Vorbereitung und Beobachtung von Dick biologischen Proben durch Scanning Transmission Electron Tomography
12. März 2017
Dieser Bericht beschreibt ein Probenvorbereitungsprotokoll und spezifische Bildgebungsbedingungen für die Durchführung der Rastertransmissionselektronentomographie von dicken biologischen Proben.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine dreidimensionale Rekonstruktion mit Tiefenschärfe einer dicken biologischen Probe mittels konvergenter Strahl-Rastertransmissionselektronentomographie zu erhalten. Diese Methode kann zentrale Fragen der Strukturbiologie zur Elektronentomographie dicker biologischer Proben beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Bilder im konvergenten Bitmodus aufgenommen werden können und die Datenverarbeitung mit den meisten Tomographie-Programmen durchgeführt werden kann.
Um mit der Vorbereitung der Zellkulturprobe zu beginnen, zentrifugieren Sie die Probe fünf Minuten lang bei 5000 x g. Verwenden Sie diese Zentrifugationsparameter während der gesamten Probenvorbereitung. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter PBS, angereichert mit 4 % Paraformaldehyd und 2 % Gluteraldehyd.
Inkubieren Sie die Suspension 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Zentrifugieren Sie die Mischung, verwerfen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet dreimal mit einer Milliliterportion PBS. Unter den gleichen Inkubationsbedingungen und dem gleichen Waschverfahren inkubieren Sie das Pellet in einem Milliliter PBS, angereichert mit 1%Osmiumtetroxid, und in einem Milliliter PBS, angereichert mit 2%Uranylacetat.
Anschließend kühlen Sie die Probe auf vier Grad Celsius ab. Dehydrieren Sie das Pellet durch aufeinanderfolgende Inkubationen in zunehmend konzentrierten Ethanollösungen. Aufrechterhaltung der Probentemperatur von vier Grad Celsius während der Inkubation, Zentrifugation und Reinigung.
Suspendieren Sie das dehydrierte Pellet in einem Milliliter reinem Ethanol und inkubieren Sie es über Nacht bei 4 Grad Celsius. Lassen Sie die Probe dann auf Raumtemperatur erwärmen und zentrifugieren Sie die Probe. Inkubieren Sie das Pellet in zunehmend konzentrierten Epoxidharzlösungen bei Raumtemperatur.
Nach der letzten Wäsche resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter reinem Epoxidharz und inkubieren Sie es über Nacht bei Raumtemperatur. Zentrifugieren Sie die Probe, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet dann in 200 Mikrolitern Epoxidharz und Härter. Übertragen Sie die Suspension in die Kapsel.
Inkubieren Sie die Kunststoffkapsel 48 Stunden lang bei 60 Grad Celsius, um das Harz zu polymerisieren. Nehmen Sie die Kapsel aus dem Inkubator und überprüfen Sie die Polymerisation des Harzes. Geben Sie eine Schicht Epoxidharz und Härter über die eingebettete Probe und inkubieren Sie die Kapsel erneut unter den gleichen Bedingungen.
Montieren Sie die in Harz eingebettete Probe kopfüber in einem Probenhalter. Fixieren Sie die Probe sicher auf dem Trimmblock eines Ultramikrotoms. Schneiden Sie die Kunststoffkapsel von der Probe im Harz ab.
Formen Sie das freiliegende Harz zu einer Pyramide. Übertragen Sie dann die Kapsel und den Probenhalter auf den beweglichen Arm des Ultramikrotoms. Setzen Sie ein Trimmmesser ein und verfeinern Sie unter Anleitung eines Mikroskops die Pyramidenform.
Ersetzen Sie das Trimmmesser durch ein Histologiemesser. Stellen Sie unter dem Mikroskop den Neigungswinkel der Kapsel so ein, dass die Pyramide senkrecht zur Messerkante steht. Stellen Sie die Schnittgeschwindigkeit ein und schneiden Sie die Probe.
Nachdem Sie die Probe geschnitten haben, übertragen Sie den ausgewählten Abschnitt auf ein behandeltes Kupfergitter über Filterpapier. Lassen Sie die Probe trocknen und laden Sie sie dann in das Elektronenmikroskop. Um die durchgehende Neigungsreihe zu entwerfen, berechnen Sie zunächst die Schärfentiefe des Elektronenstrahls und die maximale scheinbare Dicke der Probe.
Wählen Sie auf der Grundlage dieser Werte ein Fokusintervall aus und bestimmen Sie die Anzahl der Fokusschritte, die erforderlich sind, um die gesamte Probe bei maximaler scheinbarer Dicke abzubilden. Lokalisieren Sie dann bei geringer Vergrößerung den interessierenden Bereich innerhalb der Probe. Passen Sie die euzentrische Höhe so an, dass sich der ROI beim Drehen des Samples nicht zu verschieben scheint.
Stellen Sie sicher, dass der ROI über den gesamten Neigungsbereich sichtbar bleibt. Geben Sie die Parameter für die durchgehende Brennneigungsreihe für die automatische Bilderfassung ein und erfassen Sie die Bilder. Importieren Sie die Bildserien in ein Bildverarbeitungsprogramm und richten Sie die im gleichen Neigungswinkel gesammelten Bilder in einer pyramidalen Hierarchie aus.
Finden Sie die Ausrichtung bei jedem Neigungswinkel, indem Sie die ausgerichteten Bilder stapeln. Durchsuchen Sie den Stapel, um sicherzustellen, dass nur der fokussierte Bereich von Bild zu Bild verschoben wird, und richten Sie die Bilder nach Bedarf neu aus. Sobald die Ausrichtung in der gesamten Probe überprüft wurde, führen Sie die Fokusinformationen bei den hohen Einstellungen zusammen, um die Serie mit einem einzigen Bild pro Neigungswinkel zu erhalten.
Führen Sie die Suchausrichtung der Neigungsreihe basierend auf lokalen Minima oder Passermarkenmarkierungen durch. Führen Sie eine 3D-Rekonstruktion durch und untersuchen Sie das resultierende Bild. Wenn die Rekonstruktion verschwommen oder verformt erscheint, richten Sie die ursprüngliche Bildserie neu aus.
Eine Probe von T. brucei wurde mit dieser Methode abgebildet und analysiert. Bei einem Neigungswinkel von null Grad sind mehrere Details der Flagellentasche sichtbar.
Bei dem höheren Neigungswinkel von 70 Grad ist nur ein Teil jedes Bildes, das in der durchgehenden Brennweite aufgenommen wurde, scharf. Diese Position verschiebt sich im Laufe der Serie. Durch das Zusammenführen der fokussierten Abschnitte wird ein einzelnes Bild mit einer größeren Fokuszone erzeugt.
Dieser Effekt ist noch ausgeprägter, wenn die hochfrequenten Bereiche der durchgehenden Schwenkreihe hervorgehoben werden. Die hochfrequente Information erstreckt sich über den größten Teil des kombinierten Bildes, was darauf hindeutet, dass die durchgehende Brennweiten-Neigungsreihe gut verarbeitet wurde. Einmal gemeistert, kann der Bildverarbeitungsteil in etwa drei bis vier Stunden erledigt werden, abhängig von den gewählten Ausrichtungs- und Rekonstruktionsparametern.
Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Qualität der endgültigen Rekonstruktion stark von der Qualität der vorherigen Ausrichtungstests abhängt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Sammlung und die Bildverarbeitung einer Serie mit durchgehender Fokusneigung durchführen.
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Übersicht
Dieser Bericht beschreibt ein Probenvorbereitungsprotokoll und spezifische Bildgebungsbedingungen für die Durchführung der Raster-Transmissions-Elektronentomographie dicker biologischer Proben. Die Methode zielt darauf ab, eine dreidimensionale Rekonstruktion mit Tiefenschärferückgewinnung zu erreichen und wichtige Fragen in der Strukturbiologie zu beantworten.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Strukturbiologie
- Elektronentomographie
- Techniken zur Probenvorbereitung
Hintergrund
- Die konvergente Strahl-Raster-Transmissions-Elektronentomographie wird für die Bildgebung dicker biologischer Proben verwendet.
- Diese Technik ermöglicht die Tiefenschärferückgewinnung in dreidimensionalen Rekonstruktionen.
- Sie bietet Einblicke in die strukturelle Organisation biologischer Proben.
- Die Datenverarbeitung kann mit Standard-Tomographie-Software durchgeführt werden.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines zuverlässigen Probenvorbereitungsprotokolls für die Elektronentomographie.
- Verbesserung der Bildgebungstechniken für dicke biologische Proben.
- Erleichterung dreidimensionaler Rekonstruktionen, die die Strukturbiologieforschung unterstützen können.
Verwendete Methoden
- Zentrifugation von Zellkulturproben bei 5000 x g für fünf Minuten.
- Resuspendierung der Zellen in PBS mit 4% Paraformaldehyd und 2% Glutaraldehyd.
- Anwendung spezifischer Bildgebungsbedingungen für die Elektronentomographie.
- Nutzung des konvergenten Strahlmodus für die Bildaufnahme.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Vorbereitung von Proben für die Raster-Transmissions-Elektronentomographie.
- Demonstration der Tiefenschärferückgewinnung in dreidimensionalen Rekonstruktionen.
- Erzeugung hochwertiger Bilder, die für die strukturelle Analyse geeignet sind.
- Validierung der Methode zur Beantwortung wichtiger Fragen in der Strukturbiologie.
Schlussfolgerungen
- Das entwickelte Protokoll ist effektiv für die Vorbereitung dicker biologischer Proben.
- Die konvergente Strahl-Raster-Transmissions-Elektronentomographie verbessert die Bildgebungsfähigkeiten.
- Diese Methode kann einen bedeutenden Beitrag zur Strukturbiologieforschung leisten.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This method enables high-resolution 3D imaging of thick biological specimens, supporting structural biology research in drug target characterization and mechanism of action studies. By recovering depth of field through through-focal tilt series, it improves data quality for complex samples that challenge conventional electron microscopy. The approach enhances predictive confidence in target validation by providing detailed ultrastructural context for phenotypic observations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of subcellular architecture in native-like states to clarify target localization and pathway context.
- Operational Value: Supports functional target validation by correlating structural phenotypes with genetic or pharmacological perturbations.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for correlative light and electron microscopy workflows to enrich assay readouts.
- Operational Value: Standardizes sample preparation for reproducible ultrastructural screening of compound-induced morphological changes.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant ultrastructural detail to align with histopathological findings and biomarker studies.
- Operational Value: Enables mechanistic de-risking by visualizing target engagement effects on cellular architecture in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through preclinical assessment, offering structural insights that inform lead optimization and safety evaluation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by visualizing target distribution and organelle remodeling in response to modulators.
- Screening: Delivers quantitative morphological outputs for high-content analysis of compound libraries in disease-relevant systems.
- Analytics: Generates 3D volumetric data enabling morphometric analysis and statistical comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Connects in vitro findings to tissue-level pathology through conserved ultrastructural phenotypes.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized platform for iterative structural characterization across multiple projects and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in target validation by providing direct visualization of structural consequences of modulation.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized fixation, contrasting, and embedding protocols compatible with core facility workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying off-target structural effects early in the discovery pipeline.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by delivering ultrastructural evidence for target specificity and safety margins.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electron microscopy sample preparation and tomography data collection.
- Dependent on access to scanning transmission electron microscopes with tomography holders and stable stages.
- Necessitates cross-team standardization between biology and imaging groups for consistent sample handling.
- Involves adaptation considerations for different cell types, tissue densities, and resin compatibility.
- Limited by sample thickness constraints and potential radiation sensitivity during prolonged tilt-series acquisition.
