Thermostabilization, Expression, Reinigung und Kristallisation des menschlichen Serotonin-Transporter-Bound S -Citalopram

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, einen Transporter zu erzeugen, der für Strukturstudien ausreichend stabil ist, und diesen modifizierten Transporter zu verwenden, um Kristalle herzustellen, die mittels Röntgenkristallographie eine hohe Auflösung erreichen. Diese Methode kann Schlüsselfragen im Bereich der Strukturbiologie beantworten, z. B. wie die Struktur von Membranproteinen entschlüsselt werden kann, die wichtige Angriffspunkte für Medikamente sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie verwendet werden kann, um unter Verwendung eines funktionellen Assays aus einer arzneimittelgebundenen Konformation auszuwählen.

Obwohl diese Methode Einblicke in Neurotransmitter-Transporter geben kann, kann sie auch auf Rezeptoren, Kanäle und lösliche Proteine angewendet werden, die kleine Moleküle mit hoher Affinität binden. Resuspendieren Sie trypsonisierte HEK293S GnTI-Minuszellen in DMEM, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, gründlich auf eine Dichte von 0,5 Millionen Zellen pro Milliliter in einem Einweg-Pipettenreservoir. Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 100 Mikroliter Zellen in jede Vertiefung einer mit Poly-D-Lysin beschichteten Platte.

Suspendieren Sie die Zellen nach dem Befüllen jeder Platte wieder im Pipettenreservoir, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten. Inkubieren Sie die Zellen im 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 8 % Kohlendioxid. Tauschen Sie das Zellmedium eine Stunde vor der Transvektion aus.

Bereiten Sie die DNA-Transvektionsreagenzkomplexe vor, indem Sie 450 Nanogramm DNA mit 45 Mikrolitern serumfreiem DMEM für jedes Konstrukt im zu untersuchenden cert TC-Hintergrund mischen. Geben Sie dann 1,6 Mikroliter des Transvektionsreagenzes zu 45 Mikrolitern serumfreiem DMEM und mischen Sie. Geben Sie sofort die verdünnte Transvektionsreagenzlösung in die DNA-Lösung und mischen Sie.

Mischen Sie Lösungen nicht in umgekehrter Reihenfolge. Warten Sie 10 bis 15 Minuten, bevor Sie 20 Mikroliter des Transvektionsreagenz-DNA-Gemisches in vier der Vertiefungen geben. Inkubieren Sie die Zellen mit 200 nanomolaren Citalopram und 25 Mikrolitern TBS für fünf Minuten bei Raumtemperatur.

Um die Zellen zu solubolisieren, fügen Sie 25 Mikroliter acht Millimolare C12M, ein Millimolar CHS und einen Proteasehemmer-Cocktail in TBS hinzu. Inkubieren Sie die Zellen eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Geben Sie dann 50 Mikroliter TBS mit 20 nanomolar tritiiertem Citalopram, 0,1 % Rinderserumalbumin und Milligramm pro Milliliter seines Tag-Affinitäts-Szintillations-Proximity-Proximity-Assays oder SPA-Beads in drei Vertiefungen für jedes Konstrukt.

Für die letzte Vertiefung fügen Sie die gleiche TBS-Lösung hinzu, ergänzen Sie jedoch mit 100 mikromolaren Sertralin, um die unspezifische Bindung zu bestimmen. Stellen Sie sicher, dass die his tag affinity SPA Beads gründlich gemischt sind, wenn Sie sie auf die 96-Well-Platte geben. Messen Sie die tritiierte Citalopram-Bindung mit einem 96-Well-Szintillationszähler bei Raumtemperatur mit einer Zählzeit von einer Minute pro Well.

Fahren Sie mit dem Zählen der Platten fort, bis die Gesamtzählung bei etwa 36 Stunden ein Plateau erreicht. Nach der Messung erhitzen Sie die Platten 15 Minuten lang in einem Heizblock mit beheiztem Deckel bei 33 Grad Celsius. Messen Sie die tritiierte Citalopram-Bindung nach dem Erhitzen erneut.

Wiederholen Sie diese Schritte mit einer Änderung des Heizschritts. Passen Sie die Heiztemperaturen in Abhängigkeit von der scheinbaren Schmelztemperatur des Zielproteins und der Thermostabilität des stabilsten Konstrukts an. Fahren Sie mit dem Erhitzen von Platten fort, bis alle Konstrukte eine niedrige spezifische Anzahl aufweisen.

Züchten Sie HEK293S GnTI-Minus-Zellen in Suspension bei 37 Grad Celsius mit 8 % Kohlendioxid und 85 % Luftfeuchtigkeit auf einem Schüttler bei 130 U/min und 293 Expressionsmedien, ergänzt mit 2 % fötalem Rinderserum. Infizieren Sie 10 Liter der Zellen mit dem P2-Virus bei einer Infektionsmehrheit von zwei und einer Dichte von drei Millionen Zellen pro Milliliter. 12 bis 16 Stunden nach der Infektion Natriumbutyrat in einer Konzentration von 10 Millimolar aus einem Molstock zugeben.

48 bis 60 Stunden nach der Infektion, ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 4.000 mal G für 15 Minuten. Entfernen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie Zellen in 150 Millilitern TBS mit 2 mikromolaren Escitalopram oder anderen SERT-Inhibitoren.

Die Zellen werden aus 10 Litern Kultur in warmem, etwa 30 Grad Celsius warmem Wasser entnommen und resuspendiert, indem die Zellen schnell durch eine 10-Milliliter-Pipette geleitet werden, bis sie homogen sind. Geben Sie alle Zellen mit einem Rührstab in ein Becherglas und geben Sie die gesamte Waschmittellösung unter Rühren in die Zellen. Solubilisieren Sie die Zellen bei vier Grad Celsius für eine Stunde unter Rühren.

Schleudern Sie das Lysat 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 8.000 Mal G. Defüllen Sie den Überstand in saubere Ultra-Zentrifugenröhrchen und entsorgen Sie das Pellet. Dann wird der Überstand eine Stunde lang in einer Ultrazentrifuge mit dem 100.000-fachen G gedreht

Nach der Ultrazentrifugation filtrieren Sie den Überstand durch einen 0,2-Mikron-Filter und entsorgen Sie das Pellet. Als nächstes wird das Lysat über 10 Milliliter Streptokokken-Affinitätsharzpackung in eine Säule geleitet, wobei eine perisaltische Pumpe verwendet wird, die in Waschpuffer äquilibriert ist. Schließen Sie dann eine Streptokokken-Affinitätssäule an ein schnelles Proteinflüssigkeitschromatographie-System an und waschen Sie die Säule mit zwei Millilitern pro Minute mit 66 Millilitern Waschpuffer.

Eluieren Sie das gereinigte Protein in demselben Waschpuffer, der mit fünf Millimolaren Desthiobiotin bei 0,5 Millilitern pro Minute unter Verwendung von 33 Millilitern Puffer ergänzt wird. Sammeln Sie Ein-Milliliter-Fraktionen. Die Spitzenfraktionen betragen etwa 10 Milliliter.

Um die Transporter-Antikörperkomplexe zu bilden, verdauen Sie das gereinigte Protein zunächst über Nacht bei Raumtemperatur mit Thrombin, um die Markierungen zu entfernen, und Endo H zur Deglykosylierung. Konzentrieren Sie das Protein auf eine Konzentration von 10 Milligramm pro Milliliter und ein Volumen von 250 bis 300 Mikrolitern unter Verwendung eines 100-Kilodalton-Zentrifugenproteinkonzentrators mit Molekulargewicht. Mischen Sie das konzentrierte SERT-Protein mit 8B6 Fab in einem Molverhältnis von eins bis 1,2 in einem Volumen von weniger als 500 Mikrolitern.

Zentrifugieren Sie die Mischung bei 100.000 g und vier Grad Celsius für 20 Minuten. Nach der Zentrifugation den Überstand mit dem SERT-Fab-Komplex auffangen und das Pellet entsorgen. Trennen Sie den Komplex mit Hilfe der schnellen Proteinflüssigkeitschromatographie auf einer Größenausschlusssäule.

Äquilibrieren Sie es mit supplementierter TBS bei 0,5 Millilitern pro Minute. Vor der Kristallisation werden die Peakfraktionen aus der Trennung des Komplexes unter Verwendung eines 100-Kilodalton-Zentrifugenproteinkonzentrators mit Molekulargewicht auf zwei Milligramm pro Milliliter konzentriert. Eine Absorption von zwei AE bei 280 Nanometern entspricht einem Milligramm pro Milliliter.

Fügen Sie zusätzliches Fab in einem Verhältnis von eins zu 0,05 Komplex zu freiem Fab hinzu. Fügen Sie auch 10 mikromolare freie S Citalopram hinzu. Nach dem Zentrifugieren der Probe wird der Überstand mit dem SERT Fab-Komplex entnommen und das Pellet verworfen.

Richten Sie ein hängendes 24-Well-Sieb bei vier Grad Celsius gemäß Tabelle eins im Textprotokoll ein. Pipettieren Sie 500 Mikroliter jeder Reservoirlösung in eine flache 24-Well-Platte, auf die das Dichtmittel aufgetragen wird. Pipettieren Sie 1,5, 1,75 und zwei Mikroliter des SERT Fab-Komplexes auf einen 18 Millimeter großen Abdeckschirm aus silikonisiertem Glas.

Pipettieren Sie dann einen Mikroliter Reservoirlösung auf die Proteinprobe. Einkristalle erscheinen innerhalb von etwa drei Tagen und wachsen nach 14 Tagen auf 100 bis 175 Mikrometer an. Hier sind repräsentative Ergebnisse für das Screening der Thermostabilität in Gegenwart von tritiiertem Citalopram dargestellt.

Die Schmelztemperaturwerte, aufgetragen gegen die maximale Bindung, zeigen Mutanten mit hoher Thermostabilität und Expression. Hier sind die Thermostabilitätskurven für Wildtyp-SERT TC und die drei Top-Mutanten Y110A, I291A und T439S dargestellt. Dieses Mikroskopiebild zeigt HEK293S GnTI minus Zellen, die SERT CC exprimieren, mit grüner Fluoreszenz auf der Zellmembran.

Die Fluoreszenzdetektionsgrößenausschlusschromatographie von SERT CC zeigt einen großen Peak bei 15 Millilitern. Die Analyse mittels SDS-PAGE zeigt eine einzige Proteinspezies, die weitgehend frei von Kontaminanten ist. Gezeigt wird die repräsentative Trennung von Transporter-Antikörper-Komplexen mittels Größenausschlusschromatographie.

Der größte Peak, der bei 11,5 Millilitern ausblieb, enthielt sowohl SERT als auch Fab, wie auf einem SDS-PAGE-Gel gezeigt. Die Lichtmikroskopie des SERT-Antikörperkomplexes, der nach zweiwöchigem Wachstum an S-Citalopram gebunden ist, zeigt prismenförmige Kristalle von etwa 100 bis 175 Mikrometern. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Mutationen identifiziert, die ein Membranprotein in einer ligandengebundenen Bestätigung stabilisieren, und wie man Kristallisationsscreens mit Protein-Antikörper-Komplexen einrichtet.

Wenn Sie versuchen, dieses Verfahren durchzuführen, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass Liganden für die Stabilisierung von SERT TC notwendig und für die Kristallisation von SERT CC unerlässlich sind. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie psychiatrischer Erkrankungen, da SERT das molekulare Ziel vieler Antidepressiva ist. Im Anschluss an dieses Verfahren kann die Funktion von gereinigtem SERT mit biochemischen und biophysikalischen Methoden charakterisiert werden.