Thermostabilization, Expression, Reinigung und Kristallisation des menschlichen Serotonin-Transporter-Bound

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einen Transporter zu erzeugen, der ausreichend stabil für strukturelle Untersuchungen ist, und diesen modifizierten Transporter zur Herstellung von Kristallen zu nutzen, die mittels Röntgenkristallographie hochauflösend diffraktieren. Diese Methode kann zentrale Fragen auf dem Gebiet der Strukturbiologie beantworten, beispielsweise wie die Struktur von Membranproteinen, die wichtige Arzneimittel-Zielstrukturen darstellen, aufgeklärt werden kann. Der entscheidende Vorteil dieser Technik liegt darin, dass sie die Auswahl einer arzneimittelgebundenen Konformation anhand eines funktionellen Assays ermöglicht.

Obwohl diese Methode Einblicke in Neurotransmittertransporter ermöglichen kann, ist sie ebenfalls auf Rezeptoren, Kanäle und lösliche Proteine anwendbar, die kleine Moleküle mit hoher Affinität binden. Resuspendieren Sie trypsinierte HEK293S GnTI minus-Zellen gründlich in DMEM, das mit 10% fetalem Kälberserum ergänzt ist, auf eine Dichte von 0,5 Millionen Zellen pro Milliliter in einem Einweg-Pipettierbehälter. Geben Sie mithilfe einer Mehrkanalpipette je 100 Mikroliter Zellsuspension in jede Vertiefung einer mit Poly-D-Lysin beschichteten Platte.

Suspendieren Sie die Zellen im Pipettierreservoir nach dem Befüllen jeder Platte erneut, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen sicherzustellen. Inkubieren Sie die Zellen im 37-Grad-Celsius-Inkubator mit 8 % Kohlendioxid. Ersetzen Sie das Zellkulturmedium eine Stunde vor der Transvektion.

Bereiten Sie die DNA-Transvektionsreagenz-Komplexe vor, indem Sie für jeden zu testenden Konstrukt im cert-TC-Hintergrund 450 Nanogramm DNA mit 45 Mikrolitern serumfreiem DMEM mischen. Geben Sie anschließend 1,6 Mikroliter des Transvektionsreagenzes zu 45 Mikrolitern serumfreiem DMEM hinzu und mischen Sie gründlich. Geben Sie sofort die verdünnte Transvektionsreagenzlösung zur DNA-Lösung hinzu und mischen Sie erneut.

Mischen Sie die Lösungen nicht in umgekehrter Reihenfolge. Warten Sie 10 bis 15 Minuten, bevor Sie 20 Mikroliter der Transvektionsreagenz-DNA-Mischung zu vier der Vertiefungen hinzufügen. Inkubieren Sie die Zellen mit 200 Nanomolar Citalopram und 25 Mikrolitern TBS fünf Minuten bei Raumtemperatur.

Um die Zellen aufzulösen, 25 Mikroliter einer Lösung mit 8 Millimolar C12M, 1 Millimolar CHS und Proteaseinhibitorcocktail in TBS hinzufügen. Die Zellen eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Anschließend 50 Mikroliter TBS mit 20 Nanomolar tritiiertem Citalopram, 0,1 % Rinderserumalbumin und Milligramm pro Milliliter His-Tag-Affinitäts-Scintillations-Näherungs-Assay oder SPA-Beads zu drei Vertiefungen für jeden Konstrukt hinzufügen.

Für das letzte Gefäß dieselbe TBS-Lösung hinzufügen, jedoch mit 100 Mikromolar Sertralin ergänzen, um die unspezifische Bindung zu bestimmen. Sicherstellen, dass die His-Tag-Affinitäts-SPA-Kügelchen gründlich gemischt werden, bevor sie der 96-Loch-Platte zugegeben werden. Die mit Tritium markierte Citalopram-Bindung mithilfe eines 96-Loch-Flüssigkeitszählgeräts bei Raumtemperatur mit einer Zählzeit von einer Minute pro Loch messen.

Zählen Sie die Platten weiter, bis die Gesamtanzahl der Zählungen nach etwa 36 Stunden ein Plateau erreicht. Nach der Messung erhitzen Sie die Platten 15 Minuten lang in einem Heizblock mit beheiztem Deckel auf 33 Grad Celsius. Messen Sie die Bindung von tritiiertem Citalopram nach dem Erhitzen erneut.

Wiederholen Sie diese Schritte mit einer Modifizierung des Erhitzungsschritts. Passen Sie die Erhitzungstemperaturen abhängig von der scheinbaren Schmelztemperatur des Zielproteins und der Thermostabilität des stabilsten Konstrukts an. Erhitzen Sie die Platten weiter, bis alle Konstrukte niedrige spezifische Zählraten aufweisen.

Züchten Sie HEK293S GnTI-minus-Zellen in Suspension bei 37 Grad Celsius mit 8 % Kohlendioxid und 85 % Luftfeuchtigkeit auf einem Schüttler bei 130 U/min in 293-Expressionsmedium, das mit 2 % fetalem Kälberserum ergänzt wurde. Infizieren Sie 10 Liter der Zellen mit dem P2-Virus bei einer Multiplizität der Infektion von zwei und einer Dichte von drei Millionen Zellen pro Milliliter. 12 bis 16 Stunden nach der Infektion fügen Sie Natriumbutyrat in einer Konzentration von 10 Millimolar aus einer einmolarigen Stammlösung hinzu.

48 bis 60 Stunden nach der Infektion die Zellen durch Zentrifugation bei 4.000 × g für 15 Minuten gewinnen. Das Überstandmedium entfernen. Die Zellen in 150 Milliliter TBS mit 2 Mikromolar Escitalopram oder anderen SERT-Hemmstoffen resuspendieren.

die Zellen aus 10 Litern Kultur in warmem Wasser von etwa 30 Grad Celsius und resuspendieren Sie sie, indem Sie die Zellen mehrmals schnell durch eine 10-Milliliter-Pipette pipettieren, bis eine homogene Suspension vorliegt. Geben Sie alle Zellen in ein Becherglas mit einem Rührstab und fügen Sie unter Rühren die gesamte Detergenslösung zu den Zellen hinzu. Lysieren Sie die Zellen bei vier Grad Celsius eine Stunde lang unter Rühren.

Zentrifugieren Sie das Lysat 15 Minuten lang bei 8.000 × g und 4 °C. Gießen Sie das Überstandsvolumen in saubere Ultrazentrifugenröhrchen und entsorgen Sie den Pellet. Zentrifugieren Sie anschließend den Überstand eine Stunde lang bei 100.000 × g in einer Ultrazentrifuge.

Nach der Ultrazentrifugation filtrieren Sie das Überstand durch einen 0,2-Mikron-Filter und verwerfen das Pellet. Danach leiten Sie das Lysat mithilfe einer peristaltischen Pumpe über 10 Milliliter Streptavidin-Affinitätsharz, das in einer Säule gepackt ist und mit Waschpuffer äquilibriert wurde. Anschließend verbinden Sie eine Streptavidin-Affinitätssäule mit einem System der schnellen Flüssigchromatographie von Proteinen und waschen die Säule mit zwei Millilitern pro Minute mit insgesamt 66 Millilitern Waschpuffer.

Eluieren Sie das gereinigte Protein im gleichen Waschpuffer, der mit fünf Millimolar Desthiobiotin ergänzt wurde, mit einer Geschwindigkeit von 0,5 Milliliter pro Minute unter Verwendung von 33 Milliliter Puffer. Sammeln Sie Fraktionen zu je einem Milliliter. Die Spitzenfraktionen werden etwa 10 Milliliter betragen.

Um die Transporter-Antikörper-Komplexe herzustellen, verdauen Sie das gereinigte Protein zunächst über Nacht bei Raumtemperatur mit Thrombin, um Tags zu entfernen, und mit Endo H zur Entglykosylierung. Konzentrieren Sie das Protein auf eine Konzentration von 10 Milligramm pro Milliliter und ein Volumen von 250 bis 300 Mikroliter mithilfe eines Zentrifugal-Konzentrators mit einer Molekulargewichts-Grenze von 100 Kilodalton. Mischen Sie das konzentrierte SERT-Protein mit 8B6-Fab im molaren Verhältnis von 1 zu 1,2 in einem Volumen von weniger als 500 Mikrolitern.

Zentrifugieren Sie die Mischung bei 100.000 × g und vier Grad Celsius für 20 Minuten. Sammeln Sie nach der Zentrifugation das Überstand enthaltende SERT-Fab-Komplex und verwerfen Sie das Pellet. Trennen Sie den Komplex mittels schneller Proteinflüssigkeitschromatographie an einer Größenausschluss-Säule.

Äquilibrieren Sie es mit supplementiertem TBS bei 0,5 Milliliter pro Minute. Vor der Kristallisation konzentrieren Sie die Peak-Fraktionen aus der Trennung des Komplexes auf zwei Milligramm pro Milliliter unter Verwendung eines zentrifugalen Protein-Konzentrators mit einer molekularen Gewichtsabscheidung von 100 Kilodalton. Eine Extinktion von zwei AU bei 280 Nanometern entspricht einem Milligramm pro Milliliter.

Fügen Sie zusätzlichen Fab im Verhältnis von 1 zu 0,05 Komplex zu freiem Fab hinzu. Geben Sie außerdem 10 Mikromolar freies S-Citalopram zu. Nach der Zentrifugation der Probe sammeln Sie den Überstand, der den SERT-Fab-Komplex enthält, und verwerfen das Pellet.

Richten Sie eine Hanging-Drop-24-Well-Platte bei vier Grad Celsius gemäß Tabelle 1 im Textprotokoll ein. Pipettieren Sie 500 Mikroliter jeder Reservoirlösung in eine niedrige 24-Well-Platte, wobei auf jedes Loch ein Dichtmittel aufgetragen wird. Pipettieren Sie 1,5, 1,75 und zwei Mikroliter des SERT-Fab-Komplexes auf eine 18 Millimeter große silanisierte Glasdeckenscheibe.

Anschließend pipettieren Sie ein Mikroliter der Reservoirlösung auf die Proteinprobe. Einzelkristalle erscheinen innerhalb von etwa drei Tagen und wachsen nach 14 Tagen auf eine Größe von 100 bis 175 Mikrometern an. Dargestellt sind hier repräsentative Ergebnisse für die Untersuchung der thermostabilisierenden Wirkung in Gegenwart von tritiiertem Citalopram.

Die gegen die maximale Bindung aufgetragenen Schmelztemperaturwerte zeigen Mutanten mit hoher thermostabiler Expression. Dargestellt sind hier die Thermostabilitätskurven für das Wildtyp-SERT TC und die drei besten Mutanten, Y110A, I291A und T439S. Dieses Mikroskopiebild zeigt HEK293S GnTI-minus-Zellen, die SERT CC exprimieren, mit grüner Fluoreszenz an der Zellmembran.

Die fluoreszenzbasierte Größenausschlusschromatographie von SERT CC zeigt ein Hauptpeak bei 15 Milliliter. Die Analyse mittels SDS-PAGE zeigt eine einzige Proteinart, die weitgehend frei von Verunreinigungen ist. Dargestellt ist eine repräsentative Trennung von Transporter-Antikörper-Komplexen mittels Größenausschlusschromatographie.

Der Hauptpeak, der bei 11,5 Milliliter eluiert wurde, enthielt sowohl SERT als auch Fab, wie auf einem SDS-PAGE-Gel gezeigt. Die Lichtmikroskopie des an S-Citalopram gebundenen SERT-Antikörper-Komplexes nach zweiwöchigem Wachstum zeigt prismenförmige Kristalle mit einer Größe von etwa 100 bis 175 Mikrometern. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Mutationen identifiziert, die ein Membranprotein in einer ligandengebundenen Konformation stabilisieren, und wie man Kristallisationsscreenings mit Protein-Antikörper-Komplexen einrichtet.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass Liganden für die Stabilisierung des SERT-TC notwendig sind und für die Kristallisation des SERT-CC unerlässlich sind. Die Bedeutung dieser Technik erstreckt sich auf die Therapie psychiatrischer Erkrankungen, da SERT das molekulare Ziel vieler Antidepressiva ist. Nach diesem Verfahren kann die Funktion des gereinigten SERT mittels biochemischer und biophysikalischer Methoden charakterisiert werden.