Name: Thermostabilization, Expression, Reinigung und Kristallisation des menschlichen Serotonin-Transporter-Bound S -Citalopram (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie den menschlichen Serotonin-Transporter thermostabilisieren, exprimieren und kristallisieren. Diese Methode ermöglicht strukturelle Studien von Membranproteinen und liefert Erkenntnisse für die Arzneimittelentwicklung.

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Wir danken D. Cawley für die Erzeugung monoklonaler Antikörper. Wir danken A. Penmatsa und K. Wang für den Austausch von Ideen und Fachwissen, die mit dem Dopamintransporter entwickelt wurden. L. Vaskalis für die Unterstützung bei den Abbildungen, H. Owen für die Hilfe bei der Vorbereitung des Manuskripts und andere Mitglieder des Gouaux-Laboratoriums für hilfreiche Gespräche. J.A.C. wird von einem Banting-Postdoktorandenstipendium der Canadian Institutes of Health Research unterstützt. E.M.G. wird durch das Graduate Research Fellowship der National Science Foundation unterstützt. Wir danken besonders Bernie und Jennifer LaCroute für ihre großzügige Unterstützung sowie für die Finanzierung durch das NIH (5R37MH070039). E.G. ist Forscher am Howard Hughes Medical Institute.

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Bestimmung der Membranproteinstruktur durch biophysikalische Techniken wie vor eine schwierige Organismus für viele medizinisch signifikante Transporter, Rezeptoren und Kanälen 11. Hier haben wir detaillierte Know - how für die Strukturbestimmung des menschlichen Serotonintransporter zu S -Citalopram gebunden entwickelt teilen. Wir gehen davon aus, dass diese Methoden nützlich sein werden Strukturen von SERT in anderen Konformationen sowie Strukturen anderer schwer Membranproteine ​​zu bestimmen. Darüber hinaus hier beschriebenen biochemischen Techniken können auch in Wasch- und einer nahezu nativen Lipidumgebung zu studieren Funktion von gereinigtem SERT verwendet werden. SERT Kristallisation angelenkt auf der Entwicklung verschiedener Werkzeuge und Techniken. Erste Verbesserungen der Transporter thermische Stabilität erzeugt SERT - Varianten , die in verschiedenen Detergensmicellen nach der Extraktion des Transporters aus Membranen 6 gut erzogene wurden. Zweitens ist die Verwendungdes hochaffinen Liganden S -Citalopram gesamten Reinigung und Kristallisation weiter verbesserte Stabilität und verringerte Konformationsheterogenität. Drittens, die Entwicklung des BacMam Expressionssystem 7 für die Produktion von großen Mengen an SERT in einem kurzen Zeitraum von 2 Wochen erlaubt, sowohl die Immunisierung und die Kristallisation zu erleichtern. Schließlich wählen die Entwicklung von Strategien für die hochaffine Antikörper, die für die Entdeckung des 8B6-Antikörpers erlaubt 3D-Epitope erkennen, die gut geordnete Packung von SERT-Antikörper-Komplexe in Kristalle fördert. Es gibt eine Reihe von kritischen Schritte und Reagenzien sowie gemeinsame Probleme, die häufig während des gesamten Protokolls auftreten. Erstens kann die Erzeugung hoher Titer SERT P2 Virus problematisch sein. Zugabe von niedrigen Konzentrationen von P1 P2 Virus Virus zu erzeugen, wie in diesem Protokoll beschrieben mildert dieses Problem normalerweise, und in Fällen, in denen der P2 Virustiter niedrig ist, kann P3 Virus usin gemacht werdeng-Virus bei einer MOI von 0,0001. Viren mit einem Titer von weniger als 1 x 10 8 Viruspartikel / ml verwendet werden soll und in geringen Proteinausbeuten fast immer führen wird. Für die Expression HEK293s GnTI- - wurden die Zellen , da sie N -Acetylglucosaminyltransferaseaktivität I - Aktivität fehlt gewählt und somit nicht komplexe N - Glycane synthetisieren kann, statt nur eine hohe Mannose N - Glycane produzieren. EndoH spaltet N -verknüpftem Glykosylierung von hoher Mannose Glykane an zwei Standorten in extrazellulären Schleife 2 (EL2), ein N Acetylglucosamin an Asparagin gebunden zu verlassen. Die Verdauung von N -verknüpftem Zucker Oberfläche Entropie von EL2 reduziert , die für die Kristallisation wahrscheinlich wichtig ist. Für die Erzeugung von Antikörpern sollte die SERT IC für die Immunisierung verwendet werden. GFP ist in hohem Maße immunogen 12 und sollte nicht als Fusions - Tag verwendet werden , um Antikörper zu erzeugen , da es schwierig ist, vollständig durch SEC entfernen. Die flexible N- und C-Terminus von SERT waren auch nichtin dem Konstrukt enthalten, um Antikörper gegen diese Regionen zu vermeiden. Mäuse mit 30 ug rekonstituierten Protein immunisiert werden; weiterhin Mäuse bis hohe Serumkonzentrationen von Antikörpern erkannt werden können und erzeugen Hybridomzellen , wie 13 immunisieren. Ein thermostabilized Konstrukt ist in der Regel die beste Wahl für die Immunisierung; wenn der Transport gut erzogene und behält die biologische Aktivität nach der Reinigung, das ist oft ausreichend, um Antikörper zu erzeugen. Die 8B6-Antikörper wurde gegen WT SERT erhöht. Zur Kristallisation monodisperse Komplex nur die Spitzenfraktionen von SEC enthält, wie durch FSEC beurteilt sollte vereinigt und eingeengt werden. SERT-8B6 Kristalle wachsen in einem engen Bereich von Bedingungen und es gibt eine Reihe von Schritten, die ergriffen werden sollten, Probleme speziell auf SERT Kristallwachstum im Zusammenhang zu beheben. Tris-Base mit HCl eingestellt, sollte nicht in der Reservoirlösung verwendet werden, da dieser Puffer nicht das Kristallwachstum nicht unterstützt; es ist somit critischen anstelle Tris mit NaOH verwenden. SERT Kristalle wachsen in einem engen Konzentrationsbereich von PEG 400, so dass, wenn Kristalle wachsen nicht, oder wenn viele kleine Kristalle beobachtet werden, sogar eine kleine Zunahme oder Abnahme in der PEG 400-Konzentration würde beraten. Weiterhin wurde die additive 6-Aminohexansäure auch im optimierten Bildschirm verwendet Nukleation zu verbessern. Die Drop-Verhältnis von Protein: gut Lösung ist auch ein wichtiger Faktor für das Kristallwachstum zu bestimmen. Drop-Verhältnisse von 1,5 bis 2: 1 empfohlen, mit Drop-Verhältnisse näher an 2: 1 normalerweise das Wachstum größerer 3-dimensional Kristalle unterstützen. Schließlich ist die Verwendung von Low-Profile-24-Well-Platten auch entscheidend zu Kristallwachstum, was vermutlich auf Modifizierung der Rate der Dampfdiffusion. Ein alternativer Ansatz für die SPA - Verfahren wurde für Mutanten Bildschirm entwickelt , die die Ratten - Serotonin - Transporter in einer Kokain-gebundene Konformation unter Verwendung eines Filterbindungstest 5 stabilisieren. Dagegen sind die SPA baSed Assay ermöglicht sequenziellen Schritte Erhitzen durch Bestimmung des Anteils an SERT folgenden die an Liganden gebunden bleibt. Somit ermöglicht dies für die schnelle Bestimmung der Schmelztemperatur von einer kleinen Anzahl von Proben. Das SPA-Verfahren beruht auf der Verfügbarkeit eines radioaktiv markierten hochaffinen Liganden und wenn keine Liganden bekannt sind, die mit submikromolare Affinität binden dann ein alternativer Ansatz notwendig sein wird. Viele andere Methoden werden häufig zur Messung der Proteinstabilität wie Bindung von Fluoreszenzfarbstoffen und Kalorimetrie 14 , sondern sind mit niedrigem Durchsatz und sind entweder nicht in der Lage, direkt zu messen Funktion oder benötigen große Mengen an Protein eingesetzt. Wenn der SPA - Verfahren nicht verwendet werden kann, eine alternative Hochdurchsatz - Ansatz ist ein FSEC basierte Thermostabilität Assay 15 (FSEC-TS), wobei die Probe durch Abtrennen der Fraktion , gefolgt erhitzt wird transporter verbleibt. FSEC-TS ist ein nützlicher Ansatz für den Zugriff auf chromatographische Verhalten und oligomere Zustand und ist apowerful ergänzendes Instrument, das neben dem SPA-Verfahren verwendet werden können. Ein Vergleich der verschiedenen gemeinsamen Proteinexpressionssysteme wurde auch begünstigt die Verwendung von Säugetierzellen für SERT Ausdruck 16 und wenig überraschend ist dies wahrscheinlich der Fall für viele Proteine von Säugetieren gefunden. Die Methoden, die wir für die Expression verwendet wurden, für SERT zugeschnitten sind aber wahrscheinlich leicht anpassbar. Bedingungen, die hohe Expressionsniveaus begünstigen sollte sorgfältig durch Variieren der Zeit des Ausdrucks, der Temperatur, Viruskonzentration und das Vorhandensein von Histon-Deacetylase-Inhibitoren wie Natriumbutyrat identifiziert werden. Wir bevorzugen im Allgemeinen Affinitätsreinigung in einer milden Reinigungs langkettigen wie C12M zusammen mit CHS vor der Zubereitung Bindung hochaffinen Liganden zu binden. Die Rekonstitution hydrophobe Absorption unter Verwendung ist eine milde Technik, die wir gefunden haben, wirksam für mehrere andere Transporter und Rezeptoren zu sein. Ob dasnicht erfolgreich ist, kann die Entfernung von Detergenzien mit einer hohen kritischen Micellbildungskonzentrationen durch Dialyse, Verdünnung, oder SEC 17 das Antigen in solchen Waschmitteln eingesetzt ausreichend stabil bereitgestellt werden soll. In den Fällen, in denen keine geeigneten Antikörper gefunden werden, finden wir fast immer die Frage zu einem Verlust der Funktion oder Denaturierung des Antigens ist und in solchen Fällen führten wir erfolgreich neue Immunisierungen mit besonderem Augenmerk auf die Proteinbiochemie. Schließlich Liganden und Antikörper, die mit hoher Affinität binden sollte für eine rational geplante Kristallisationsexperiment bilden die Basis und durch die Ausnutzung einer thermostabilen Variante nehmen, kann man ein breiteres Spektrum von Bedingungen Bildschirm durch die Eigenschaften der verschiedenen Reinigungsmittel variiert. Weiterhin Kristallisation in einem lipiden Mesophasen 18 oder Verwendung Bicellen 19 sollte stets als Alternative zur Kristallisation in Mizellen betrachtet werden. Diese Prinzipien und Methoden können mit einigen modifi verwendet werdenKation für viele andere Transmembranproteine, die nur schwer von anderen Ausdruck Wirten zu exprimieren und zu reinigen, und besonders nützlich für die Strukturbestimmung von Zielen von hochaffinen Drogen sein.

Der Serotonintransporter (SERT) ist ein integrales Membranprotein, das den Transport von Serotonin durch Zellmembranen 1 erleichtert. SERT gehört zu einer Familie von Neurotransmitter Sodium Symporter (NSS) , die auch die 2 Dopamin und Noradrenalin - Transporter umfasst. SERT ist das molekulare Ziel von häufig verschriebenen Antidepressiva und Anti-Angst - Medikamente , die kompetitiv wirken , um Serotonin - Transport 3 hemmen. SERT nutzt die energetisch günstige cotransport Natrium Neurotransmitter aus dem synaptischen Spalt zu entfernen. Umfangreiche Charakterisierung des serotonergen Systems hat gezeigt , dass Veränderungen in der Serotonin - Stoffwechsel praktisch alle neurologischen Prozesse einschließlich Stimmung zu beeinflussen scheinen, Schlaf, Schmerz, Kognition und Aggression Verhaltensweisen 4. SERT - Funktion kann durch den Einsatz von Antidepressiva und selektive Serotonin - Wiederaufnahmehemmer (SSRI) wie S -Citalopram modifiziert werden, sowie durch psychostimulants und Drogen Sucht wie Amphetamin und 3,4-methylenedioxy- N -methylamphetamine oder &quot;Ecstasy&quot; 1,2. SSRIs sind für die Behandlung von Stimmungsstörungen enorm wichtig, doch die genaue strukturelle Basis für ihre Tätigkeit ist nicht gut verstanden. WT SERT ist in Detergens - Mizellen instabil, wodurch Fortschritt behindert zu einer dreidimensionalen (3D) Struktur SERT 5,6. Kürzlich entwickelten wir Varianten von SERT , die in einer breiten Palette von Detergentien robust stabil sind und zu halten SSRI Bindungsaktivität 6. Diese thermo SERT-Varianten wurden unter Verwendung eines Scintillation-Proximity-basierten Thermo Assay ausgewählt. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Erzeugung von hochaffinen Antikörpern , die SERT binden kann, und die Reinigung und Kristallisation von thermo SERT, im Komplex mit Antikörper und S -Citalopram. Dieses Protokoll geht davon aus, dass die SERT und 8B6 Gene erfolgreich geweseny geklont in die BacMam 7 und Insekten - Expressionsvektoren sind. Antikörper, cDNA kodierend Reste 73-616 von WT SERT erzeugt wurde mit einem C-terminalen Strep - Tag II (SERT IC) in den BacMam Vektor kloniert. Für die thermische Stabilität Bildschirm SERT Reste 73-616 mit C-terminalen GFP, Strep II und 10-His - Tags (SERT TC) verwendet. Einzelpunktmutationen wurden in der SERT TC Hintergrund erzeugt. Für die Kristallisation Protokoll wurde das SERT-GFP - Fusionsprotein mit Twin-Strep [TrpSerHisProGlnPheGluLys (GlyGlyGlySer) 2 GlyGlySerAlaTrpSerHisProGlnPheGluLys] und 10-His - Tags verwendet, die thermo Mutanten Y110A, I291A und T439S und Mutationen der Oberflächen Cysteine C554A, C580A Trage und C622A (SERT CC). Thrombin - Spaltsequenzen (LVPRGS) wurden ebenfalls in den SERT CC nach Q76 und T618 zu ermöglichen Entfernung der N- und C-Termini eingesetzt. Das Plasmid, das das 8B6 Fab kodiert, wurde entwickelt, sowohl die schwere und leichte auszudrückenKetten des Antikörpers mit GP67 Sekretion Sequenzen unter der Kontrolle von zwei getrennten Polyhedrin-Promotoren. Der C-Terminus der schweren Kette des 8B6-Antikörper wurde mit einem 8-His-Tag und eine Thrombin-Spaltstelle wurde zwischen der schweren Kette und der Tag eingefügt markiert.

<table><tbody><tr><td>DH10Bac</td><td>Invitrogen</td><td>10361-012</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Fisher</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Fisher</td><td>BP918-1</td><td></td></tr><tr><td>Tetracyclin</td><td>Sigma</td><td>T-7660</td><td></td></tr><tr><td>Bluo-gal</td><td>Invitrogen</td><td>15519-028</td><td>5-Brom-3-indolyl &beta;-D-Galactopyranosid</td></tr><tr><td>Isopropyl beta-D-1-thiogalactopyranosid</td><td>Anatrace</td><td>I1003</td><td>IPTG</td></tr><tr><td>Miniprep kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>Cellfectin II</td><td>Invitrogen</td><td>10362-100</td><td>Sf9 Transfektionsreagenz</td></tr><tr><td>Sf9</td><td>ATCC</td><td>CRL-1711</td><td></td></tr><tr><td>Sf-900 III SFM Medien</td><td>Life Technologies</td><td>12658-027</td><td></td></tr><tr><td>HEK-293S GnTI-</td><td>ATCC</td><td>CRL-3022</td><td></td></tr><tr><td>Freestyle 293 Medien</td><td>Life Technologies</td><td>12338-018</td><td>293 Expressionsmedien</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>0984018DJ</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbutyrat</td><td>Sigma</td><td>303410</td><td></td></tr><tr><td>S-citalopram</td><td>Sigma</td><td>E4786</td><td>Anagrad</td></tr><tr><td>n-Dodecyl-beta-D-Maltopyranosid</td><td>Anatrace</td><td>D310</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterylhemmisuccinat</td><td>Sigma</td><td>C6013</td><td></td></tr><tr><td>1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>850457P</td><td></td></tr><tr><td>1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>850757P</td><td></td></tr><tr><td>1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>840457P</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin A</td><td>Sigma</td><td>P5318</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma</td><td>A1153</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Desthiobiotin</td><td>iba Life Sciences</td><td>2-1000-05</td><td></td></tr><tr><td>Asolectin</td><td>Sigma</td><td>11145</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterin</td><td>Sigma</td><td>C-8667</td><td></td></tr><tr><td>Lipid A</td><td>Sigma</td><td>L5399</td><td></td></tr><tr><td>Polares Lipid für das Gehirn</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>141101C</td><td></td></tr><tr><td>Biobeads</td><td>Biorad</td><td>152-3920</td><td>Hydrophobes Absorptionsharz</td></tr><tr><td>Ziege Anti-Maus IRDye 680RD</td><td>Odyssey</td><td>926-68070</td><td>Wird als Sekundärantikörper verwendet für Western Blotting</td></tr><tr><td>Lauryl Maltose Neopentylglykol</td><td>Anatrace</td><td>NG310</td><td>Anagrade</td></tr><tr><td>Serotonin</td><td>Sigma</td><td>H9523</td><td></td></tr><tr><td>pFastBac 8B6</td><td></td><td></td><td>Erhältlich von Autoren</td></tr><tr><td>pEG Bacmam SERT Strep II</td><td></td><td></td><td>SERTIC, Erhältlich von Autoren</td></tr><tr><td>pEG Bacmam SERT GFP twin Strep His</td><td></td><td></td><td>SERTTC, Verfügbar bei den Autoren</td></tr><tr><td>pEG Bacmam SERT ts3 GFP twin Strep His</td><td></td><td></td><td>SERTCC, Erhältlich bei den Autoren</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma</td><td>56749</td><td></td></tr><tr><td>n-Octyl &beta;-D-Maltosid</td><td>Anatrace</td><td>O310</td><td>Anagrade</td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Hämatologische Technologien</td><td>HCT-0020</td><td></td></tr><tr><td>EndoH</td><td>New England Biolabs</td><td>P0702</td><td></td></tr><tr><td>Trizma-HCl</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td>Tris wird zur Herstellung von Kristallisationsreservoirs</td></tr><tr><td>PEG 400</td><td>Sigma</td><td>91893</td><td></td></tr><tr><td>6-Aminohexansäure</td><td>Sigma</td><td>7260</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Fisher</td><td>MT25052CV</td><td></td></tr><tr><td>Isoplate-96 TC</td><td>PerkinElmer</td><td>6005070</td><td></td> verwendet</tr><tr><td>PolyJet</td><td>SignaGen</td><td>SL100688</td><td>Polymer-Transfektionsreagenz für Säugetierzellen</td></tr><tr><td>Kupfer HIS-Tag YSI SPA Beads</td><td>PerkinElmer</td><td>RPNQ0096</td><td>His-Tag Affinity SPA Kügelchen</td></tr><tr><td>Citalopram, [N-Methyl-3H]</td><td>PerkinElmer</td><td>NET1039250UC</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382000023</td><td>Heizblock für Thermostabilitätsassay</td></tr><tr><td>ThermoTop</td><td>Eppendorf</td><td>5308000003</td><td></td></tr><tr><td>SmartBlock PCR 96, Thermoblock für PCR-Platten</td><td>Eppendorf</td><td>5306000006</td><td></td></tr><tr><td>0,2 &micro; m Spritzenvorsatzfilter</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-243</td><td></td></tr><tr><td>1 L Filtersystem</td><td>Corning</td><td>430517</td><td></td></tr><tr><td>2 L Gewebekulturkolben mit flachem Boden</td><td>Genemate</td><td>F-5909-2000</td><td></td></tr><tr><td>2 L Gewebekulturflasche mit Bafflist</td><td>Genemate</td><td>F-5909-2000B</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Inkubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>3950</td><td></td></tr><tr><td>Forma Orbital Shaker</td><td>Thermo Scientific</td><td>416</td><td></td></tr><tr><td>Strep-Tactin-Harz</td><td>Iba Life Sciences</td><td>2-1208-025</td><td>Streptokokken-Affinitätsharz</td></tr><tr><td>Extruder</td><td>Northern Lipids</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Li-Cor-Bildgebungssystem</td><td>Odyssey</td><td></td><td>Western-Blot-Bildgebungssystem</td></tr><tr><td>XK16-Säule GE</td><td>Healthcare</td><td>28-9889-37</td><td>Säule für die Reinigung von Strep-Tactin und Talon</td></tr><tr><td>100 kDa MWCO-Proteinkonzentrator</td><td>Millipore</td><td>UFC910096</td><td></td></tr><tr><td>30 kDa MWCO-Proteinkonzentrator</td><td>Millipore</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>&Auml; kta FPLC</td><td>GE Healthcare</td><td>UPC-900</td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Shimadzu</td><td>51476</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 (10/300) Säule</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5172-01</td><td>Verwendet für FSEC</td></tr><tr><td>Tangentialflussapparatur</td><td>Pall Filtron</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,2 & Mikro; m Filter Tangentialflusszelle</td><td>Pall Filtron</td><td>PSM20C11</td><td></td></tr><tr><td>30 kDa MWCO Tangentialflusskonzentrator</td><td>Pall</td><td>Filtron OS030T12</td><td></td></tr><tr><td>Talon Harz</td><td>Clonetech</td><td>635504</td><td>His-Tag-Affinitätsharz für die Fab-Aufreinigung</td></tr><tr><td>1 mL HiTrap SP Säule</td><td>GE Healthcare</td><td>17115101</td><td>Kationenaustauscher für die Fab-Aufreinigung</td></tr><tr><td>Superdex 200 10/300 GL</td> Säule<td>GE Healthcare</td><td>17-5175-01</td><td>Wird für die SEC-Trennung von SERT-8B6</td></tr><tr><td>24-Well-VDXm-Platten</td><td>verwendet Hampton Research</td><td>HR3-306</td><td></td></tr><tr><td>18-mm-Deckgläser</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-239</td><td></td></tr><tr><td>Virocyt-Viruszähler</td><td>Virocyt</td><td>2100</td><td></td></tr><tr><td>MicroBeta Trilux</td><td>PerkinElmer</td><td>1450</td><td>96-Well-Szintillationszähler</td></tr><tr><td>HiTrap SP-Säule</td><td>GE Healthcare</td><td>17115101</td><td></td></tr><tr><td>Sertralin</td><td>Sigma</td><td>S6319</td><td></td></tr></tbody></table>

thermostabilization, expression, reinigung und kristallisation des menschlichen serotonin-transporter-bound<em&gt; s</em&gt; -citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Der Serotonintransporter ist ein Natrium und Chlorid-gekoppelten Transporter dass &quot;pumpt&quot; extrazelluläre Serotonin in die Zellen. S -Citalopram ein Medikament verwendet , Depression und Angst zu behandeln , indem auf den Serotonin - Transporter mit hoher Affinität bindet, Serotonin - Wiederaufnahme blockiert. Hier berichten wir über ein effizientes Verfahren und eine Reihe von Werkzeugen zur Stabilisierung, Express, zu reinigen und Serotonin - Transporter-Antikörper - Komplexe zu S -Citalopram und anderen Antidepressiva gebunden kristallisieren. Mutationen , die den Serotonin - Transporter wurden stabilisieren identifiziert einen S -Citalopram Bindungsassay unter Verwendung. Serotonin - Transporter in Baculovirus-transduzierten HEK293s GnTI- - Zellen exprimiert, wurde in Proteo wiederhergestellt und verwendet hochaffinen Antikörpern zu erhöhen. Wir haben eine Strategie entwickelt, Antikörper zu entdecken, die für strukturelle Untersuchungen nützlich sind. Ein einfacher Ansatz für die Expression von Antikörperfragmenten in Sf9 Zellen wurde ebenfalls festgestellt.Transporter-Antikörper - Komplexe mit diesem Verfahren gereinigt sind gut erzogene und leicht kristallisieren, Komplexe mit S -Citalopram produzieren , die Röntgenstrahlen auf 3-4 Å Auflösung beugen. Die Strategien entwickelt hier können die Struktur anderer anspruchsMembranProteine ​​zu bestimmen, verwendet werden.

Eine Bibliothek von Einzelpunktmutationen im SERT TC Hintergrund wurde für thermostabilisierende Mutationen Bildschirm erstellt. Einzelne Mutanten wurden unter Verwendung von Standard-Mutagenese erzeugt. Das Screening - Protokoll verwendet transient HEK293s Zellen und einer Scintillation - Proximity-basierten Thermo Bildschirm schnell Identität nützliche Mutationen zur Kristallisation transfiziert , wie in 1A dargestellt. Plotting Tm - Werte im Vergleich zu gebundenen [3 H] Citalopram bei RT zeigt Konstrukte mit hoher Thermostabilität und Expressionsniveaus geeignet zur Proteinreinigung (1B). Drei Mutanten (Y110A, I291A und T439S) wurden kombiniert , um eine hochstabile Konstrukt (Abbildung 1C) zu erzeugen. Thermostabilität ist auch mit einer erhöhten Stabilität in kurzkettigen Detergentien, die für die Kristallisation des SERT-Fab-Komplex korreliert. Das groß angelegte Expression von humanen SERT unter Verwendung von Baculovirus-transduced HEK293s GnTI- - Zellen können weniger als 2 Wochen dauern und Milligramm - Mengen produzieren kann, wie in 2A dargestellt. Verwendung des GFP-markiertes SERT CC Protein ermöglicht SERT bequem während der Expression und Reinigung durch Fluoreszenz (2B) folgen. Unsere Reinigungsstrategie einbezogen 1) Solubilisierung von SERT gebunden S -Citalopram aus HEK293s GnTI- - Zellen in C12M in Gegenwart von CHS als stabilisierendes Lipid; 2) Bindung von SERT an einer Streptokokken-Affinitätsmatrix; 3) Entfernung von verunreinigenden Proteinen durch ausgiebiges Waschen; und 4) Eluieren des funktionellen SERT mit Puffer , enthaltend Desthiobiotin (Abbildung 2C). Das eluierte Protein ist im Wesentlichen frei von anderen nachweisbaren Proteine durch Coomassie - Blau - Färbung und monodisperse wie durch FSEC (2D, E) beurteilt. Es wurde eine ähnliche Strategie SERT mit einem Strep-II-Tag zu reinigen genommen, die für reconstitutio verwendet wurde,n und Immunisierung (3A, B). Einbau von SERT in Proteo erhöht die Serumhalbwertszeit und Stabilität der SERT und verbessert die Wahrscheinlichkeit der Isolierung von hochaffinen Antikörpern. Weiterhin Aufnahme von Lipid A, eine Komponente der Bakterienzellwand, dient als ein potentes Adjuvans 9. Multilamellaren Liposomen wurden durch Zugabe von Puffer zu einem getrockneten Lipidmischung in Glasröhrchen und resuspendiert in Puffer hergestellt. Extrusion der Liposomen durch 200 nm Porengröße Filter erzeugt monodisperse unilamellare liposomale Suspensionen. Die Liposome werden dann mit einem Detergens durch Zugabe von gereinigtem SERT in Detergens gefolgt gesättigt. Detergensmischung: Schließlich Waschmittel wird durch Zugabe von hydrophoben Absorptionsharzes zu dem Lipid entfernt. Zusätzliche Liganden sollte die rekonstituierte Probe hinzugefügt werden, um Antikörper zu selektieren, die das Antidepressivum gebundenen Konformation erkennen. Die Anwesenheit von SERT in den Proteo sollte bestätigt werdenSolubilisieren einer kleinen Probe mit SDS-PAGE - Beladungsfarbstoff oder C12M und läuft auf SDS-PAGE und FSEC (3C, D). Hybridomzelllinien SERT Antikörper exprimieren, können für hochaffine Bindemittel abgeschirmt werden, die 3D-Epitope erkennen. Diese Eigenschaften sind entscheidend für den späteren Erfolg der Kristallisation, wie der Antikörper muss fest mit einem strukturierten Bereich gebunden bleiben Kristallpackung von homogenen, gut geordneten Domänen zu fördern. Im ersten Schritt, Antikörper, die unstrukturierte Bereiche erkennen, werden identifiziert. SERT denaturiert aufgetrennt und auf eine Nitrocellulosemembran; Antikörper, die denaturierte SERT binden Western-positiv sein und wahrscheinlich lineare Epitope erkennen. In 4A zeigen wir zwei Beispiele von Antikörpern , die Western-positiv sind und nützlich wahrscheinlich nicht Kristallogenese zu fördern. In 4B werden die verbleibenden western negativen Antikörper werden mit 100 nM SERT-GFP inkubiert und getrennt durchFSEC. Antikörper, die SERT binden die GFP-positiven Spitze zu einer früheren Position verschieben. Die SERT-Antikörper-Komplexe können weiter in Detergens verdünnt werden, um zu bestimmen, ob sie mit nanomolarer Affinität gefolgt von Analyse durch FSEC binden kann. Zugabe von Serotonin führt zu Konformationsänderungen in dem Transporter und somit können die Antikörper gescreent werden, um zu bestimmen, ob sie spezifisch die SSRI-gebundene Konformation erkennen kann. In 4C werden die Antikörper gezeigt SERT in Gegenwart von Serotonin zu binden, was zeigt , dass das Epitop (e) nicht von der SSRI ändern gebundenen Zustand auf das Substrat. Schließlich sind in Figur 4D Kombinationen von Antikörpern auf ihre Fähigkeit getestet verschiedene Epitope zu binden, in einer weiteren Linksverschiebung führt. Hier ist der 15B8 8A11 oder Antikörper erkennen ein Epitop, das von 8B6 unterscheidet. Die 8B6-Antikörper wurde auf Basis vorläufiger Kristall-Screening mit Papain trea für weitere Strukturanalyse ausgewähltted Fab. Die Gene der 8B6 Fab wurden in einen Insektenzellen-Expressionsvektor kloniert. Fab kann von Sf9-Zellen exprimiert und sezerniert werden, wachsen in Suspension. Die 8B6 Fab kann durch His-Tag - Affinität (5A, B) und Kationenaustausch - Chromatographie (5C, D) , die sich in Protein , das aus Sf9 - Zellüberstand gereinigt werden , die auf SDS-PAGE - Gelen frei von Verunreinigungen erscheint. In 5E wird das rekombinante 8B6 Fab gezeigt SERT zu binden und wird in anschließenden biochemischen und biophysikalischen Experimenten verwendet. Die affinitätsgereinigten SERT CC ist mit Thrombin und EndoH und mit 8B6 Fab verdaut , wobei ein Komplex in Gegenwart von S -Citalopram zu bilden. Der Transporter-Antikörper - Komplex wird dann durch SEC in C8M (6A) getrennt und die Peakfraktionen sowohl SERT und Fab enthalten , wie durch SDS-PAGE (Figur 6B) gezeigt. Die Verwendung von C8M ist von entscheidender Bedeutung für die Kristallbildung wahrscheinlich, weildie kurzkettigen Waschmittel ermöglicht zwischen den Molekülen in dem Kristallgitter bessere Verpackung. FSEC eingesetzt wird , die Fraktionen zu bestimmen , sollte zur Kristallisation (6C) vereinigt werden; Fraktionen, die kombiniert werden sollten nicht monodisperse und / oder enthalten große Mengen an freien SERT oder Fab nicht. Prismenförmigen SERT-Antikörper - Kristalle können durch hängenden Tropfen Dampfdiffusion (7A) in Gegenwart von S -Citalopram Verwendung dieses Protokoll gezüchtet werden. Die resultierenden Kristalle beugen Röntgenstrahlen bis zu einer Auflösung von 3,15 Å 10 (7B). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig1.jpg" /> Abbildung 1: Scintillation Proximity-basierten Thermostabilität Assay A.. Überblick über Protokoll zum Screenen Thermostabilität in Gegenwart von [3 H] Citalopram. B. Maximale gebunden [3 </sup&gt; H] Citalopram gegen die scheinbare Schmelztemperatur (Tm). Die gepunkteten Linien stellen Werte dar, für den WT-Transporter. Die drei am meisten thermo Mutanten sind markiert. Grauzone darstellt Mutanten, die weniger als 10% von [3 H] Citalopram an WT und damit ungenau Tm - Werte aufgrund eines niedrigen Signal-zu-Rauschen. C Bindung relativ. Thermische Stabilität Kurven für WT SERT TC und den Top - 3 - Mutanten. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung (SD). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig2.jpg" /> Abbildung 2: Übersicht der Mammalian Heterologe Proteinexpression A.. Schematisierte Übersicht über BacMam Virus Generation und die Expression von SERT in HEK293s GnTI- -. Zellen B. ERK293S GnTI- - Zellen, die SERT CC (GFP - Fluoreszenz) C.. Elutionsprofil von SERT CC auf Strep Affinitätsharz. Grüne Spur stellt die Konzentration von Desthiobiotin, 0 - 100% (0 - 5 aus mM) D.. Analyse der affinitätsgereinigten SERT CC auf einem 4-15% SDS-PAGE Gel - E.. FSEC der Affinität CC gereinigte SERT durch GFP - Fluoreszenz detektiert (Anregung: 480 nm; Emission: 510 nm). Der Peak bei 15 ml eluierenden ist SERT (#) und 18 ml ist frei GFP (*). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig3.jpg" /> Abbildung 3: Repräsentative Affinitätsreinigung und Rekonstitution des SERT IC A.. Schematische Darstellung der Antikörper-Generierung. &lt;strong&gt; B. Elutionsprofil bei 280 nm der Affinitätsreinigung von Strep SERT IC auf Affinitätsharz beobachtet. Grüne Spur stellt die Konzentration von Desthiobiotin, 0 - 100%. (0 - 5 aus mM) C. Analyse der affinitätsgereinigten und rekonstituiert SERT auf einem 4-15% SDS-PAGE Gel - D.. FSEC von gelöstem SERT nach der Rekonstitution. Die Fluoreszenz von Tryptophanresten verwendet wurde SERT zu erkennen (Anregung: 280 nm; Emission: 335 nm). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig4.jpg" /> Abbildung 4:. Die Analyse von repräsentativen SERT Antikörper A. Screening von Antikörpern durch Western-Blot. Ungefähr 1 ug SERT CC mit oder ohne GFP wurde aufgebracht auf einen 4-15% SDS-PAGE-Gel und auf eine Nitrocellulosemembran geblottet. Die Bindung wurde unter Verwendung eines Ziege-Antikörper Anti-Maus, konjugiert an IR-Farbstoff. 2G4 und 10F2 sind westliche positiv. B. Bindung von Antikörpern an 100 nM GFP-markiertes SERT und Detektion von FSEC detektiert GFP - Fluoreszenz verwendet wird . C. Bindung von ausgewählten Fabs zu 100 nM GFP-markiertes SERT in Gegenwart von 1 mM Serotonin. D. Die Bindung von 8A11 oder 15B8 Fabs zu SERT-8B6 Fab. Kleinere Peaks bei 18 ml eluierenden sind frei GFP. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig4large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig5.jpg" /> Abbildung 5: Repräsentative Reinigung des 8B6 - Fab aus Sf9 Zellen A.. Elutionsprofil bei 280 nm von der Reinigung des 8B6-Fab von His-Tag Affinität chromatograp beobachtet<html> hy. Grüne Spur stellt die Konzentration von Imidazol, 0 - 50% (0-250 mM) B.. Nicht-reduzierenden und SDS-PAGE-Gel nach His-Tag-Affinitätsreinigung reduziert wird. Protein , das in der Nähe von 50 kDa läuft , ist nicht reduzierten Fab (#) und kleinere Spezies bei 25 kDa reduziert wird Fab (*). C. Elutionsprofil bei 280 nm von der Reinigung der 8B6 Fab durch Kationenaustausch beobachtet einen einzigen symmetrischen Peak anzeigt, die unter einem linearen Natriumchlorid-Gradienten eluiert. Grüne Spur stellt die Konzentration von NaCl, 0 - 100%. (0 - 500 mM) D. Analyse der 8B6 Fab auf einem 12,5% SDS-PAGE - Gel nach der Reinigung durch Kationenaustausch. E. Die Bindung des 8B6 Fab 10 nM GFP-markierten SERT, mittels Fluoreszenz von GFP nachgewiesen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig5large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> e 6 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54792 / 54792fig6.jpg &quot;/&gt; Abbildung 6: Repräsentative Gelfiltrationschromatographie des SERT-8B6 - Komplex in Gegenwart von S -Citalopram A.. Gelfiltrationseluierungsmuster Profil von gereinigtem SERT-8B6-Komplex. Hauptpeak bei 11,5 ml eluierenden ist die SERT-8B6-Komplex. Peak bei 15 - 17 ml enthält GFP und Fab B.. Analyse des gereinigten SERT-8B6-Komplex auf einem 4-15% SDS-PAGE-Gel. Die Positionen von SERT und der schweren und leichten Ketten des Fab sind durch einen Bindestrich. C gezeigt. FSEC der Größe getrennten Fraktionen. SERT-8B6-Komplexe wurden unter Verwendung von Tryptophan-Fluoreszenz detektiert. Fraktion 17 enthält eine größere Menge an SERT die mit Fab nicht komplex war. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig6large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="7"src = &quot;/ files / ftp_upload / 54792 / 54792fig7.jpg&quot; /&gt; Abbildung 7: Die Kristallisation des SERT-8B6 Komplex gebunden zu S -Citalopram A.. Lichtmikroskopie von quaderförmigen Kristalle des SERT-8B6-Komplex nach 2 Wochen Wachstum. Maßstabsbalken entspricht 200 um. B. SERT-8B6 Kristalle beugen Röntgenstrahlen bis 3,15 Å. Blauer Ring darstellt 3,15 Å. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig7large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Tabelle 1:. Ein Kristallisations Bildschirm für die SERT-8B6 Complex S -Citalopram Bound <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792table1.xlsx">Bitte hier klicken</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792table1.xlsx">diese Tabelle zu laden.</a>

Dieses Manuskript beschreibt , wie für thermostabilisierende Mutationen zu screenen, die menschliche Serotonintransporter reinigen, Antikörper mit hoher Affinität zu erzeugen, und der Serotonin - Transporter-Antikörper - Komplex mit dem Antidepressivum S -Citalopram gebunden kristallisieren. Dieses Protokoll kann auf die Untersuchung von anderen schwierigen Membrantransportern, Rezeptoren und Kanälen angepasst werden.

Thermostabilization, Expression, Reinigung und Kristallisation des menschlichen Serotonin-Transporter-Bound<em&gt; S</em&gt; -Citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einen Transporter zu erzeugen, der ausreichend stabil für strukturelle Untersuchungen ist, und diesen modifizierten Transporter zur Herstellung von Kristallen zu nutzen, die mittels Röntgenkristallographie hochauflösend diffraktieren. Diese Methode kann zentrale Fragen auf dem Gebiet der Strukturbiologie beantworten, beispielsweise wie die Struktur von Membranproteinen, die wichtige Arzneimittel-Zielstrukturen darstellen, aufgeklärt werden kann. Der entscheidende Vorteil dieser Technik liegt darin, dass sie die Auswahl einer arzneimittelgebundenen Konformation anhand eines funktionellen Assays ermöglicht.Obwohl diese Methode Einblicke in Neurotransmittertransporter ermöglichen kann, ist sie ebenfalls auf Rezeptoren, Kanäle und lösliche Proteine anwendbar, die kleine Moleküle mit hoher Affinität binden. Resuspendieren Sie trypsinierte HEK293S GnTI minus-Zellen gründlich in DMEM, das mit 10% fetalem Kälberserum ergänzt ist, auf eine Dichte von 0,5 Millionen Zellen pro Milliliter in einem Einweg-Pipettierbehälter. Geben Sie mithilfe einer Mehrkanalpipette je 100 Mikroliter Zellsuspension in jede Vertiefung einer mit Poly-D-Lysin beschichteten Platte.Suspendieren Sie die Zellen im Pipettierreservoir nach dem Befüllen jeder Platte erneut, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen sicherzustellen. Inkubieren Sie die Zellen im 37-Grad-Celsius-Inkubator mit 8 % Kohlendioxid. Ersetzen Sie das Zellkulturmedium eine Stunde vor der Transvektion.Bereiten Sie die DNA-Transvektionsreagenz-Komplexe vor, indem Sie für jeden zu testenden Konstrukt im cert-TC-Hintergrund 450 Nanogramm DNA mit 45 Mikrolitern serumfreiem DMEM mischen. Geben Sie anschließend 1,6 Mikroliter des Transvektionsreagenzes zu 45 Mikrolitern serumfreiem DMEM hinzu und mischen Sie gründlich. Geben Sie sofort die verdünnte Transvektionsreagenzlösung zur DNA-Lösung hinzu und mischen Sie erneut.Mischen Sie die Lösungen nicht in umgekehrter Reihenfolge. Warten Sie 10 bis 15 Minuten, bevor Sie 20 Mikroliter der Transvektionsreagenz-DNA-Mischung zu vier der Vertiefungen hinzufügen. Inkubieren Sie die Zellen mit 200 Nanomolar Citalopram und 25 Mikrolitern TBS fünf Minuten bei Raumtemperatur.Um die Zellen aufzulösen, 25 Mikroliter einer Lösung mit 8 Millimolar C12M, 1 Millimolar CHS und Proteaseinhibitorcocktail in TBS hinzufügen. Die Zellen eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Anschließend 50 Mikroliter TBS mit 20 Nanomolar tritiiertem Citalopram, 0,1 % Rinderserumalbumin und Milligramm pro Milliliter His-Tag-Affinitäts-Scintillations-Näherungs-Assay oder SPA-Beads zu drei Vertiefungen für jeden Konstrukt hinzufügen.F&uuml;r das letzte Gef&auml;&szlig; dieselbe TBS-L&ouml;sung hinzuf&uuml;gen, jedoch mit 100 Mikromolar Sertralin erg&auml;nzen, um die unspezifische Bindung zu bestimmen. Sicherstellen, dass die His-Tag-Affinit&auml;ts-SPA-K&uuml;gelchen gr&uuml;ndlich gemischt werden, bevor sie der 96-Loch-Platte zugegeben werden. Die mit Tritium markierte Citalopram-Bindung mithilfe eines 96-Loch-Fl&uuml;ssigkeitsz&auml;hlger&auml;ts bei Raumtemperatur mit einer Z&auml;hlzeit von einer Minute pro Loch messen.Zählen Sie die Platten weiter, bis die Gesamtanzahl der Zählungen nach etwa 36 Stunden ein Plateau erreicht. Nach der Messung erhitzen Sie die Platten 15 Minuten lang in einem Heizblock mit beheiztem Deckel auf 33 Grad Celsius. Messen Sie die Bindung von tritiiertem Citalopram nach dem Erhitzen erneut.Wiederholen Sie diese Schritte mit einer Modifizierung des Erhitzungsschritts. Passen Sie die Erhitzungstemperaturen abhängig von der scheinbaren Schmelztemperatur des Zielproteins und der Thermostabilität des stabilsten Konstrukts an. Erhitzen Sie die Platten weiter, bis alle Konstrukte niedrige spezifische Zählraten aufweisen.Züchten Sie HEK293S GnTI-minus-Zellen in Suspension bei 37 Grad Celsius mit 8 % Kohlendioxid und 85 % Luftfeuchtigkeit auf einem Schüttler bei 130 U/min in 293-Expressionsmedium, das mit 2 % fetalem Kälberserum ergänzt wurde. Infizieren Sie 10 Liter der Zellen mit dem P2-Virus bei einer Multiplizität der Infektion von zwei und einer Dichte von drei Millionen Zellen pro Milliliter. 12 bis 16 Stunden nach der Infektion fügen Sie Natriumbutyrat in einer Konzentration von 10 Millimolar aus einer einmolarigen Stammlösung hinzu.48 bis 60 Stunden nach der Infektion die Zellen durch Zentrifugation bei 4.000 × g für 15 Minuten gewinnen. Das Überstandmedium entfernen. Die Zellen in 150 Milliliter TBS mit 2 Mikromolar Escitalopram oder anderen SERT-Hemmstoffen resuspendieren.die Zellen aus 10 Litern Kultur in warmem Wasser von etwa 30 Grad Celsius und resuspendieren Sie sie, indem Sie die Zellen mehrmals schnell durch eine 10-Milliliter-Pipette pipettieren, bis eine homogene Suspension vorliegt. Geben Sie alle Zellen in ein Becherglas mit einem Rührstab und fügen Sie unter Rühren die gesamte Detergenslösung zu den Zellen hinzu. Lysieren Sie die Zellen bei vier Grad Celsius eine Stunde lang unter Rühren.Zentrifugieren Sie das Lysat 15 Minuten lang bei 8.000 × g und 4 °C. Gießen Sie das Überstandsvolumen in saubere Ultrazentrifugenröhrchen und entsorgen Sie den Pellet. Zentrifugieren Sie anschließend den Überstand eine Stunde lang bei 100.000 × g in einer Ultrazentrifuge.Nach der Ultrazentrifugation filtrieren Sie das Überstand durch einen 0,2-Mikron-Filter und verwerfen das Pellet. Danach leiten Sie das Lysat mithilfe einer peristaltischen Pumpe über 10 Milliliter Streptavidin-Affinitätsharz, das in einer Säule gepackt ist und mit Waschpuffer äquilibriert wurde. Anschließend verbinden Sie eine Streptavidin-Affinitätssäule mit einem System der schnellen Flüssigchromatographie von Proteinen und waschen die Säule mit zwei Millilitern pro Minute mit insgesamt 66 Millilitern Waschpuffer.Eluieren Sie das gereinigte Protein im gleichen Waschpuffer, der mit fünf Millimolar Desthiobiotin ergänzt wurde, mit einer Geschwindigkeit von 0,5 Milliliter pro Minute unter Verwendung von 33 Milliliter Puffer. Sammeln Sie Fraktionen zu je einem Milliliter. Die Spitzenfraktionen werden etwa 10 Milliliter betragen.Um die Transporter-Antikörper-Komplexe herzustellen, verdauen Sie das gereinigte Protein zunächst über Nacht bei Raumtemperatur mit Thrombin, um Tags zu entfernen, und mit Endo H zur Entglykosylierung. Konzentrieren Sie das Protein auf eine Konzentration von 10 Milligramm pro Milliliter und ein Volumen von 250 bis 300 Mikroliter mithilfe eines Zentrifugal-Konzentrators mit einer Molekulargewichts-Grenze von 100 Kilodalton. Mischen Sie das konzentrierte SERT-Protein mit 8B6-Fab im molaren Verhältnis von 1 zu 1,2 in einem Volumen von weniger als 500 Mikrolitern.Zentrifugieren Sie die Mischung bei 100.000 × g und vier Grad Celsius für 20 Minuten. Sammeln Sie nach der Zentrifugation das Überstand enthaltende SERT-Fab-Komplex und verwerfen Sie das Pellet. Trennen Sie den Komplex mittels schneller Proteinflüssigkeitschromatographie an einer Größenausschluss-Säule. Äquilibrieren Sie es mit supplementiertem TBS bei 0,5 Milliliter pro Minute. Vor der Kristallisation konzentrieren Sie die Peak-Fraktionen aus der Trennung des Komplexes auf zwei Milligramm pro Milliliter unter Verwendung eines zentrifugalen Protein-Konzentrators mit einer molekularen Gewichtsabscheidung von 100 Kilodalton. Eine Extinktion von zwei AU bei 280 Nanometern entspricht einem Milligramm pro Milliliter.Fügen Sie zusätzlichen Fab im Verhältnis von 1 zu 0,05 Komplex zu freiem Fab hinzu. Geben Sie außerdem 10 Mikromolar freies S-Citalopram zu. Nach der Zentrifugation der Probe sammeln Sie den Überstand, der den SERT-Fab-Komplex enthält, und verwerfen das Pellet.Richten Sie eine Hanging-Drop-24-Well-Platte bei vier Grad Celsius gemäß Tabelle 1 im Textprotokoll ein. Pipettieren Sie 500 Mikroliter jeder Reservoirlösung in eine niedrige 24-Well-Platte, wobei auf jedes Loch ein Dichtmittel aufgetragen wird. Pipettieren Sie 1,5, 1,75 und zwei Mikroliter des SERT-Fab-Komplexes auf eine 18 Millimeter große silanisierte Glasdeckenscheibe.Anschließend pipettieren Sie ein Mikroliter der Reservoirlösung auf die Proteinprobe. Einzelkristalle erscheinen innerhalb von etwa drei Tagen und wachsen nach 14 Tagen auf eine Größe von 100 bis 175 Mikrometern an. Dargestellt sind hier repräsentative Ergebnisse für die Untersuchung der thermostabilisierenden Wirkung in Gegenwart von tritiiertem Citalopram.Die gegen die maximale Bindung aufgetragenen Schmelztemperaturwerte zeigen Mutanten mit hoher thermostabiler Expression. Dargestellt sind hier die Thermostabilitätskurven für das Wildtyp-SERT TC und die drei besten Mutanten, Y110A, I291A und T439S. Dieses Mikroskopiebild zeigt HEK293S GnTI-minus-Zellen, die SERT CC exprimieren, mit grüner Fluoreszenz an der Zellmembran.Die fluoreszenzbasierte Größenausschlusschromatographie von SERT CC zeigt ein Hauptpeak bei 15 Milliliter. Die Analyse mittels SDS-PAGE zeigt eine einzige Proteinart, die weitgehend frei von Verunreinigungen ist. Dargestellt ist eine repräsentative Trennung von Transporter-Antikörper-Komplexen mittels Größenausschlusschromatographie.Der Hauptpeak, der bei 11,5 Milliliter eluiert wurde, enthielt sowohl SERT als auch Fab, wie auf einem SDS-PAGE-Gel gezeigt. Die Lichtmikroskopie des an S-Citalopram gebundenen SERT-Antikörper-Komplexes nach zweiwöchigem Wachstum zeigt prismenförmige Kristalle mit einer Größe von etwa 100 bis 175 Mikrometern. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Mutationen identifiziert, die ein Membranprotein in einer ligandengebundenen Konformation stabilisieren, und wie man Kristallisationsscreenings mit Protein-Antikörper-Komplexen einrichtet.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass Liganden für die Stabilisierung des SERT-TC notwendig sind und für die Kristallisation des SERT-CC unerlässlich sind. Die Bedeutung dieser Technik erstreckt sich auf die Therapie psychiatrischer Erkrankungen, da SERT das molekulare Ziel vieler Antidepressiva ist. Nach diesem Verfahren kann die Funktion des gereinigten SERT mittels biochemischer und biophysikalischer Methoden charakterisiert werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Die Protokolle beschreiben die wesentlichen Schritte für den Erhalt Beugung Qualität Kristalle von Membranproteinen ab Rekonstitution des Proteins in einer Lipid-kubische Phase (LCP), finden Anfangsbedingungen mit LCP-FRAP Vorkristallisation Assays, die Einrichtung von LCP Kristallisation Studien und Ernte-Kristallen .

Die Kristallisation von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen

Die heterologe Expression und Reinigung des Mukoviszidose Transmembran Regulator (CFTR) sind bedeutende Herausforderungen und limitierende Faktoren bei der Entwicklung von Arzneimitteltherapien für Mukoviszidose. Dieses Protokoll beschreibt zwei Verfahren zur Isolierung von Milligramm-Mengen von CFTR für funktionelle und strukturelle Untersuchungen.

Die Reinigung des Cystic Fibrosis Transmembran Regulator-Protein in Ausgedrückt<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Dies ist ein schnelles, kosteneffizientes Protokoll für die Herstellung von sekretierten, glykosylierten Säugetierproteinen und die anschließende einstufige Aufreinigung mit ausreichenden Ausbeuten an homogenem Protein für die Röntgenkristallographie und andere biophysikalische Studien.

Effiziente Mammalian Cell Expression und Single-step Reinigung der extrazellulären Glykoproteinen für die Kristallisation

Ein einfaches Protokoll zur Überexpression und Reinigung von codonoptimierter, menschlicher cis- Prenyltransferase unter nicht-denaturierenden Bedingungen aus Escherichia   Coli , wird zusammen mit einem enzymatischen Aktivitäts-Assay beschrieben. Dieses Protokoll kann für die Produktion von anderen cis- Prenyltransferase- Proteinen in Quantität und Qualität geeignet für mechanistische Studien verallgemeinert werden.

Überexpression und Reinigung des Menschen Cis -prenyltransferase in Escherichia coli

Dieser Artikel beschreibt bestimmte Methoden um biochemische Menge Waschmittel solubilisiert TRPV1 für spektroskopische Analyse zu erhalten. Die kombinierte Protokolle bieten Biochemische und biophysikalische Werkzeuge, die angepasst werden können, um die strukturelle und funktionelle Studien für Säugetier-Ionenkanäle in einer Membran-kontrollierten Umgebung zu erleichtern.

Reinigung und Wiederherstellung der TRPV1 für spektroskopische Analyse

Dieses Protokoll beschreibt Techniken zur Bestimmung der Ionen-Kanalstrukturen von Kryo-Elektronenmikroskopie, darunter ein Baculovirus-System verwendet, um effizient Gene in Säugerzellen mit minimalem Aufwand und Toxizität, Proteingewinnung, Reinigung, und Qualitätsprüfung, Raster Probenvorbereitung und Screening, sowie Datenerfassung und Verarbeitung.

Ausdruck und Reinigung des menschlichen Lipid-Sensitive kation Kanal TRPC3 für die Strukturaufklärung von Single-Teilchen Kryo-Elektronenmikroskopie

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um auszudrücken, solubilisieren und mehrere eukaryotischen Borat-Transporter mit Homologie zur SLC4 Transporter Familie mit Hefe zu reinigen. Wir beschreiben auch einen chemische Vernetzung Assay zur Beurteilung der gereinigten Homomeric Proteine für Multimeric Montage. Diese Protokolle können für andere anspruchsvolle Membranproteine angepasst werden.

Ausdruck, Solubilisierung und Reinigung der eukaryotischen Borat-Transporter

Dieser Artikel stellt eine Reihe von aufeinanderfolgenden Methoden zur Expression und Reinigung von Salmonella typhimurium tryptophan synthase vor, die dieses Protokoll zu einem schnellen System zur Reinigung des Proteinkomplexes an einem Tag machen. Abgedeckte Methoden sind ortsgerichtete Mutagenese, Proteinexpression in Escherichia coli,Affinitätschromatographie, Gelfiltrationschromatographie und Kristallisation.

PCR-Mutagenese, Klonierung, Expression, schnelle Proteinreinigungsprotokolle und Kristallisation des Wildtyps und der mutierten Formen der Tryptophan-Synthase

Strukturelle und biochemische Untersuchungen menschlicher Membrantransporter erfordern Milligrammmengen an stabilem, intaktem und homogenem Protein. Hier beschreiben wir skalierbare Methoden zum Screening, zur Expression und zur Reinigung humaner Transporter gelöster Substanzen unter Verwendung von Codon-optimierten Genen.

Hochdurchsatzexpression und Aufreinigung humaner gelöster Träger für strukturelle und biochemische Untersuchungen

Hier stellen wir eine Methode zur Expression und Reinigung von S100A12 (Calgranulin C) vor. Wir beschreiben ein Protokoll zur Messung seiner antimikrobiellen Aktivität gegen den menschlichen Pathogen H. pylori .

Expression, Reinigung und antimikrobielle Aktivität von S100A12

Erfahren Sie, wie Sie den menschlichen Serotonin-Transporter thermostabilisieren, exprimieren und kristallisieren. Diese Methode ermöglicht strukturelle Studien von Membranproteinen und liefert Erkenntnisse für die Arzneimittelentwicklung.

Thermostabilization, Expression, Reinigung und Kristallisation des menschlichen Serotonin-Transporter-Bound

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