Vorbereitung und Beobachtung von Dick biologischen Proben durch Scanning Transmission Electron Tomography

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine dreidimensionale Rekonstruktion mit Tiefenschärfe einer dicken biologischen Probe mittels konvergenter Strahl-Rastertransmissionselektronentomographie zu erhalten. Diese Methode kann zentrale Fragen der Strukturbiologie zur Elektronentomographie dicker biologischer Proben beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Bilder im konvergenten Bitmodus aufgenommen werden können und die Datenverarbeitung mit den meisten Tomographie-Programmen durchgeführt werden kann.

Um mit der Vorbereitung der Zellkulturprobe zu beginnen, zentrifugieren Sie die Probe fünf Minuten lang bei 5000 x g. Verwenden Sie diese Zentrifugationsparameter während der gesamten Probenvorbereitung. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter PBS, angereichert mit 4 % Paraformaldehyd und 2 % Gluteraldehyd.

Inkubieren Sie die Suspension 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Zentrifugieren Sie die Mischung, verwerfen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet dreimal mit einer Milliliterportion PBS. Unter den gleichen Inkubationsbedingungen und dem gleichen Waschverfahren inkubieren Sie das Pellet in einem Milliliter PBS, angereichert mit 1%Osmiumtetroxid, und in einem Milliliter PBS, angereichert mit 2%Uranylacetat.

Anschließend kühlen Sie die Probe auf vier Grad Celsius ab. Dehydrieren Sie das Pellet durch aufeinanderfolgende Inkubationen in zunehmend konzentrierten Ethanollösungen. Aufrechterhaltung der Probentemperatur von vier Grad Celsius während der Inkubation, Zentrifugation und Reinigung.

Suspendieren Sie das dehydrierte Pellet in einem Milliliter reinem Ethanol und inkubieren Sie es über Nacht bei 4 Grad Celsius. Lassen Sie die Probe dann auf Raumtemperatur erwärmen und zentrifugieren Sie die Probe. Inkubieren Sie das Pellet in zunehmend konzentrierten Epoxidharzlösungen bei Raumtemperatur.

Nach der letzten Wäsche resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter reinem Epoxidharz und inkubieren Sie es über Nacht bei Raumtemperatur. Zentrifugieren Sie die Probe, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet dann in 200 Mikrolitern Epoxidharz und Härter. Übertragen Sie die Suspension in die Kapsel.

Inkubieren Sie die Kunststoffkapsel 48 Stunden lang bei 60 Grad Celsius, um das Harz zu polymerisieren. Nehmen Sie die Kapsel aus dem Inkubator und überprüfen Sie die Polymerisation des Harzes. Geben Sie eine Schicht Epoxidharz und Härter über die eingebettete Probe und inkubieren Sie die Kapsel erneut unter den gleichen Bedingungen.

Montieren Sie die in Harz eingebettete Probe kopfüber in einem Probenhalter. Fixieren Sie die Probe sicher auf dem Trimmblock eines Ultramikrotoms. Schneiden Sie die Kunststoffkapsel von der Probe im Harz ab.

Formen Sie das freiliegende Harz zu einer Pyramide. Übertragen Sie dann die Kapsel und den Probenhalter auf den beweglichen Arm des Ultramikrotoms. Setzen Sie ein Trimmmesser ein und verfeinern Sie unter Anleitung eines Mikroskops die Pyramidenform.

Ersetzen Sie das Trimmmesser durch ein Histologiemesser. Stellen Sie unter dem Mikroskop den Neigungswinkel der Kapsel so ein, dass die Pyramide senkrecht zur Messerkante steht. Stellen Sie die Schnittgeschwindigkeit ein und schneiden Sie die Probe.

Nachdem Sie die Probe geschnitten haben, übertragen Sie den ausgewählten Abschnitt auf ein behandeltes Kupfergitter über Filterpapier. Lassen Sie die Probe trocknen und laden Sie sie dann in das Elektronenmikroskop. Um die durchgehende Neigungsreihe zu entwerfen, berechnen Sie zunächst die Schärfentiefe des Elektronenstrahls und die maximale scheinbare Dicke der Probe.

Wählen Sie auf der Grundlage dieser Werte ein Fokusintervall aus und bestimmen Sie die Anzahl der Fokusschritte, die erforderlich sind, um die gesamte Probe bei maximaler scheinbarer Dicke abzubilden. Lokalisieren Sie dann bei geringer Vergrößerung den interessierenden Bereich innerhalb der Probe. Passen Sie die euzentrische Höhe so an, dass sich der ROI beim Drehen des Samples nicht zu verschieben scheint.

Stellen Sie sicher, dass der ROI über den gesamten Neigungsbereich sichtbar bleibt. Geben Sie die Parameter für die durchgehende Brennneigungsreihe für die automatische Bilderfassung ein und erfassen Sie die Bilder. Importieren Sie die Bildserien in ein Bildverarbeitungsprogramm und richten Sie die im gleichen Neigungswinkel gesammelten Bilder in einer pyramidalen Hierarchie aus.

Finden Sie die Ausrichtung bei jedem Neigungswinkel, indem Sie die ausgerichteten Bilder stapeln. Durchsuchen Sie den Stapel, um sicherzustellen, dass nur der fokussierte Bereich von Bild zu Bild verschoben wird, und richten Sie die Bilder nach Bedarf neu aus. Sobald die Ausrichtung in der gesamten Probe überprüft wurde, führen Sie die Fokusinformationen bei den hohen Einstellungen zusammen, um die Serie mit einem einzigen Bild pro Neigungswinkel zu erhalten.

Führen Sie die Suchausrichtung der Neigungsreihe basierend auf lokalen Minima oder Passermarkenmarkierungen durch. Führen Sie eine 3D-Rekonstruktion durch und untersuchen Sie das resultierende Bild. Wenn die Rekonstruktion verschwommen oder verformt erscheint, richten Sie die ursprüngliche Bildserie neu aus.

Eine Probe von T. brucei wurde mit dieser Methode abgebildet und analysiert. Bei einem Neigungswinkel von null Grad sind mehrere Details der Flagellentasche sichtbar.

Bei dem höheren Neigungswinkel von 70 Grad ist nur ein Teil jedes Bildes, das in der durchgehenden Brennweite aufgenommen wurde, scharf. Diese Position verschiebt sich im Laufe der Serie. Durch das Zusammenführen der fokussierten Abschnitte wird ein einzelnes Bild mit einer größeren Fokuszone erzeugt.

Dieser Effekt ist noch ausgeprägter, wenn die hochfrequenten Bereiche der durchgehenden Schwenkreihe hervorgehoben werden. Die hochfrequente Information erstreckt sich über den größten Teil des kombinierten Bildes, was darauf hindeutet, dass die durchgehende Brennweiten-Neigungsreihe gut verarbeitet wurde. Einmal gemeistert, kann der Bildverarbeitungsteil in etwa drei bis vier Stunden erledigt werden, abhängig von den gewählten Ausrichtungs- und Rekonstruktionsparametern.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Qualität der endgültigen Rekonstruktion stark von der Qualität der vorherigen Ausrichtungstests abhängt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Sammlung und die Bildverarbeitung einer Serie mit durchgehender Fokusneigung durchführen.