Name: Identifizierung der Bindungsproteine kleiner Liganden mit der differentiellen radialen Kapillarwirkung des Ligandenassays (DRaCALA) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Lernen Sie DRaCALA zur Identifizierung von Bindungsproteinen kleiner Liganden in Escherichia coli. Diese Methode ermöglicht die schnelle und sensitive Analyse von Protein-Ligand-Interaktionen.

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Die Arbeit wird durch einen NNF-Projektzuschuss (NNF19OC0058331) für YEZ und das Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Marie Skłodowska-Curie-Finanzhilfevereinbarung (Nr. 801199) an MLS unterstützt.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62331/62331img1.jpg">

1. Herstellung von Ganzzelllysaten
<ol><li>Impfen Sie die E. coli K-12 ASKA ORFeome Collection Stämme15 in 1,5 ml Lysogeny Brühe (LB) mit 25 μg/ml Chloramphenicol in 96-Well-Tiefbrunnenplatten. Über Nacht (O/N) für 18 h bei 30 °C mit Schütteln bei 160 U/min wachsen. Am nächsten Tag isopropyl β-d-1-thiogalactopyranosid (IPTG) (letzte 0,5 mM) in die O/N-Kulturen geben, um die Proteinexpression bei 30 °C für 6 h zu induzieren.</li>
	<li>Pelletzellen bei 500 x g für 10 min. Die Pellets bis zum Gebrauch bei -80 °C einfrieren. Um die Zellen zu lysieren, fügen Sie 150 μL Lysepuffer L1 (40 mM Tris pH 7,5, 100 mM NaCl, 10 mMMgCl2,ergänzt mit 2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 40 μg/ml DNase 1 und 0,5 mg/ml Lysozym) hinzu, um das Pellet wieder zu resuspendieren.</li>
	<li>Die Zellen 30 min lang bei -80 °C einfrieren und dann 20 min bei 37 °C auftauen. Wiederholen Sie diesen Zyklus dreimal, um die Zellen zu lysieren. Lagern Sie die Lysate vor Gebrauch bei -80 °C.</li>
</ol>2. Reinigung von Relseq und GppA
HINWEIS: Die rekombinanten Proteine Relseq aus Streptococcus equisimilis und GppA aus E. coli K-12 werden verwendet, um die radioaktiv markierten ppGpp bzw. ppGpp zu synthetisieren.
<ol><li>Wachsen und sammeln Sie Zellen, die jedes Protein überexprimieren.<ol>
<li>Züchte den E. coli BL21 DE3-Stamm bis zu einer exponentiellen Phase (optische Dichte (OD) ~ 0,3-0,4) in LB-Brühe und spinne 1 ml Kultur bei 6000 x g für 5 min herunter. Dekantieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen mit 100 μL eiskalter TSB-Brühe (LB-Brühe ergänzt mit 0,1 g/ml PEG3350, 0,05 ml/ml Dimethylsulfoxid, 20 mMMgCl2).</li>
		<li>Mischen Sie die Plasmide mit dem histidin-markierten relseq und gppA,jeweils 100 ng, mit den oben genannten Zellsuspensionen in TSB und inkubieren Sie 30 Minuten lang auf Eis. Hitzeschock die Zellen bei 42 °C für 40 s. Legen Sie die Mischung für 2 min auf Eis und fügen Sie 1 ml LB-Brühe bei Raumtemperatur hinzu, damit sich die Zellen für 1 h bei 37 ° C mit Rühren bei 160 U / min erholen können.</li>
		<li>Platten die zurückgewonnenen Zellen auf LB-Agarplatten, ergänzt mit den entsprechenden Antibiotika (Rel seq:100 μg/ml Ampicillin; GppA: 30 μg/ml Kanamycin). Am nächsten Tag die Kolonien in LB-Brühe impfen, um O/N-Vorkulturen beider Stämme bei 37 °C zu starten.</li>
		<li>Nach 18 h impfen Sie 500 ml LB-Medium mit 10 ml der O/N-Kulturen und den entsprechenden Antibiotika. Züchten Sie die Kulturen durch Schütteln bei 160 U /min bei 37 °C. Wenn der OD600nm 0,5-0,7 erreicht, induzieren Sie die Proteinexpression, indem Sie 0,5 mM IPTG hinzufügen und 3 h bei 30 °C mit Schütteln bei 160 U / min wachsen.</li>
		<li>Sammeln Sie die Zellen, indem Sie bei 6084 x g für 10 min bei 4 °C drehen. Das Pellet in 20 ml eiskaltem 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) wieder aufsuchen und bei 1912 x g für 20 min bei 4 °C erneut zentrifugieren. Dekantieren Sie den Überstand und frieren Sie die Pellets vor Gebrauch bei -20 °C ein.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nickel-Nitrilotretsäure (Ni-NTA) Affinitätsreinigung HINWEIS: Stellen Sie ab diesem Zeitpunkt sicher, dass die Proben kalt sind.<ol>
<li>Fügen Sie 40 mL eiskalten Lysepuffer L2 (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 5% Glycerin, 10 mM Imidazol, 10 mM β-Mercaptoethanol mit Proteasehemmern (EDTA-freie Tablette; siehe Materialtabelle)hinzu, um das Pellet wiederzuberuhen. Lyse der Zellen durch Beschallung (60% Amplitude, 2 s ON/ 4 s OFF für 8 min ON). Das Lysat durch Drehen bei 23.426 x g für 40 min bei 4 °C reinigen und mit dem Überstand zur Reinigung fortfahren.</li>
		<li>Bereiten Sie während der obigen Zentrifugation das Ni-NTA-Harz vor.<ol>
<li>500 μL homogenisiertes Ni-NTA-Harz in eine stehende Polypropylen-Chromatographiesäule geben und 15 minuten ruhen lassen und die Speicherlösung durchgehen. Waschen Sie das Harz zweimal mit 15 ml Reinstwasser und waschen Sie dann die Säule mit 15 ml des Lysepuffers L2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Laden Sie den geklärten Überstand des Zelllysats aus Schritt 1 auf die Säule und lassen Sie ihn durchfließen. Waschen Sie die Säule mit 30 mL Waschpuffer (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 5% Glycerin, 20 mM Imidazol).</li>
		<li>Eluieren Sie die Proteine mit 400 μL des Elutionspuffers (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 5% Glycerin, 500 mM Imidazol) dreimal. Wiederholen Sie dann die Elution mit weiteren 300 μL des Elutionspuffers. Kombinieren Sie die eluierten Proteine zu einem Endvolumen von 700 μL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gelfiltration<ol>
<li>Gelfiltrationspuffer vorbereiten (50 mM Tris, pH 7,5; 200 mM NaCl; 5% Glycerin). Waschen Sie die Größenausschlusssäule mit einem Säulenvolumen (25 ml) des Gelfiltrationspuffers.</li>
		<li>Laden Sie die oben genannten 700 μL-Probe mit einer 500-μL-Schleife, laufen Sie mit 0,5 ml / min und sammeln Sie 2-3 Fraktionen mit jeweils 0,5 ml Volumen, die die jeweiligen Proteine enthalten.</li>
		<li>Kombinieren und konzentrieren Sie die Fraktionen, die jedes der Proteine enthalten, mit einer Spinsäule und messen Sie die Proteinkonzentration mit dem Bradford-Assay.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Synthese von 32P-markierten pppGpp und ppGpp
<ol><li>Eine kleine Relseq-Reaktion wird in einem Schraubverschlussrohr montiert (siehe Tabelle 1). HINWEIS: Arbeiten Sie mit radioaktiven Reagenzien nur an einem lizenzierten Ort und mit persönlicher Schutzausrüstung.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2">Volumen (μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Kleiner Maßstab</td>
			<td>Großer Maßstab</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reinstwasser</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>10x Relseq Puffer*</td>
			<td>2</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>ATP (8 mM finale)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Relseq (4 μM Finale)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>
32 P-α-Guanosintriphosphat (GTP) (letzte 120 nM) (VORSICHT)</td>
			<td>0.2</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>gesamt</td>
			<td>20</td>
			<td>500</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Assemblierungsinformationen für die klein- und großräumigen Synthesereaktionen von 32P-markierten pppGpp. *10x Relseq-Puffer enthält 250 mM Tris-HCl, pH 8,6; 1M NaCl; 80 mMMgCl2. Abkürzung: pppGpp = Guanosinpentaphosphat.
<ol start="2"><li>Das Röhrchen bei 37 °C in einem Thermomixer für 1 h, dann bei 95 °C für 5 min inkubieren und für 5 min auf Eis legen. Drehen Sie das ausgefällte Protein bei 15.700 x g für 5 min herunter und übertragen Sie den Überstand (synthetisiert 32P-pppGpp) in ein neues Schraubverschlussrohr.</li>
	<li>Um 32P-ppGpp aus 32P-pppGpp zu synthetisieren, übertragen Sie die Hälfte des 32p-pppGpp-Produkts in ein neues Schraubverschlussrohr und fügen Sie 1 μM GppA hinzu. Inkubieren Sie das Röhrchen bei 37 °C für 10 min, bei 95 °C für 5 min und legen Sie es dann für 5 min auf Eis.</li>
	<li>Drehen Sie das ausgefällte Protein bei 15.700 x g für 5 min herunter und übertragen Sie den Überstand (synthetisiert 32P-ppGpp) in ein neues Schraubverschlussrohr.</li>
	<li>Analysieren Sie die 32P-pppGpp und 32P-ppGpp, indem Sie 1 μL der Proben auf einer Dünnschichtchromatographieplatte (TLC) (Polyethylenimin-modifizierte Cellulose-TLC-Platten) mit dem 1,5 M KH2PO4,pH 3,4, als mobile Phase laufen lassen. HINWEIS: Verwenden Sie dasα-32P-markierte Guanosin-5'-triphosphat(32P-α-GTP) als Kontrolle.</li>
	<li>Trocknen Sie die TLC-Platte vollständig, legen Sie sie zwischen eine transparente Kunststoffmappe und setzen Sie sie 5 Minuten lang einem Phosphorspeicher aus. Visualisieren und quantifizieren Sie die Signale mit einem Phosphorimager. HINWEIS: Wenn die Verhältnisse von 32P-pppGpp und 32P-ppGpp höher als 85% sind, könnte eine großräumige Reaktion (500 μL, ausreichend für das Screening von 20 96-Well-Platten) unter Verwendung von Tabelle 1zusammengesetzt und synthetisiert werden.</li>
</ol>4. DRaCALA-Screening der Zielproteine von (p)ppGpp
<ol><li>Auftauen und 20 μL ganzzellige Lysate auf eine 96-Well-V-Boden-Mikrotiterplatte übertragen. Fügen Sie 2,5 U/Well Endonuklease aus Serratia marcescenshinzu und inkubieren Sie bei 37 °C für 15 minuten, um die Lysatviskosität zu reduzieren. Die Lysate für 20 min auf Eis legen.</li>
	<li>Mischen Sie die 32P-pppGpp und 32P-ppGpp in einem Verhältnis von 1: 1 und fügen Sie 1x Lysepuffer L1 hinzu, um die Endkonzentration von (p) ppGpp gleich 4 nM zu machen. HINWEIS: Angesichts der chemischen Ähnlichkeit zwischen pppGpp und ppGpp vereinfacht eine Mischung aus beiden Chemikalien den Screening-Prozess.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette und gefilterte Pipettenspitzen, um 10 μL der (p)ppGpp-Mischung mit dem Zelllysat hinzuzufügen und zu mischen. Bei Raumtemperatur (RT) für 5 min inkubieren.</li>
	<li>Waschen Sie das 96 x Pin-Werkzeug, indem Sie 30 s lang eine 0,01%ige Lösung eines nichtionischen Reinigungsmittels einlegen und 30 s auf einem Seidenpapier trocknen. Wiederholen Sie das Waschen des Stiftwerkzeugs 3x.</li>
	<li>Legen Sie das Stiftwerkzeug in die obigen 96-Well-Probenplatten und warten Sie 30 s. Heben Sie das Stiftwerkzeug gerade nach oben und legen Sie es für 30 s gerade nach unten auf eine Nitrocellulosemembran. HINWEIS: Wenn ein Punkt fehlt, spoten Sie 2 μL der entsprechenden Proben mit einer Pipette und gefilterten Spitzen. Es ist ratsam, einen doppelten Punkt der gleichen Probe wie unten angegeben zu machen.</li>
	<li>Trocknen Sie die Membran für 5 min bei RT. Legen Sie die Membran zwischen eine transparente Kunststoffmappe und setzen Sie sie für 5 min einem Speicherphosphorsieb aus. Visualisieren Sie mit einem Phosphorimager.</li>
</ol>5. Quantifizierung und Identifizierung potenzieller Zielproteine
<ol><li>Verwenden Sie die Analysesoftware, die dem Phosphorimager zugeordnet ist, um die GEL-Datei der visualisierten Platten zu öffnen. Verwenden Sie die Array-Analysefunktion, um die 96 Punkte zu definieren, indem Sie ein Raster mit 12 Spalten x 8 Zeilen einrichten.</li>
	<li>Definieren Sie große Kreise, um den äußeren Rand der gesamten Flecken zu umschreiben (siehe Abbildung 1B). Exportieren Sie volumn+Background und Area der definierten großen Kreise und speichern Sie sie in einer Tabelle. HINWEIS: Positionieren Sie bei Bedarf jeden einzelnen Kreis neu, um sich perfekt mit den Flecken zu überlappen, und ändern Sie die Größe jedes einzelnen Kreises, um ihn etwas größer als den tatsächlichen Punkt zu machen.</li>
	<li>Vergrößern Sie die definierten Kreise, um die kleinen inneren Punkte zu umschreiben. Exportieren Sie volumn+Backgroundund Area der definierten kleinen Kreise und speichern Sie sie in einer Tabelle.</li>
	<li>Berechnen Sie die Bindungsbrüche in der Tabelle mithilfe der Gleichung in Abbildung 1B, und zeichnen Sie die Daten. Identifizieren Sie die potenziellen Bindungsproteine in den Vertiefungen, die im Vergleich zu den meisten anderen Vertiefungen hohe Bindungsfraktionen aufweisen.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62331/62331fig02.jpg"> Abbildung 2:Gesamtworkflow des DRaCALA-Screening-Prozesses. Die Proteinproduktion aus einer Escherichia coli ASKA-Sammlung wird induziert und die Zellen werden lysiert. Inzwischen werden die rekombinanten Proteine Relseq-Hisund GppA-His gereinigt und zur Synthese von 32P-markierten pppGpp und ppGpp aus 32P-α-GTP verwendet. Die radioaktiv markierten (p)ppGpp-Moleküle werden dann mit den Lysaten gemischt, und ein 96-Pin-Tool wird verwendet, um die Mischungen auf einer Nitrocellulosemembran zu erkennen, um sie anschließend einem Phosphorspeicherbildschirm, der Bildgebung und quantifizierung der radioaktiven Signale zu erweisen. Abkürzungen: DRaCALA = Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay; (p)ppGpp = Guanosinpenta- und Tetraphosphate; RT = Raumtemperatur; IPTG = Isopropyl β-d-1-thiogalactopyranosid; GTP = Guanosin-5'-triphosphat; SDS-PAGE = Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ; TLC = Dünnschichtchromatographie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62331/62331fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

<ol><li>Kalia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide%2C+c-di-GMP%2C+c-di-AMP%2C+cGMP%2C+cAMP%2C+%28p%29ppGpp+signaling+in+bacteria+and+implications+in+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Nucleotide, c-di-GMP, c-di-AMP, cGMP, cAMP, (p)ppGpp signaling in bacteria and implications in pathogenesis.</a> Chemical Society Reviews. 42 (1), 305-341 (2013).</li>
<li>Camilli, A., Bassler, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+small-molecule+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial small-molecule signaling pathways.</a> Science. 311 (5764), 1113-1116 (2006).</li>
<li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cAMP+capture+compound+mass+spectrometry+as+a+novel+tool+for+targeting+cAMP-binding+proteins%3A+from+protein+kinase+A+to+potassium%2Fsodium+hyperpolarization-activated+cyclic+nucleotide-gated+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The cAMP capture compound mass spectrometry as a novel tool for targeting cAMP-binding proteins: from protein kinase A to potassium/sodium hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 8 (12), 2843-2856 (2009).</li>
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<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nucleotide+pGpp+acts+as+a+third+alarmone+in+Bacillus%2C+with+functions+distinct+from+those+of+%28p%29+ppGpp%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The nucleotide pGpp acts as a third alarmone in Bacillus, with functions distinct from those of (p) ppGpp.</a> Nature Communications. 11 (1), 5388(2020).</li>
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</ol>

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt offenzulegen.

Einer der kritischen Schritte bei der Durchführung eines DRaCALA-Screenings besteht darin, gute Lysate ganzer Zellen zu erhalten. Zunächst sollten die getesteten Proteine in großen Mengen und in löslichen Formen hergestellt werden. Zweitens sollte die Lyse der Zellen vollständig sein und die Viskosität des Lysats muss minimal sein. Die Einbeziehung von Lysozym und die Verwendung von drei Gefrier-Tau-Zyklen reichen oft aus, um Zellen vollständig zu lysieren. Die freigesetzte chromosomale DNA macht das Lysat jedoch viskos ...

Bakterien verwenden mehrere kleine Signalmoleküle, um sich an sich ständig ändernde Umgebungen anzupassen1,2. Zum Beispiel vermitteln die Autoinduzierer, N-Acylhomoserinlactone und ihre modifizierten Oligopeptide, die interzelluläre Kommunikation zwischen Bakterien, um das Populationsverhalten zu koordinieren, ein Phänomen, das als Quorum Sensing bekanntist 2. Eine weitere Gruppe kleiner Signalmoleküle sind die NSMs, darunter das umfassend untersuchte zyklische Adenosinmonophosphat (cAMP), cyclisches Di-AMP, cyclisches Di-Guanosinmonophosphat (cyclisches Di-GMP) und Guanosin-Penta- und Tetraphosphate (p)ppGpp1. Bakterien produzieren diese NSMs als Reaktion auf eine Vielzahl von verschiedenen Stressbedingungen. Einmal produziert, binden diese Moleküle an ihre Zielproteine und regulieren mehrere verschiedene physiologische und metabolische Wege, um den angetroffenen Belastungen standzuhalten und das Überleben der Bakterien zu verbessern. Daher ist die Identifizierung der Zielproteine eine unumgängliche Voraussetzung, um die molekularen Funktionen dieser kleinen Moleküle zu entschlüsseln.
In den letzten zehn Jahren gab es einen Wissensboom über diese kleinen Signalmoleküle, hauptsächlich aufgrund mehrerer technischer Innovationen, die die Zielproteine dieser kleinen Moleküle enthüllten. Dazu gehören die Capture-Compound-Technik3,4,5und die differentielle radiale Kapillarwirkung des Ligandenassays (DRaCALA)6, die in diesem Artikel diskutiert werden soll.
DRaCALA wurde 2011 von Vincent Lee und Mitarbeitern6erfunden und nutzt die Fähigkeit einer Nitrocellulosemembran, freie und proteingebundene Liganden differentiell zu sequestriert. Moleküle wie Proteine können nicht auf einer Nitrocellulosemembran diffundieren, während kleine Liganden wie die NSMs dazu in der Lage sind. Durch Mischen des NSM (z. B., ppGpp) mit dem zu testenden Protein und Aufträgen auf der Membran sind zwei Szenarien zu erwarten (Abbildung 1): Wenn (p)ppGpp an das Protein bindet, wird das radioaktiv markierte (p)ppGpp vom Protein in der Mitte des Flecks zurückgehalten und diffundiert nicht nach außen, wodurch ein intensiver kleiner Punkt (d.h. B. starkes radioaktives Signal) unter einem Phosphorimager. Wenn (p)ppGpp jedoch nicht an das Protein bindet, diffundiert es frei nach außen, um einen großen Fleck mit gleichmäßigem radioaktivem Hintergrundsignal zu erzeugen.
Darüber hinaus kann DRaCALA die Wechselwirkung zwischen einem kleinen Molekül und einem ungereinigten Protein in einem ganzen Zelllysat nachweisen, wenn das Protein in ausreichender Menge vorhanden ist. Diese Einfachheit ermöglicht die Verwendung von DRaCALA bei der schnellen Identifizierung von Proteinzielen mithilfe einer ORFeome-Expressionsbibliothek. Tatsächlich wurden Zielproteine von cAMP7, cyclischem di-AMP8, cyclischem di-GMP9,10und (p)ppGpp11,12,13 systematisch unter Verwendung von DRaCALA identifiziert. Dieser Videoartikel verwendet (p)ppGpp als Beispiel, um die kritischen Schritte und Überlegungen bei der Durchführung eines erfolgreichen DRaCALA-Screenings zu demonstrieren und zu beschreiben. Es wird dringend empfohlen, eine ausführlichere Beschreibung von DRaCALA14 in Kombination mit diesem Artikel zu lesen, bevor Sie DRaCALA durchführen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62331/62331fig01.jpg"> Abbildung 1: Das Prinzip von DRaCALA. (A) Schematische Darstellung des DRaCALA-Assays. Weitere Informationen finden Sie im Text. (B) Quantifizierung und Berechnung des Bindungsanteils. Weitere Informationen finden Sie im Text. Kurz gesagt, die DRaCALA-Flecken werden analysiert, indem zwei Kreise gezeichnet werden, die den gesamten Fleck und den inneren dunklen Punkt(dhdas zurückgehaltene (p) ppGpp aufgrund der Bindung des getesteten Proteins) umschreiben. Das spezifische Bindungssignal ist das radioaktive Signal des inneren Kreises (S1) nach Subtraktierung des unspezifischen Hintergrundsignals (berechnet durch A1 × ((S2 -S1)/(A2-A1))). Der Bindungsanteil ist das spezifische Bindungssignal dividiert durch das gesamte radioaktive Signal (S2). Abkürzungen: DRaCALA = Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay; (p)ppGpp = Guanosinpenta- und Tetraphosphate; RT = Raumtemperatur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62331/62331fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

<table><tbody><tr><td>32P-&alpha;-GTP</td><td>Perkinelmer</td><td>BLU006X250UC</td><td></td></tr><tr><td>96 x Stiftwerkzeug</td><td>V& P Scientific</td><td>VP 404</td><td>96 Bolzenreplikator, auf 9 mm Zentren, 4,2 mm Bolzendurchmesser, 24 mm lange</td></tr><tr><td>96-Well-Mikrotiterplatte mit V-Boden</td><td>Sterilin</td><td>MIC9004</td><td>Sterilin Microplate V Well 611V96</td></tr><tr><td>Agar</td><td>OXOID - Thermo Fisher</td><td>LP0011</td><td>Agar Nr. 1</td></tr><tr><td>ASKA Sammelstamm</td><td>NBRP, SHIGEN, JAPAN</td><td></td><td>Ref: DNA Research, Band 12, Ausgabe 5, 2005, Seiten 291&ndash;299. https://doi.org/10.1093/dnares/dsi012</td></tr><tr><td>Benzonase</td><td>SIGMA</td><td>E1014-25KU</td><td>gentechnisch veränderte Endonuklease aus Serratia marcescens</td></tr><tr><td>Bradford Protein Assay Farbstoff</td><td>Bio-Rad</td><td>5000006</td><td>Reagenzkonzentrat</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>SIGMA</td><td>D8418</td><td>&ge; 99,9%</td></tr><tr><td>DNase 1</td><td>SIGMA</td><td>DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>Gelfiltration 10x300 Säule</td><td>GE Healthcare</td><td>28990944</td><td>enthält 20% Ethanol als Konservierungsmittel</td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>PanReac AppliChem</td><td>122329.1214</td><td>Glycerin 87% für die Analyse</td></tr><tr><td>Hyperkassette</td><td>Amersham</td><td>RPN 11647</td><td>20 x 40 cm</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>SIGMA</td><td>56750</td><td>puriss. &ge; 99,5% (GC)</td></tr><tr><td>IP Speicher Phosphor Sieb</td><td>FUJIFILM</td><td>28956474</td><td>BAS-MS 2040 20x 40</td></tr><tr><td>cm Isopropyl &beta;-d-1-thiogalactopyranosid (IPTG)</td><td>SIGMA</td><td>I6758</td><td>Isopropyl &beta;-D-Thiogalactosid</td></tr><tr><td>Lysogene Bouillon (LB)</td><td>Invitrogen - Thermo Fisher</td><td>12795027</td><td>Miller's LB Bouillon Base</td></tr><tr><td>Lysozym</td><td>SIGMA</td><td>L4949</td><td>aus Hühnereiweiß; BioUltra, lyophilisiertes Pulver, &ge; 98%</td></tr><tr><td>MgCl2 (Magnesiumchlorid)</td><td>SIGMA</td><td>208337</td><td></td></tr><tr><td>MilliQ Wasser</td><td></td><td></td><td>Reinstwasser</td></tr><tr><td>Mehrkanalpipette</td><td>Thermo Scientific</td><td>4661110</td><td>F1 - Clip Tip; 1-10 ul, 8 x Kanäle</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR Chemicals</td><td>27810</td><td>AnalaR NORMAPUR, ACS, Reag. Ph. Eur.</td></tr><tr><td>Ni-NTA Agarose</td><td>Qiagen</td><td>30230</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose Blotting Membran</td><td>Amersham Protran</td><td>10600003</td><td>Premium 0,45 um 300 mm x 4 m</td></tr><tr><td>PBS</td><td>OXOID - Thermo Fisher</td><td>BR0014G</td><td>Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (Dulbecco A), Tabletten</td></tr><tr><td>PEG3350 (Polyethylenglykol 3350)</td><td>SIGMA</td><td>202444</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)</td><td>SIGMA</td><td>93482</td><td>Phenylmethansulfonylfluoridlösung - 0,1 M in Ethanol (T)</td></tr><tr><td>Phosphor-Imager</td><td>GE Healthcare</td><td>28955809</td><td>Typhoon FLA-7000 Phosphor-Imager</td></tr><tr><td>Pipettenspitzen, gefiltert</td><td>Thermo Scientific</td><td>94410040</td><td>ClipTip 12,5 &mu; l unsterile</td></tr><tr><td>Poly-Prep Chromatographie-Säule</td><td>Bio-Rad</td><td>7311550</td><td>Polypropylen-Chromatographie-Säule</td></tr><tr><td>Protease-Inhibitor Mini</td><td>Pierce</td><td>A32955</td><td>Tabletten, EDTA-freies</td></tr><tr><td>Schraubverschluss-Röhrchen</td><td>Thermo Scientific</td><td>3488</td><td>Mikrozentifugenröhrchen, 2,0 ml mit Schraubverschluss, unsterile</td></tr><tr><td>SLS 96-Deep Well Platten</td><td>Greiner</td><td>780285</td><td>MASTERBLOCK, 2 ML, PP, V-Boden,</td></tr><tr><td>natürliche Spin-Säule</td><td>Millipore</td><td>UFC500396</td><td>Amicon Ultra -0,5 ml Zentrifugalfilter</td></tr><tr><td></td><td>Thermomixer Eppendorf</td><td>5382000015</td><td>Thermomixer C</td></tr><tr><td>DC-Platte (PEI-Zellulose F DC-Platten)</td><td>Merck Millipore</td><td>105579</td><td>DC PEI-Zellulose F (20 x 20 cm)</td></tr><tr><td>Tris</td><td>SIGMA</td><td>BP152</td><td>Tris Base für Molekularbiologie</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>SIGMA</td><td>P1379</td><td>viskoses nichtionisches Waschmittel</td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>SIGMA</td><td>M3148</td><td>99% (GC/Titration)</td></tr></tbody></table>

identifizierung der bindungsproteine kleiner liganden mit der differentiellen radialen kapillarwirkung des ligandenassays (dracala)

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

In den letzten zehn Jahren gab es enorme Fortschritte beim Verständnis kleiner Signalmoleküle in der bakteriellen Physiologie. Insbesondere die Zielproteine mehrerer nukleotid-abgeleiteter Sekundärbotenstoffe (NSMs) wurden systematisch identifiziert und in Modellorganismen untersucht. Diese Erfolge sind hauptsächlich auf die Entwicklung mehrerer neuer Techniken zurückzuführen, darunter die Capture-Compound-Technik und die differentielle radiale Kapillarwirkung des Ligandenassays (DRaCALA), mit denen Zielproteine dieser kleinen Moleküle systematisch identifiziert wurden. Dieser Artikel beschreibt die Verwendung der NSMs, Guanosinpenta- und Tetraphosphate (p)ppGpp, als Beispiel und Videodemonstration der DRaCALA-Technik. Unter Verwendung von DRaCALA wurden 9 von 20 bekannten und 12 neuen Zielproteinen von (p)ppGpp im Modellorganismus Escherichia coli K-12 identifiziert, was die Leistungsfähigkeit dieses Assays demonstriert. Prinzipiell könnte DRaCALA zur Untersuchung kleiner Liganden verwendet werden, die durch radioaktive Isotope oder Fluoreszenzfarbstoffe markiert werden können. Die kritischen Schritte, Vor- und Nachteile von DRaCALA werden hier für die weitere Anwendung dieser Technik diskutiert.

Das Befolgen des oben beschriebenen Protokolls führt in der Regel zu zwei Arten von Ergebnissen (Abbildung 3).
Abbildung 3A zeigt eine Platte mit relativ geringen Hintergrundbindungssignalen (Bindungsfraktionen &lt; 0,025) aus der Mehrzahl der Vertiefungen. Das positive Bindungssignal der Bohrung H3 ergibt einen Bindungsanteil von ~0,35, der viel höher ist als der, der für die anderen Vertiefungen beobachtet wurde. Selbst ohne Quantif...

Der Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA) kann verwendet werden, um kleine ligandenbindende Proteine eines Organismus unter Verwendung einer ORFeome-Bibliothek zu identifizieren.

Identifizierung der Bindungsproteine kleiner Liganden mit der differentiellen radialen Kapillarwirkung des Ligandenassays (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...

Kleine Signalmoleküle zielen auf verschiedene Effektorproteine ab, um die bakterielle Virulenz und die menschliche Biologie zu kontrollieren. Diese Effektorproteine sind jedoch schwierig zu identifizieren. Als systembiologisches Werkzeug ermöglicht DRaCALA eine praktikable, schnelle und hochempfindliche Identifizierung der unbekannten Effektorproteine unter Verwendung einer OVium-Bibliothek.DRaCALA könnte verwendet werden, um jedes kleine Signalmolekül zu untersuchen, solange es entweder mit radioaktiven Isotopen oder fluoreszierenden Farbstoffen markiert werden kann. Beginnen Sie mit der Impfung von E.coli in 1,5 Milliliter LB, ergänzt mit 25 Mikrogramm pro Milliliter Chloramphenicol in jeder Vertiefung von 96-Well-Tiefbrunnenplatten für eine Nachtinkubation bei 30 Grad Celsius und 160 Umdrehungen pro Minute. Am nächsten Morgen die Nachtkulturen sechs Stunden lang bei 30 Grad Celsius mit 500 mikromolaren IPTG behandeln, um die Proteinexpression zu induzieren.Am Ende der Inkubation die Zellen durch Zentrifugation pelletieren, den Überstand entfernen und die Proben bei minus 80 Grad Celsius einfrieren. Um die Lyse einzuleiten, resuspendieren Sie die Pellets in 150 Mikroliter Lysepuf

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Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Dieses Video beschreibt die Methode zur Analyse der Protein-Liganden-Interaktion durch Mobilitätsverschiebungs-Affinitäts-Kapillarelektrophorese. Diese Methode kann verwendet werden, um das Bindungsverhalten eines Proteins mit verschiedenen geladenen Liganden zu charakterisieren.

Mobilitätsverschiebung Affinitätskapillarelektrophorese: Eine Methode zur Analyse von Proben-Liganden-Wechselwirkungen in Abhängigkeit von der differentiellen Migration von Protein-Liganden-Komplexen

Dieses Video zeigt die differentielle radiale Kapillarwirkung des Ligandenassays — eine Technik zum systematischen Hochdurchsatz-Screening von intrazellulären Nukleotid-Second-Messenger-bindenden Proteinen. Diese Technik ermöglicht eine direkte Bindung der Botenstoffe an das überexprimierte Zielprotein im Zelllysat – unter Umgehung der Notwendigkeit einer Proteinreinigung.

Differentielle radiale Kapillarwirkung des Liganden-Assays: Eine Hochdurchsatztechnik zur Identifizierung von bakteriellen Nukleotid-Second-Messenger-bindenden intrazellulären Proteinen

Microscale Thermophorese (MST) kann in weiten Bereichen zur Bestimmung der Bindungsaffinität werden ohne Reinigung des Zielproteins aus Zelllysaten. Das Protokoll umfasst die Überexpression des GFP-Fusionsprotein, Zell-Lyse in nicht-denaturierenden Bedingungen, sowie Erkennung MST Signal in der Gegenwart von variierenden Konzentrationen des Liganden.

Protein Purification-freie Methode der Bindungsaffinität Bestimmung durch Microscale Thermophorese

Die dynamische Differential-Fluorimetrie ist eine weit verbreitete Methode zum Screening von Bibliotheken kleiner Moleküle auf Wechselwirkungen mit Proteinen. Hier stellen wir eine einfache Methode vor, um diese Analysen zu erweitern, um eine Schätzung der Dissoziationskonstante zwischen einem kleinen Molekül und seinem Proteinpartner zu erhalten.

Bestimmung der Protein-Ligand-Wechselwirkungen mit Differential Scanning Fluorimetrie

Die vorgestellten Protokolle beschreiben zwei enzymgekoppelte Immunsorbentassays (ELISA) basierende Techniken zur schnellen Untersuchung von Ligand-Rezeptor-Interaktionen: Der erste Assay ermöglicht die Bestimmung der Dissoziationskonstante zwischen Ligand und Rezeptor. Der zweite Assay ermöglicht eine schnelle Überprüfung von blockierenden Peptiden für Ligand-Rezeptor-Interaktionen.

Ein ELISA-basierte Bindung und Wettbewerbsverfahren zu schnell zu bestimmen, Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen

Wir beschreiben hier eine Methode zur Identifizierung von kleinen Molekül-bindenden Proteinen mittels Photoaffinitätsmarkierung. Der Vorteil dieser Technik besteht darin, dass die Bindung und kovalente Markierung der Zielproteine in der lebenden zellulären Umgebung erfolgt, wodurch das Risiko einer Störung der nativen Proteinstruktur und der Bindungsbedingungen bei der Zelllyse ausgeschlossen wird.

Identifizierung von kleinen Molekülen-bindende Proteine ​​in nativer zellulären Umgebung von lebenden Zellen Photoaffinitatsmarkierung

Hier das Protokoll beschreibt die Wechselwirkungen von gereinigten hEAG1 Ionen-Kanal-Protein mit niedermolekularer Lipid Liganden Phosphatidylinositol 4, 5-Bisphosphate (PIP-2). Die Messung zeigt, dass BLI eine mögliche Methode für neue kleine Molekül-Ion Channel Liganden Screening werden könnte.

Erfassung der Interaktion Kinetics eines Ionenkanals Proteins mit kleinen Molekülen durch die Bio-Schicht Interferometrie Assay

Ein detailliertes Protokoll, eine Titrierung ELISA durchzuführen wird beschrieben. Darüber hinaus wird ein neuartiger Algorithmus, Titration ELISAs zu bewerten und zu einer Dissoziationskonstante Bindung eines lösliche Liganden an einen Mikrotiter Platte immobilisiert Rezeptor präsentiert.

Titration ELISA als eine Methode zur Bestimmung der Dissoziationskonstante Rezeptor Liganden Interaktion

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Herstellung und Reinigung von Proteinen, die gekennzeichnet sind mit stabilen Isotopen und anschließende Charakterisierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen mit Spektroskopie der Kernspinresonanz (NMR) und MicroScale Thermophorese (MST) Experimente.

Messung der Interaktionen von Kugelsternhaufen und filamentösen Proteinen Kernresonanzspektroskopie (NMR) und Microscale Thermophorese (MST)

Die Methode der Autoradiographie wird routinemäßig zur Bindung von Radioligands an Gewebeschnitten zur Bestimmung der qualitativen oder quantitativen Pharmakologie zu studieren.

Autoradiographie als eine einfache und leistungsfähige Methode zur Visualisierung und Charakterisierung von pharmakologischen Ziele

Lernen Sie DRaCALA zur Identifizierung von Bindungsproteinen kleiner Liganden in Escherichia coli. Diese Methode ermöglicht die schnelle und sensitive Analyse von Protein-Ligand-Interaktionen.

Identifizierung der Bindungsproteine kleiner Liganden mit der differentiellen radialen Kapillarwirkung des Ligandenassays (DRaCALA) (Video) | JoVE Journal

Identifizierung der Bindungsproteine kleiner Liganden mit der differentiellen radialen Kapillarwirkung des Ligandenassays (DRaCALA)

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