Kartierung der Bindungsstelle eines Aptamer auf ATP Mit Micro Thermophorese

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, DNA-Aptamer-Wechselwirkungen mit kleinen Molekülen zu charakterisieren, einschließlich der Kartierung von Bindungsstellen, mittels mikroskaliger Thermophorese. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen zu grundlegenden Bindungsparametern molekularer Wechselwirkungen zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technologie besteht darin, dass sie unabhängig von der Größe des Interaktionspartners ist, so dass Qualitätskontrolldaten von schwierigen Wechselwirkungen zwischen Aptameren und kleinen Molekülen gewonnen werden können.

Obwohl diese Methode Einblicke in die Wechselwirkungen kleiner Moleküle mit Aptameren geben kann, kann sie auch auf andere molekulare Wechselwirkungen wie Wirkstoff-Ziel- oder Antigen/Antikörper-Wechselwirkungen angewendet werden. Um das Verfahren zu beginnen, bereiten Sie eine 100 Mikromolare Stammlösung des Cy5-markierten DNA-Aptamers DH25.42 in destilliertem Wasser vor. Verdünnen Sie dann die Aptamer-Stammlösung auf 200 Nanomolar mit Bindungspuffer.

Inkubieren Sie die Aptamer-Arbeitslösung zwei Minuten lang bei 90 Grad Celsius. Kühle die Lösung auf Eis auf Raumtemperatur ab. Als nächstes beschriften und legen Sie 200-Mikroliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Bindung für eine 16-stufige serielle Verdünnung des zu testenden Liganden bereit.

20 Mikroliter einer 10 millimolaren Stammlösung aus Ligand und Bindungspuffer werden in das Röhrchen 1 pipettiert. 10 Mikroliter Bindungspuffer in die Röhrchen 2 bis 16 pipettieren. Übertragen Sie dann 10 Mikroliter Ligandenmaterial von Röhrchen 1 in Röhrchen 2 und mischen Sie es gut mit der Pipette.

10 Mikroliter der verdünnten Mischung in Röhrchen 3 geben und gut mischen. Die serielle Verdünnung wird auf diese Weise fortgesetzt, wobei bei Bedarf Pufferverdünnungseffekte korrigiert werden, und die überschüssigen 10 Mikroliter aus Röhrchen 16 werden verworfen, wenn sie fertig sind. Geben Sie 10 Mikroliter der Aptamer-Arbeitslösung zu jeder Verdünnung und mischen Sie sie gut mit der Pipette.

Inkubieren Sie die Proben fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Ziehe dann jede Mischung in eine saubere Standardkapillare und achte darauf, dass du die Kapillare nur an den Enden berührst. Legen Sie die Kapillaren in absteigender Reihenfolge der Konzentration in den Tabletthalter.

Starten Sie das MST-Gerät und öffnen Sie die Gerätesteuerungssoftware. Aktivieren Sie die manuelle Temperaturregelung und stellen Sie die Temperatur des Geräts auf 25 Grad Celsius ein. Sobald das Instrument die richtige Temperatur erreicht hat, setzen Sie die Kapillarschale ein.

Stellen Sie den LED-Kanal auf Rot für Cy5-gekennzeichnetes Aptamer. Stellen Sie die LED-Leistung so ein, dass ein Fluoreszenzsignal von 500 Einheiten erreicht wird. Führen Sie dann einen Kapillarscan durch, um die Kapillarpositionen zu ermitteln und die Probenqualität zu überprüfen.

Wenn die resultierenden Peaks U-förmig oder abgeflacht sind, bereiten Sie neue Proben in codierten Kapillaren vor, um Klebeeffekte zu minimieren. Geben Sie in der MST-Gerätesoftware die Ligandenkonzentration und den Verdünnungstyp für die erste Kapillare ein. Klicken und ziehen Sie, um die Konzentrationen und Verdünnungen für die verbleibenden Kapillaren einzugeben.

Geben Sie die Konzentration des Aptamers in der endgültigen Mischung ein. Stellen Sie sicher, dass die Versuchsmethode so eingestellt ist, dass die Fluoreszenz fünf Sekunden lang detektiert wird, die MST 30 Sekunden lang aufgezeichnet wird und die Fluoreszenz dann fünf Sekunden lang nach dem Ausschalten des Lasers aufgezeichnet wird. Stellen Sie die Laserleistung auf 20 % einLegen Sie den Dateipfad fest und speichern Sie die Experimentdatei.

Starten Sie dann die MST-Messung. Erhalten Sie auf diese Weise mindestens drei Messungen. Um mit der Datenanalyse zu beginnen, öffnen Sie die MST-Analysesoftware, und laden Sie die Experimentdatei.

Wählen Sie MST als Analysetyp aus. Die Analysesoftware ermöglicht den Vergleich von technischen Wiederholungen, bei denen alle Messungen mit demselben Kapillarsatz durchgeführt wurden. Biologische Wiederholungen aus einem anderen Satz von Kapillaren können ebenfalls in die Analyse aufgenommen werden.

Klicken Sie auf die Informationsschaltfläche unter der ersten Messung. Überprüfen Sie die MST-Traces auf Unebenheiten oder Spitzen, die auf Aggregations- oder Niederschlagseffekte hinweisen. Untersuchen Sie dann den Kapillarscan und das Kapillarform-Overlay auf abgeflachte oder U-förmige Spitzen, die auf Klebe- oder Absorptionseffekte hinweisen.

Da Aggregate und Absorptionseffekte in MST schnell nachweisbar sind, ermöglicht die Methode eine schnelle und schnelle Optimierung des technischen Setups, um eine optimale Datenqualität zu gewährleisten. Überprüfen Sie, ob ligandenabhängige Fluoreszenzlöschungs- oder Verstärkungseffekte im Kapillarscan und in der Anfangsfluoreszenz vorhanden sind. Überprüfen Sie die Fluoreszenzveränderung im Laufe der Zeit auf Anzeichen von Photobleichen oder Fotoverbesserung.

Sobald die Datenqualität überprüft wurde, wechseln Sie in den Dosis-Wirkungs-Modus. Wählen Sie die Einstellung für die Expertenanalyse in der Auswertungsstrategie T Jump MST aus. Wählen Sie dann das Hügelmodell für die Kurvenanpassung aus, um die Bindungsparameter automatisch zu berechnen.

Wählen Sie im Menü "Ergebnisse vergleichen" einen Normalisierungstyp aus. Exportieren Sie die normalisierten Daten als Tabellenkalkulation oder PDF-Datei. In diesem Verfahren wurde MST verwendet, um die Bindungsinteraktionen eines einzelsträngigen DNA-Aptamers mit einer Auswahl von niedermolekularen Liganden zu untersuchen.

Die MST-Kurven wurden mit der Hügelgleichung angepasst und die halben maximalen effektiven Konzentrationswerte bestimmt. In fünf unabhängigen biologischen Wiederholungsmessungen des Aptamers mit ATP zeigte die ATP-Aptamer-Wechselwirkung eine negative Bindungsamplitude von 6 bis 13 Einheiten und einen durchschnittlichen EC50-Wert von etwa 52,3 Mikromolaren. Die Daten für jeden Liganden wurden auf den Anteil der gebundenen Moleküle normiert und dann verglichen.

Die EC50-Werte für ADP, AMP und SAM im Vergleich zu ATP deuten darauf hin, dass die Anzahl der Phosphatgruppen allenfalls einen geringen Einfluss auf das Aptamerbindungsverhalten hat. Die Entfernung der robo-C2-Hydroxalgruppe zeigte ebenfalls nur einen geringen Effekt auf die Aptamer-Bindungsaffinität. Das Aptamer bindete nicht, wenn keine Paarungsgruppe vorhanden war oder wenn die Paarungsgruppe in Guanin umgewandelt wurde.

Das Aptamer bindete nur an Adenin, was darauf hindeutet, dass die Adeningruppe die Hauptbindungsstelle für das Aptamer ist. Einmal gemeistert, kann diese Technik bei richtiger Anwendung innerhalb von Minuten bis Stunden wichtige Informationen über grundlegende Bindungsparameter liefern.