Der Nachweis von Copy Number Änderungen Single Cell-Sequenzierung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Veränderungen der DNA-Kopienzahl im Megabasenmaßstab in einzelnen Zellen zu identifizieren. Um die genomische Heterogenität in Zellpopulationen zu kategorisieren, ist es notwendig, genomische Veränderungen mit Einzelzellauflösung zu identifizieren. Traditionell wurde dies mit zytologischen Ansätzen erreicht, jedoch waren diese Methoden in ihrer Sensitivität und Spezifität begrenzt.

Die Einzelzellsequenzierung kann eine Vielzahl von genomischen Veränderungen nachweisen, mit verbesserter Sensitivität und Spezifität im Vergleich zu früheren Ansätzen, jedoch nur, wenn sie sorgfältig durchgeführt wird. Hier beschreiben wir, wie die Einzelzellsequenzierung verwendet werden kann, um Veränderungen der Kopienzahl im Megabasenmaßstab in einzelnen Zellen zuverlässig zu erkennen. Um den Mikro-Aspirator zusammenzubauen, entfernen Sie zunächst das durchsichtige Kunststoffende von der Absaugrohrbaugruppe und führen Sie das schmale Ende in ein Ende eines einen Fuß langen PVC-Schlauchs mit einem Innendurchmesser von 3/16 Zoll ein.

Stecken Sie den Auslass eines 0,2-Mikrometer-Spritzenvorsatzfilters in das andere Ende des einen Fuß langen PVC-Schlauchs mit einem Innendurchmesser von 3/16 Zoll. Führen Sie dann den Einlass des 0,2-Mikrometer-Spritzenvorsatzfilters in ein Ende eines sechs Zoll langen PVC-Schlauchs mit einem Innendurchmesser von 5/16 Zoll ein. Brechen Sie eine serologische Kunststoffpipette von fünf Millilitern an der Ein-Milliliter-Teilung und führen Sie das gebrochene Ende in das offene Ende des PVC-Schlauchs mit dem Innendurchmesser von 5/16 Zoll ein.

Führen Sie als Nächstes den Auslass der serologischen Fünf-Milliliter-Kunststoffpipette in das flexible Ende einer Aspiratorröhrchenbaugruppe ein und verwenden Sie dann ein steriles Kunststoffröhrchen, um das rote Mundstück der Röhrchenbaugruppe zur Aufbewahrung abzudecken. Ziehen Sie ein Glaskapillarrohr auf einen Innendurchmesser von 10-30 Mikrometern heraus, indem Sie die Mitte des Rohrs in der Nähe einer Flamme positionieren und an beiden Enden des Rohrs Spannung ausüben. Brechen Sie das gezogene Rohr in zwei Hälften, um zwei potentielle Aspiratornadeln zu erhalten.

Wiederholen Sie diesen Schritt mit mehreren Röhrchen, um sicherzustellen, dass genügend Nadeln mit einem geeigneten Innendurchmesser für die Entnahme einzelner Zellen vorbereitet sind. Zur Herstellung von Adhärenzzellen, wie z. B. menschlichen Fibroblasten-Zelllinien, werden Zellen durch Trypsinisierung entnommen und die Zellen in ein konisches Röhrchen mit dem entsprechenden Medium überführt. Richten Sie eine Haube für die Amplifikation des gesamten Genoms ein, indem Sie die Oberfläche der Haube, der Pipettenspitzen und der Pipettenspitzen mit 10 % Bleiche aufsprühen.

Wischen Sie dann alles mit einem Papiertuch ab, bevor Sie die Wäsche mit 70 % Ethanol wiederholen. Geben Sie acht Mikroliter Wasser aus dem Whole Genome Amplification (WGA)-Kit in einzelne Vertiefungen zu einer 96-Well-PCR-Platte. Decken Sie dann die 96-Well-PCR-Platte mit einem Deckel einer 96-Well-Gewebekulturplatte ab und legen Sie die Platte auf Eis.

Geben Sie als nächstes 1.000 Zellen auf 10 Milliliter Medium oder PBS in eine 15 Zentimeter große Petrischale und stellen Sie die Schale auf Eis, um zu verhindern, dass die Zellen an der Schale haften. Übertragen Sie die Zellen dann noch auf Eis in die Petrischale und die 96-Well-PCR-Platte in ein Lichtmikroskop mit einem 10-fachen Objektiv. Vergrößern Sie die Öffnung der Aspiratornadel, indem Sie mit dem ausgezogenen Nadelende vorsichtig auf eine harte Unterlage klopfen, so dass die Spitze abbricht.

Führen Sie dann das breite Ende der Nadel in das durchsichtige Ende des Mikroaspirators ein. Stellen Sie anschließend die Petrischale mit den Zellen auf den Mikroskoptisch. Führen Sie das rote Mundstück des Aspirators in den Mund ein.

Während der Verwendung musste dann die Aspiratornadel und die andere Hand die Petrischale bewegen, um einzelne Zellen zu identifizieren, die sequenziert werden sollten. Ziehen Sie mit Mundsaugen eine einzelne Zelle zusammen mit etwa ein bis zwei Mikrolitern Medium oder PBS in die Aspiratornadel. Übertragen Sie die Zelle in die acht Mikroliter Wasser in einer einzigen Vertiefung der 96-Well-PCR-Platte.

Die Qualität und der Nutzen von Einzelzellsequenzierungsdaten hängen vom Zustand jeder Zelle und ihrem Genom ab, daher sollten Sie bei der Zellvorbereitung und Mikroaspiration darauf achten, lebensfähige und nicht-apoptotische Zellen zu isolieren. Nachdem Sie jede Zelle aspiriert und in eine Vertiefung der PCR-Platte übertragen haben, markieren Sie die Vertiefung, in der eine Zelle aufgenommen wurde. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die gewünschte Anzahl von Zellen.

In der Zwischenzeit tauen Sie 10X Single Cell Lysis Fragmentation Buffer aus dem Whole Genome Amplification Kit auf. Um eine Kontamination während der Amplifikation des gesamten Genoms zu verhindern, geben Sie alle Reagenzien in eine Gewebekulturhaube. Verwenden Sie Pipettenspitzen mit Filtern und wechseln Sie die Pipettenspitze zwischen den Vertiefungen.

Kombinieren Sie für jeden Satz von bis zu 32 Zellen 32 Mikroliter 10X Einzelzell-Lyse- und Fragmentierungspuffer und zwei Mikroliter Proteinase K-Lösung in einem Mikrozentrifugenröhrchen und wirbeln Sie dann das Röhrchen durch, um den Inhalt zu mischen. Geben Sie einen Mikroliter der Lösung in jede Vertiefung und pipettieren Sie zum Mischen auf und ab. Decken Sie die Platte ab und versiegeln Sie alle Vertiefungen mit Plastikfolie.

Anschließend die Platte in einem Mini-Plattenschleudern kurz zentrifugieren. Lassen Sie anschließend die Platte mit dem folgenden Programm durch den Thermocycler laufen. Dann die Platte auf Eis abkühlen lassen und kurz zentrifugieren.

Um eine Arbeitslösung zur Vorbereitung der Bibliothek aus dem Whole Genome Amplification Kit herzustellen, kombinieren Sie für jede Zelle zwei Mikroliter 1X Single Cell Library Preparation Buffer und einen Mikroliter Library Stabilization Solution. Eine angemessene Zelllyse und vollständige Genomfragmentierung sind von entscheidender Bedeutung, um Verzerrungen während der Amplifikation des gesamten Genoms zu minimieren und die Erstellung hochwertiger Sequenzierungsbibliotheken zu gewährleisten. Achten Sie daher darauf, diese Schritte genau so auszuführen, wie sie geschrieben sind.

Entferne die Plastikfolie von der Schale und gib drei Mikroliter der Lösung in jede Vertiefung. Pipettieren Sie den Inhalt der Vertiefung zum Mischen auf und ab und ersetzen Sie dann die Plastikfolie. Nachdem Sie die Platte kurz gedreht haben, inkubieren Sie die Zellen zwei Minuten lang bei 95 Grad Celsius, kühlen Sie die Platte dann auf Eis ab und zentrifugieren Sie die Platte erneut kurz.

Entfernen Sie nun die Plastikfolie, geben Sie einen Mikroliter Library Preparation Enzyme in jede Vertiefung und pipettieren Sie den Inhalt der Vertiefung zum Mischen auf und ab, dann ersetzen Sie die Kunststofffolie. Nachdem Sie die Platte kurz gedreht haben, legen Sie sie in den Thermocycler und führen Sie das folgende Programm aus. Nachdem Sie die Platte abgekühlt und kurz gedreht haben, bereiten Sie eine funktionierende Amplifikationsmischung aus dem Whole Genome Amplification Kit vor, indem Sie 48,5 Mikroliter Wasser, 7,5 Mikroliter 10X Amplifikations-Mastermix und 5 Mikroliter WGA-DNA-Polymerase für jede Zelle kombinieren.

Bewahren Sie die Arbeitsmischung auf Eis auf. Entfernen Sie die Plastikfolie von der Platte. Geben Sie 61 Mikroliter der Arbeitsamplifikationsmischung in jede Vertiefung und pipettieren Sie den Inhalt jeder Vertiefung zum Mischen auf und ab, dann ersetzen Sie die Kunststofffolie.

Zentrifugieren Sie die Platte kurz und thermocycle wie folgt. Sequenzieren Sie die Proben und führen Sie die Datenanalyse gemäß dem Textprotokoll durch. Wie in dieser Abbildung gezeigt, erscheint die Probe bei erfolgreicher Amplifikation des gesamten Genoms als Abstrich auf einem Agarosegel.

Ein schwacher oder fehlender Abstrich deutet auf eine fehlgeschlagene Amplifikationsreaktion hin und die Probe sollte nicht sequenziert werden. Wie hier gezeigt, wurde die Analyse der Fragmentgrößen mittels Kapillarelektrophorese an einem Fragmentanalysator durchgeführt. Erfolgreich vorbereitete Bibliotheken haben eine ziemlich gleichmäßige Verteilung der Fragmentgrößen von 150 bis 900 Basenpaaren.

Eine fehlgeschlagene Bibliotheksvorbereitung führt zu einer verzerrten Verteilung der Fragmentgröße, und solche Bibliotheken sollten nicht sequenziert werden. Unter Verwendung des Hidden-Markov-Modells und der zirkulären binären Segmentierung wurde das Genom jeder Zelle in Segmente der geschätzten Kopienzahl zerlegt. Diese Tabelle zeigt die überlappenden Ergebnisse einer einzelnen Zelle und zeigt einen Gewinn auf Chromosom 10 von 67 auf 130 Megabase und einen Gewinn auf Chromosom 19 von 0 auf 20 Megabasen.

Die Isolierung und Ganzgenomamplifikation einzelner Zellen kann und sollte an einem einzigen Tag durchgeführt werden. Die Erstellung von Sequenzierungsbibliotheken, die Sequenzierung des gesamten Genoms und die Datenanalyse können dann nach einem flexiblen Zeitplan durchgeführt werden. Wenn die Zellisolierung und die Amplifikation des gesamten Genoms ordnungsgemäß durchgeführt werden und die Datenanalyse wie beschrieben streng durchgeführt wird, können Veränderungen der Kopienzahl von mehr als fünf Megabasen mit hoher Sensitivität und Spezifität nachgewiesen werden.

Während unser Protokoll speziell die Verwendung der Einzelzellsequenzierung zum Nachweis von Veränderungen der Kopienzahl beschreibt, können Aspekte dieses Protokolls, wie z. B. die Einzelzellisolierung und die Vorbereitung der Bibliothek, auf den Nachweis anderer genomischer Veränderungen angewendet werden.