Phthalsäure Acid Ester-Bindung DNA-Aptamer Auswahl, Charakterisierung und Anwendung eines elektrochemischen Aptasensor

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, gruppenspezifische DNA-Aptamere für hochhydrophobe, kleine Moleküle auszuwählen und das ausgewählte Aptamer zur Entwicklung eines empfindlichen elektrochemischen Biosensors zu verwenden. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Aptamerauswahl zu beantworten, wie gruppenspezifische Aptamere ausgewählt und charakterisiert werden können, wenn die Ziele stark hydrophobe Moleküle sind. Der nützlichste Teil dieser Methode ist die Entwicklung von elektrochemischen Biosensoren zur Erkennung von Titeln.

Diese Biosensoren sollten auch für unsere Aptamer-Affinitätsmessungen funktionieren. Um die Reaktion zu starten, fügen Sie dem gereinigten Aptamer-PCR-Produkt 100 Mikroliter RNase-freies Wasser hinzu. Die Mischung so lange zerkleinern, bis sich der Niederschlag aufgelöst hat.

Die Lambda-Exonuklease-Reaktion reagiert empfindlich auf die Salzkonzentration und ist ein Produkt, das durch Ethanolfällung proliferiert werden sollte, aber ein anderes Isopropanol. In jedes der fünf Mikrozentrifugenröhrchen werden jeweils fünf Mikroliter der Aptamerlösung, 11 Mikroliter rrasefreies Wasser und zwei Mikroliter 10x Reaktionspuffer gegeben. Geben Sie zwei Mikroliter rnasefreies Wasser und Lösungen von zwei, fünf, acht und 10 Einheiten Lambda-Exonuklease in rnasefreiem Wasser in jeweils ein Röhrchen.

Mit leichtem Pipettieren gut mischen. Inkubieren Sie die Röhrchen 35 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 15 Minuten lang bei 80 Grad Celsius. Halten Sie dann die Tuben bei vier Grad Celsius und bereiten Sie ein natives Seitengel mit 12 % vor.

Geben Sie in jede Tube einen Mikroliter Ladefarbstoff und vier Mikroliter rnasefreies Wasser. Lassen Sie die Mischungen im nativen Seitengel 45 Minuten lang bei 150 Volt laufen. Identifizieren Sie die geringste Menge an Lambda-Exonuklease, die zur vollständigen Erzeugung einzelsträngiger DNA erforderlich ist.

Führen Sie eine groß angelegte Reaktion durch, um einzelsträngige DNA zu erzeugen. Für jedes zu testende Bindungsziel werden 10 Mikroliter mittlerer funktionalisierter DBP-kodierter magnetischer Kügelchen mit 500 Mikrolitern einer mikromolaren Lösung von DBP-1 für eine Stunde bei Raumtemperatur unter Rotation inkubiert. Entsorgen Sie dann den Überstand.

Waschen Sie die Kügelchen viermal mit 200 Mikrolitern PAE-Bindungspuffer und resuspendieren Sie die Kügelchen in 10 Mikrolitern PAE-Bindungspuffer. Erhalten Sie 10 mikromolare Bindungsziel-Testdispersionen in PAE-Bindungspuffer. Es eignet sich hervorragend zur Dispersion der hydrophoben Ziele im PAE-Bindungspuffer.

Um sicherzustellen, dass es eine Bereicherung der Bibliothek gibt, wurden im Rahmen von Affinitätstests ausgewählt. Geben Sie 10 Mikroliter DBP-1-codierte Kügelchen zu 110 Mikrolitern jeder Zieltestlösung. Die Mischungen werden eine Stunde lang inkubiert und die Überstände durch magnetische Trennung aufgefangen.

Verdünnen Sie die Überstände um das 100-fache und verwenden Sie für jede quantitative PCR drei Mikroliter. Berechnen Sie die relativen Affinitäten, indem die Anzahl der in Gegenwart der Testprobe freigesetzten DBP-1 durch die Anzahl der DBP-1 dividiert wird, die nur im PAE-Bindungspuffer freigesetzt wird. Vor der Durchführung der Messungen synthetisieren und reinigen Sie die DBP-1-basierte thiolierte Kernsequenzsonde und die Signalsonde.

Rekonstituieren Sie die thiolierte Sonde und die Signalsonde und als 100 mikromolare Lösungen in nukleasefreiem Wasser. Als nächstes polieren Sie eine Goldelektrode mit einem Durchmesser von zwei Millimetern mit einem, 0,3 und 0,5 Mikron Aluminiumoxidpulver und einem Mikrofasertuch jeweils fünf Minuten lang auf eine spiegelähnliche Oberfläche. Beschallen Sie die Elektrode nach jedem Polieren fünf Minuten lang in ultrareinem Wasser.

Tauchen Sie die polierte Elektrode in eine 0,5 molare Lösung von Schwefelsäure. Reinigen Sie die Elektrode mit 35 aufeinanderfolgenden zyklischen Voltammetrie-Scans von minus 0,4 bis positiv 1,2 Volt im Vergleich zu Quecksilberkalomel bei 100 Millivolt pro Sekunde. Anschließend wird in einem dünnwandigen Zentrifugenröhrchen eine Mischung aus 0,5 mikromolar thiolierter Sonde DBP-1 hergestellt.

Und 0,5 mikromolare FC modifizierte DBP-1 in 100 Mikrolitern PBS. Erhitzen Sie die Mischung in einem Wasserbad bei 95 Grad Celsius für 10 Minuten. Lassen Sie die Mischung dann im Wasserbad auf Raumtemperatur abkühlen.

Geben Sie einen Mikroliter einer 10 millimolaren TCEP-Stammlösung zu der abgekühlten Mischung und halten Sie sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Tauchen Sie dann die saubere Goldelektrode 12 Stunden lang bei Raumtemperatur in die Mischung. Spülen Sie die Elektrode mit PBS und tauchen Sie die Elektrode dann eine Stunde lang in eine millimolare Lösung von thioliertem PEG in PBS.

Spülen Sie die Elektrode gründlich mit zielfreiem PAE-Bindungspuffer und tauchen Sie die Elektrode in den Puffer. Anschließend werden Elektrolytzellen aus Platin-Gegenelektrode und einer gesättigten Kalomel-Referenzelektrode jeweils zwei Minuten lang in Reinstwasser und PAE-Bindungspuffer nacheinander beschallt. Öffnen Sie die Software für das Rechteckwellen-Voltammetrie-Instrument und geben Sie die Experimentparameter ein.

Füllen Sie eine saubere Elektrolysezelle mit zielfreiem PAE-Bindungspuffer. Verbinden Sie die drei sauberen Elektroden mit einem Potentiostaten und tauchen Sie die Elektroden in den Puffer ein. Erstellen Sie einen SWV-Scan im Hintergrund.

Tauchen Sie dann die Goldarbeitselektrode 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in eine 10 Picamol-DEHP-Lösung in PAE-Bindungspuffer. Spülen Sie die Elektrode gründlich mit PAE-Bindungspuffer aus. Tauchen Sie alle drei Elektroden in frischen PAE-Bindungspuffer und sammeln Sie eine weitere SWV-Kurve mit den gleichen Parametern wie zuvor.

Wiederholen Sie diesen Vorgang mit steigenden DEHP-Konzentrationen, um eine Titrationskurve zu erhalten. Die Mindestmenge an Lambda-Exonuklease, die erforderlich ist, um nur Einzelstrang-DNA zu erhalten, wurde auf der Grundlage von Reaktionen in kleinem Maßstab als zwei Einheiten ermittelt. Der Aptamerkandidat DBP-1 wurde mittels SELEX identifiziert, gefolgt von einer Hochdurchsatzsequenzierung.

DBP-1 zeigte eine gute Gruppenspezifität gegenüber PAE-Kongeneren. Ein elektrochemischer Aptasensor, der DBP-1 verwendete, reagierte selektiv auf DEHP gegenüber anderen gängigen Umweltschadstoffen. Der Aptasensor war sehr empfindlich gegenüber DEHP mit einer Reaktion bei Konzentrationen von nur 10 Picamol

Laserpartikel zur Auswahl und Charakterisierung von Aptameren für hydrophobe kleine Moleküle. Die Charakterisierung und Verflüchtigung von Aptameren hydrophober kleiner Moleküle wie PAE ist aufgrund der extrem begrenzten Wasserlöslichkeit und des geringen Molekülgewichts der PAEs im Allgemeinen eine große Herausforderung. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einen elektrochemischen Aptasensor herstellt und wie man ihn zur Erkennung von Titeln verwendet.