Protein Purification-freie Methode der Bindungsaffinität Bestimmung durch Microscale Thermophorese

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Bindungsaffinität einer Proteinligandeninteraktion zu bestimmen, ohne das Protein aus einem Zelllysat zu reinigen. Dies wird erreicht, indem zunächst das GFP-fusionierte Protein von Interesse in einer adhärenten Zelllinie exprimiert wird. Nach der Herstellung von Zelllysat- und Ligandenverdünnungen werden Zelllysat-Ligandengemische hergestellt und in Kapillaren geladen.

Als nächstes wird die Thermoresistenz des GFP-fusionierten Proteins in Gegenwart unterschiedlicher Ligandenkonzentrationen gemessen. Der letzte Schritt ist die Datenanalyse von mikroskaligen Thermopherese- oder MST-Messungen. Letztendlich wird die mikroskalige Thermoresis verwendet, um die Bindungsaffinitäten von Wechselwirkungen zwischen GFP-fusionierten Proteinen und verschiedenen Liganden zu bestimmen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Titration, Kalorimetrie oder Oberflächenplasma-Monotherapie besteht darin, dass sie die Proteinreinigung vermeidet, was die quantitative Charakterisierung binärer Wechselwirkungen erheblich vereinfacht und beschleunigt. Diese Methode bietet erhebliche Vorteile bei der Arbeit mit Proteinen, die schwer zu exprimieren und zu reinigen sind, wie z. B. Membranproteine und Transkriptionsfaktoren. Einer der größten Vorteile der mikroskaligen Thermopherese besteht darin, dass sie in einer Vielzahl von Puffern funktioniert und das Vorhandensein von Detergenzien und meinen Zellen im System toleriert. Karen Stefka, eine Biologin aus meinem Labor, wird die Technik demonstrieren. Um die Zellen kurz mit eiskalter, phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder PBS zu waschen, verwenden Sie 10 Milliliter Puffer pro T 75-Kolben.

Halten Sie die Zellen fünf Minuten lang auf Eis oder bis sie sich vom Kolben lösen. Kratzen Sie die Zellen mit dem Zellschaber ab, um sie bei Bedarf zu lösen. Die Zellen werden wieder in 10 Milliliter eiskaltem PBS suspendiert und in ein vorgekühltes 14-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit rundem Boden gegeben.

Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 400 bis 600 g und vier Grad Celsius für fünf Minuten. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in 200 Mikrolitern eiskaltem Lysepuffer. Die Suspension wird zur Extraktion von zytosolischen Proteinen in ein vorgekühltes 1,5-Milliliter-Einor-Röhrchen überführt.

Legen Sie die Zellen auf Eis, um eine lokale Überhitzung zu minimieren, und legen Sie die Zellen mit dreimal zehn Sekunden Ultraschallimpulsen bei 30% Amplitude. Halten Sie eine zwei bis drei Millimeter lange Pre-Chill-Spitze unter der Oberfläche, um das Aufschäumen zu minimieren. Lassen Sie diesen Schritt aus, wenn Sie Reinigungsmittel verwenden, das Puffer enthält, und inkubieren Sie es 30 Minuten lang auf Eis.

Stattdessen wird die Lysatlösung so korrigiert, dass sie eine physiologische Salzkonzentration von 100 millimolar Natriumchlorid enthält, falls erforderlich, aus einer Stammlösung von fünf molaren Natriumchlorid. Zum Schluss sammeln Sie die Lysate durch Zentrifugation bei etwa 25.000 g und vier Grad Celsius für 10 Minuten. Wählen Sie die Leuchtdiode oder LED-Anregungsquelle mit einer Wellenlänge von 470 Nanometern auf dem MST-Gerät aus.

Laden Sie die Kapillaren mit Zellextrakt, der zwei- und 10-mal mit MST-Puffer verdünnt ist, und legen Sie sie in das MST-Instrument. Führen Sie den Vorgang "Kapillaren suchen" in der Steuerungssoftware des MST-Instruments durch. Der optimale Fluoreszenzbereich in verdünntem Lysat liegt zwischen 400 und 1500 Fluoreszenzeinheiten.

Fahren Sie fort, um den optimalen Ligandenkonzentrationsbereich zu bestimmen, wie im Textprotokoll beschrieben. Platzieren Sie ein Röhrchengestell mit der erforderlichen Anzahl von 0,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit geringer Bindung auf Eispipetten, pipettieren Sie 25 Mikroliter MST-Puffer auf den Boden jedes Röhrchens, bei 25 Mikrolitern der Ligandenstammlösung in das erste Röhrchen und führen Sie eine serielle zweifache Verdünnung des Liganden mit den restlichen Röhrchen durch. Bewahren Sie das Gestell mit den Ligandenproben auf Eis auf.

Berechnen Sie die Zelllysatverdünnung, um den optimalen Gehalt des fluoreszierenden Zielproteins in den Bindungsreaktionen zu erhalten. Die endgültige Proteinkonzentration sollte nahe der erwarteten Bindungsdissoziationskonstante oder niedriger liegen und sollte angepasst werden, um die erforderliche Anzahl von Fluoreszenzzahlen zu erhalten. In der endgültigen Lösung verdünnen Sie das Zelllysat mit MST-Puffer.

Legen Sie 0,5-Milliliter-Röhrchen mit geringer Bindung in das Röhrchengestell gegenüber von Röhrchen mit Liganden-Serienverdünnungsproben. Geben Sie vorsichtig 15 Mikroliter des Zelllysats auf den Boden jedes Röhrchens. Versuchen Sie, die Rohrwände nicht zu berühren, um Probenverluste zu vermeiden.

Geben Sie 15 Mikroliter der Ligandenprobe mit der höchsten Konzentration in das entsprechende Röhrchen. Nummer eins, mit dem Zelllysat. Gut mischen und die Pipettenspitze wechseln.

Wiederholen Sie diesen Schritt mit den restlichen Röhrchen mit Ausnahme des letzten, das keinen Liganden enthalten sollte. Geben Sie 15 Mikroliter MST-Puffer in das letzte Röhrchen und mischen Sie. Füllen Sie die erste Kapillare zu etwa zwei Dritteln mit der Bindungsmischung aus der Röhre Nummer eins.

Kippen Sie sie, um die Lösung zur Mitte zu bewegen, und platzieren Sie die Kapillare auf der Kapillarschale in dieser Position. Nummer eins, wiederholen Sie diesen Schritt mit den restlichen Kapillaren. Die Kapillarenden können für längere Experimente mit Wachs verschlossen werden.

Setzen Sie das Fach in das MST-Gerät ein und schließen Sie die Instrumentenklappe. Wählen Sie als Nächstes die LED-Anregungsquelle mit einer Wellenlänge von 470 Nanometern aus. Führen Sie auf dem MST-Gerät den Befehl Kapillaren suchen aus, damit das Gerät die genauen Positionen der Kapillaren findet und die Fluoreszenz der Proben basierend auf der Intensität des Fluoreszenzsignals misst.

Passen Sie die LED-Leistung so an, dass sie in das Intervall von 400 bis 1500 Einheiten kommt. Klicken Sie auf die Schaltfläche Start, um das Thermo-Resis-Experiment durchzuführen. Für das Experiment kann mehr als eine Infrarot-Laserleistung ausgewählt werden.

Um den optimalen Temperaturgradienten für das jeweilige System zu finden, dauert es 10 bis 12 Minuten, einen Satz von 16 Kapillaren laufen zu lassen. Sammeln Sie Daten aus zwei bis drei Durchläufen für denselben Satz von Kapillaren, um die Reproduzierbarkeit der Messungen zu gewährleisten. Um mit der Datenanalyse zu beginnen, öffnen Sie die Analysesoftware und laden Sie den Projektordner.

In den angezeigten Informationen läuft der Viewer Select bei einer bestimmten IR-Laserleistung thermoretische Kurven gesammelt. Es gab die Möglichkeit, alle Thermoretikspuren, die unter verschiedenen Bedingungen gesammelt wurden, auf einmal zu öffnen und dann durch Ein- und Ausschalten beliebige Kurven für die Analyse auszuwählen. Wählen Sie im Diagrammfenster für die Auswertungspunkte die Thermoresis oder Thermopherese mit blauen und roten Linien für den T-Sprung aus.

Definieren Sie zwei Bereiche der experimentellen Kurven, die von der Software manuell für die Analyse ausgewählt werden. Stellen Sie sicher, dass die blauen und roten Linien korrekt positioniert sind, um die maximale Änderung der Thermo-Resis zu gewährleisten. Um die gemittelten Punkte mit Standardabweichungen zu erhalten, wählen Sie Durchschnitt verwenden oder Durchläufe für separate Durchläufe unterscheiden.

Um eine Anpassung der Dissoziationskonstante darzustellen, wählen Sie Durchschnitt verwenden, geben Sie den markierten Molekülkonzentrationswert ein, fixieren Sie ihn und passen Sie die Kurve an. Die Bindungsdissoziationskonstante oder der KD-Wert mit ihrer Standardabweichung wird in einem separaten Informations-Popup-Fenster angezeigt. Speichern Sie die Daten der durchschnittlichen Anpassung in einer Textdatei und übertragen Sie sie nach Excel.Heck.

2 9 3 Zellen, die STAT 3G FP exprimieren, wurden als Quelle für fluoreszenzmarkiertes Stat 3 verwendet. Für A-DNA-Bindungsassays führte die Bindung von hochgeladenen Oligonukleotiden zu signifikanten Veränderungen der STAT-3-Mobilität. Im Temperaturgradienten.

Das thermoretische Signal wird als Funktion der Oligonukleotidkonzentration aufgetragen. Jeder Datenpunkt stellt den Mittelwert von drei Messungen dar. Zur Anpassung und Bestimmung der scheinbaren KD-Werte wurde eine Nano-Zeitanalyse-Software verwendet.

Die scheinbaren Dissoziationskonstanten betrugen 37,9 plus oder minus 1,0 Mikromolar für die Bindung an das Gasmotiv und 23,3 plus oder minus 0,6 Mikromol für die Bindung an das at reiche Oligonukleotid s plus 100. Überraschenderweise zeigten s plus 100 Sequenzen eine etwas engere Bindung als Gas. In drei Messwiederholungen führte die Substitution von A bis G zu einer dramatischen Abnahme der Affinität der s plus 100-Mutante

Während die s plus 100 Mutante zwei keine nachweisbare Bindung zeigte, was die sequenzselektive Bindung von STAT drei bis s plus 100 bestätigt. Einmal gemeistert, kann diese Technik in weniger als zwei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist zu bedenken, dass die optimalen Bedingungen für die Extraktion von Membranproteinen für verschiedene Proteine unterschiedlich sind und in der Regel optimiert werden müssen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine Bindungsaffinität eines Proteins zu einem elegant bestimmen können, ohne das Protein aus der Zelle zu reinigen. Lysat.