoziation und Dissoziationskinetik der Bindung zwischen einem DNA-Aptamer und Tetracyclin, einschließlich Probenvorbereitung, Ausführung von Standards und Proben und Interpretation der resultierenden Daten.

Bestimmung der thermodynamischen und kinetischen Assoziation eines DNA-Aptamers und Tetracyclins mittels isothermer Titrationskalorimetrie

Ein notwendiger Schritt in der Entwicklung von Antikrebs-Aptamern besteht darin, seine Bindung an das Ziel zu testen. Wir demonstrieren einen durchflusszytometrischen Assay zur Untersuchung dieser Bindung und betonen die Bedeutung der Einbeziehung eines Negativkontrollaptamers und Krebszellen, die für dieses bestimmte Protein positiv oder negativ sind.

Ein auf Durchflusszytometrie basierender Zelloberflächenproteinbindungsassay zur Beurteilung der Selektivität und Spezifität eines Antikrebs-Aptamers

Das vorliegende Protokoll demonstriert die Verwendung eines schnellen, 3-stufigen, Aptamer-basierten exponentiellen Amplifikations-Assays zur Detektion von Targets. Probenvorbereitung, Signalverstärkung und Farbentwicklung werden behandelt, um dieses System zu implementieren, um das Vorhandensein von Theophyllin gegenüber dem von Koffein zu erkennen.

Aptamer-basierte Target-Detektion durch eine 3-stufige isotherme G-Quadruplex-Amplifikationsreaktion

Dieses Protokoll beschreibt das Design von Split-Hybridisierungssonden, die das fluoreszierend leuchtende Aptamer DAP-10-42 als Signalreporter verwenden, und ihre Anwendung für den Nukleinsäurenachweis und die Differenzierung zwischen Zielen mit Einzelnukleotidsubstitutionen.

Split-Hybridisierungssonde unter Verwendung eines DNA-Fluoreszenz-Leuchtaptamers als Signalreporter für die sequenzspezifische Nukleinsäureanalyse

Erfahren Sie die Charakterisierung von Aptamer-Kleinstmolekül-Interaktionen mittels MicroScale Thermophoresis. Diese Methode ermöglicht die quantitative Bestimmung von Bindungsparametern wie Affinität und Stöchiometrie.

Kartierung der Bindungsstelle eines Aptamer auf ATP Mit Micro Thermophorese

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