Hochsensible und quantitativen Nachweis von Proteinen und deren Isoformen durch Kapillare isoelektrischen Fokussierung Methode

Kapillare isoelektrischen Fokussierung ist eine Antikörper-basierten, empfindsamen, hoher Durchsatz-Technik, ermöglicht detaillierte Charakterisierung von Proteinen und deren Isoformen von extrem kleinen biologischen Proben. Im folgenden beschreibt ein Protokoll für die Erkennung und Quantifizierung von spezifischen Proteinen und deren Isoformen robotisierte und automatisierte.

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im bereich der biomedizinischen Forschung zu beantworten, wie Biomarker-Entdeckung, Arzneimittelentdeckung, Diagnostik und Screening von Medikamenten oder Antikörpern. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie einen hohen Durchsatz hat und Proteinisoformen auf hochreproduzierbare Weise erkennen kann. Die Implikationen dieser Technik reichen auf die Diagnose vieler Krankheiten, da sie betroffene Proteine oder ihre Isoformen messen kann.

Obwohl diese Methode Einen Einblick in Zellsignalwege geben kann, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, in denen bestimmte Proteine analysiert werden müssen. Visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Assay-Schritte aufgrund der Tricks, wie das Entfernen von Blasen, Das Laden der Platte, et cetera, schwer zu erlernen sind. Zunächst bereiten Sie eine Probenverdünnungsmischung vor, indem Sie einen Mikroliter DMSO-Inhibitormischung und zwei Mikroliter Proteaseinhibitoren zu 47 Mikrolitern Probenverdünnungsmittel hinzufügen, so dass die Endkonzentration von DMSO- und Proteasehemmern ein X.Dilute zuvor isoliertes Proteinlysat mit der Probenverdünnungsmischung beträgt, um die gewünschten Konzentrationen zu erhalten.

Als nächstes fügen Sie 3,325 Mikroliter Standardleiter, sechs Mikroliter Protease-Inhibitor und drei Mikroliter DMSO-Hemmer zu 137.675 Mikroliter Antholite-Premix hinzu. Wirbeln Sie die Probe mindestens 15 Sekunden und halten Sie auf Eis. Mischen Sie die beiden vorbereiteten Lösungen im Verhältnis eins zu drei, so dass die Endkonzentrationen der DMSO-Protease-Inhibitoren und der isoelektrischen Punktstandardleiter ein X sind und die Proteine in der Kapillare die endgültigen gewünschten Konzentrationen erreichen.

Nachdem die Proteine der Probenmischung zugesetzt wurden, werden alle Schritte auf Eis oder bei vier Grad Celsius durchgeführt. Legen Sie eine 384-Well-Platte auf Eis. Laden Sie zehn Mikroliter der Probe in den entsprechenden Brunnen der Platte, entsprechend dem Assay-Vorlagenlayout, das mit der automatisierten Western Blotting-Systemsoftware entwickelt wurde.

Anschließend die primären und sekundären Antikörper mit Antikörperverdünnung verdünnen. Dann Pipette zehn Mikroliter primärer Antikörper und 15 Mikroliter sekundärer Antikörper in jeden Brunnen. Als nächstes, mischen Luminol und Peroxid XDR in einem Verhältnis eins zu eins.

Pipette 15 Mikroliter des Luminolperoxids in jeden Brunnen mischen. Sobald die Proben und Reagants auf die Platte gegeben wurden, Zentrifuge für zehn Minuten bei 2500 mal G und vier Grad Celsius, um die Flüssigkeit zu drehen und die Blasen zu entfernen. Wenn Blasen noch vorhanden sind, entfernen Sie sie manuell mit einer dünnen Pipettenspitze.

Öffnen Sie die automatisierte Western Blotting-Systemsoftware und klicken Sie im Dateimenü auf neu.' Wechseln Sie zum Layoutbereich, und weisen Sie Positionen für Reagants und Samples in der 384-Well-Platte zu. Machen Sie eine Reagant-Zuweisung, indem Sie auf einen Brunnen an einer beliebigen Stelle im Block klicken.

Wählen Sie einen Reihenblock mit jeweils 12 Bohrungen aus. Wechseln Sie anschließend zur Werkzeugleiste des Layoutbereichs, und fügen Sie einen Beispiel-, primären, sekundären oder luminol-Zeilenblock ein. Wechseln Sie zum Protokollbereich, und wählen Sie eine Reagant-Position in der Platte aus.

Klicken Sie dann auf die Zelle in der Beispielspalte, und wählen Sie den Reagant aus dem Dropdown-Menü aus. Wählen Sie auf die gleiche Weise die Reagant-Positionen für den primären, sekundären und Luminol für jeden Zyklus aus. Klicken Sie auf die Zellen nacheinander in der primären oder sekundären Antikörperspalte, und ändern Sie ggf. die Inkubationszeiten.

Fügen Sie dann Zyklen hinzu, indem Sie im Protokollabschnitt auf die Schaltfläche Hinzufügen klicken. Geben Sie im Vorlagenbereich Informationen zum Beispiel ein, z. B. die Identität der primären und sekundären Antikörper, deren Katalognummern und Verdünnungen. Speichern Sie die neue Assay-Datei.

Bevor Sie auf den Start-Button klicken, überprüfen Sie schnell das Layout, um sicherzustellen, dass alles korrekt ist. Klicken Sie nun auf start', um die Ausführung zu starten. Die Software fordert den Benutzer auf, den Abfall zu entfernen, das Wasser und die Kapillarbox nachzufüllen, Anolit und Katholith in das Ressourcenfach einzubauen, einen Waschpuffer hinzuzufügen und die Platte in die gekühlte Probenschale zu laden.

Eine Instrumentenstatusleiste wird einige Minuten nach dem Start der Ausführung auf dem Computerbildschirm angezeigt. Klicken Sie auf den Bildschirm der Ausführungszusammenfassung, um den Status- und Trennbereichen anzuzeigen. Um die Elektrophorese-Trennung in einer Kapillare zu beobachten, spielen Sie den Trennfilm für diese Kapillare ab, indem Sie auf den gewünschten Zyklus klicken und dann auf die Wiedergabetaste im Bedienfeld klicken.

Öffnen Sie die Ausführungsdatei, und wählen Sie die Registerkarte Analysebildschirm aus. Klicken Sie auf Bearbeiten und dann auf Analyse, um den isoelektrischen Punktbereich zu ändern. Wenden Sie den entsprechenden isoelektrischen Punktstandard an.

Fügen Sie eine Spitzenanpassung hinzu, und fügen Sie einen Spitzennamen hinzu. Wählen Sie schließlich die Daten aus, die auf der Registerkarte Peaks verwendet werden sollen, und exportieren Sie die Daten für die weitere Analyse. Das Elektropherogramm von phosphorylierten extrazellulären signalregulierten Kiinasen aus vaskulären endotheliaalen Wachstumsfaktor-stimulierten Lysaten wird hier gezeigt.

Es gibt eine sehr hohe Induktion von phosphorylierten Proteinen, die mit dem vaskulären endotheliaalen Wachstumsfaktor beobachtet werden. Der Einlauf zeigt die endogene Ladekontrolle HSP 70, die eine ähnliche Belastung von Proben sowohl für unbehandelte als auch für behandelte Proben anzeigt. In einem konventionellen Immunoblot wurden nur zwei Bänder nachgewiesen, obwohl die phosphorylierten extrazellulären signalregulierten Kinase-Proteine durch kapillare isoelektrische Fokussierungsanalyse in vier Spitzen aufgelöst wurden.

Das Elektropherogramm extrazellulärer signalregulierter Kiinasen aus vaskulären endotheliaalen Wachstumsfaktor-stimulierten Lysaten wird hier gezeigt. Der Einset zeigt die gleiche Ladesteuerung, die parallel verwendet wird. Ein herkömmlicher Immunoblot zeigt nur zwei Bänder, die der extrazellulären signalregulierten Kinase eins und extrazellulär ereine signalregulierte Kinase zwei entsprechen.

Während bei der kapillaren isoelektrischen Fokussierung die extrazellulären signalregulierten Kinase-Proteine in sechs Peaks aufgelöst wurden, was allen vier verschiedenen phosphorylierten Peaks und zwei unphosphorylierten Peaks entspricht. Einmal gemeistert, kann diese Technik in wenigen Stunden durchgeführt werden, abhängig von der Anzahl der Zyklen, wenn sie richtig ausgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens, Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, höhere Antikörperkonzentrationen im Vergleich zu herkömmlichen Immunoblots zu verwenden.

Visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Assay-Schritte aufgrund von Tricks wie Blasen entfernen, Laden der Platte usw. schwer zu erlernen sind. Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie einen Assay entwerfen, Proben vorbereiten, den Test ausführen und die Daten analysieren, um verschiedene Isoformen Ihres Proteins zu beobachten.