Sublimation von DAN Matrix für die Erkennung und Visualisierung von Gangliosiden in Rattenhirngewebe für die MALDI-Imaging-Massenspektrometrie

Das übergeordnete Ziel dieses Sublimationsprotokolls ist es, einen detaillierten, leicht verständlichen Probenvorbereitungsprozess für den Nachweis von Gangliosiden in bildgebenden MALDI-Massenspektrometrie-Experimenten bereitzustellen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Neurobiologie zu beantworten, einschließlich der anatomischen Verteilung und Funktion von Gangliosiden, sowohl im gesunden Gehirn als auch in der Hirnpathologie. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie für eine qualitativ hochwertige Bildgebung vieler Lipidspezies angepasst werden kann, ohne dass das Protokoll geändert werden kann.

Um mit diesem Verfahren zu beginnen, extrahieren Sie Hirngewebe aus der Ratte und bereiten Sie die Kryostatierung vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Positionieren Sie dann das Gewebe im Kryostaten. Schneiden Sie das Gewebe bis zur gewünschten anatomischen Stelle.

Stellen Sie sicher, dass die Schnittstärke zwischen acht und 12 Mikrometern liegt. Mit dem Kryostat-Stabilisator den abgeflachten Gewebeschnitt langsam durchschneiden. Löcher oder Markierungen auf dem Gewebe können entstehen, wenn der Überrollbügel falsch platziert ist oder wenn die Klinge stumpf ist.

Bewegen Sie das Taschentuch mit sauberen Pinseln in die Mitte der Schneideplattform. Um das Gewebe zu kartieren, frieren Sie leitfähige Objektträger oder Metallplatten ein, indem Sie sie während des Schneidens in den Kryostaten legen. Wenn der Objektträger vollständig eingefroren ist, bewegen Sie das Schnittgewebe vorsichtig mit sauberen Pinseln auf den leitfähigen Dienst des Objektträgers.

Sobald alle Gewebeabschnitte korrekt auf dem Objektträger positioniert sind, legen Sie einen Finger unter den Objektträger gegenüber dem Gewebe und drücken Sie, bis der Schnitt auftaut. Legen Sie dann die Objektträger mit dem Taschentuch für fünf bis 10 Minuten in einen Exsikkator. Alternativ können Sie einen warmen Objektträger verwenden und ihn mit der leitfähigen Seite nach unten leicht gegen die abgeflachten Gewebeabschnitte drücken.

Stellen Sie bei der Arbeit im Abzug ein Sandbad in einem Aluminiumbehälter auf eine Kochplatte. Die Kochplatte sollte auf einer Metallscherenhebebühne mit der entsprechenden Oberfläche stehen. Schalten Sie die Kochplatte ein und stellen Sie die Temperatur auf 140 Grad Celsius ein.

Verwenden Sie den Temperatur-Feedback-Fühler, um die Sandtemperatur während des gesamten Experiments zu überwachen und die Temperaturkonsistenz sicherzustellen. Geben Sie anschließend 300 Milligramm DAN-Matrix auf die Unterseite des Sublimationsgeräts. Verteilen Sie die Matrize in einer gleichmäßigen Schicht in der Mitte des Geräts bis zur ungefähren Breite und Länge des Objektträgers, der sublimiert werden soll.

Setzen Sie eine Metallplatte auf die Innenfläche des Geräts, wobei die Platte direkten Kontakt mit dem Boden des Kondensators hat. Kleben Sie einen leeren Testobjektträger diagonal über die Oberfläche der Metallplatte, wobei ein Klebeband an den Außenkanten des Objektträgers angebracht wird. Verbinden Sie den oberen und unteren Teil des Geräts mit einem Gummi-O-Ring in der Mitte, um eine vollständige Abdichtung zu gewährleisten.

Platzieren Sie ein U-Gelenk aus Metall um die Mitte des Geräts und ziehen Sie die Schraubstöcke fest, bis die obere und untere Hälfte des Geräts fest miteinander abgedichtet sind. Platzieren Sie dann das Gerät in den Metall-O-Ring um das Sandbad. Geben Sie als Nächstes eine Handvoll zerstoßenes Eis in den Kondensator.

Füllen Sie den Kondensator zu einem Viertel bis zur Hälfte mit kaltem Wasser, um Eismatsch zu erzeugen. Der Eismatsch kühlt die Metallplatte auf der Innenseite des Geräts und anschließend die daran haftende Rutsche. Warten Sie mindestens fünf Minuten, bis die Temperatur konstant ist.

Gießen Sie dann 300 mL Methanol in den Kühlfallenbehälter und legen Sie die Gläser in den Behälter. Schließen Sie die Vakuumpumpe über einen Gummischlauch an den Kühlfallenausgang an. Verwenden Sie ein weiteres Stück Gummischlauch, um den Kühlfalleneingang mit dem Sublimationsgerät zu verbinden.

Stellen Sie sicher, dass der Schlauch mit Metallklammern fest befestigt ist. Verwenden Sie die Vakuumpumpe, um ein Vakuum von 30 bis 50 Millitorr zu fördern. Lassen Sie die Pumpen mindestens fünf Minuten lang laufen, um den Druckausgleich herzustellen.

Lassen Sie zwei bis drei kleine Stücke Trockeneis in das Ethanol auf den Boden des Kühlfallenbehälters fallen. Die Kühlfalle trägt dazu bei, dass sich keine Matrixpartikel in der Vakuumpumpe ansammeln. Die Schraubstöcke am U-Ring des Sublimationsgeräts müssen nach dem Einschalten der Vakuumpumpe möglicherweise festgezogen werden, da der Druck in der Vorrichtung abnimmt.

Stellen Sie sicher, dass sich die Temperatur des Sandbads bei 140 Grad Celsius stabilisiert hat. Überprüfen Sie auch, ob das Vakuum eingeschaltet ist und ob das Gerät im Metall-O-Ring über dem Sandbad befestigt ist und alle Schläuche angeschlossen sind. Stellen Sie den Timer auf sieben Minuten ein, aber starten Sie den Timer nicht.

Heben Sie die Scherenhebebühne und das Sandbad langsam bis zum Sublimationsgerät an, bis sich das U-Gelenk des Sublimators weit über dem Metall-O-Ring befindet. Dieser zusätzliche Platz ermöglicht die Einstellung des Geräts auf dem Sand. Drücken Sie den Sublimator schnell und vorsichtig auf die Sandoberfläche, um sicherzustellen, dass das Gerät gleichmäßig auf dem Sand sitzt.

Starten Sie dann sofort den Timer. Wenn der Timer ertönt, schalten Sie die Vakuumpumpe aus und senken Sie den Scherenhub vorsichtig ab, bis der Sublimator das Sandbad nicht mehr berührt und sicher im Metall-O-Ring sitzt. Lösen Sie langsam das Mikroentlüftungsventil, um den Druck im Gerät abzulassen.

Lösen Sie die Metallklammer um den Gummischlauch des Sublimationsgeräts und beginnen Sie langsam, den Schlauch zu lösen. Nachdem sich der Gummischlauch leicht gelöst hat, biegen Sie den Schlauch zur Seite, damit der Restdruck entweichen kann. Wenn der Umgebungsdruck zurückkehrt, entfernen Sie vorsichtig den Gummischlauch von der Sublimationsvorrichtung.

Lösen Sie anschließend die Schraubstöcke am U-Gelenk des Geräts und entfernen Sie sie. Trennen Sie vorsichtig die beiden Hälften des Sublimationsgeräts und ziehen Sie den Objektträger von der Oberseite des Innenglases ab. Untersuchen Sie die Folie, um eine gleichmäßige Matrixverteilung zu bestätigen.

Wenn die Verteilung und Menge der sublimierten Matrix ausreichend ist, kleben Sie einen neuen Objektträger mit Gewebe auf die Innenseite des Sublimators und wiederholen Sie den Sublimationsvorgang. Fahren Sie mit der Bildgebung und Analyse fort, wie im Textprotokoll beschrieben. Das Massenspektrum zeigt die Ionenhäufigkeit von Anolyten in einem Massenbereich von 1000 bis 2000.

Die wichtigsten Ganglioside der A-Serie sind entlang des Spektrums markiert. Hier ist das entsprechende molekulare Bild von Gangliosiden im Rattengehirn zu sehen. Das molekulare Bild zeigt die anatomische Verteilung mehrerer Gangliosidarten durch Farbcodierung, die mit der Software ImageJ überlagert und pseudogefärbt wurden.

Im Allgemeinen können Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da es viele Variablen im Probenvorbereitungsprozess gibt, die die Qualität der IMS-Ergebnisse beeinflussen können und oft in den Protokollen ausgelassen werden. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Menge der Matrix, die sublimiert wird, nach jedem Experiment zu überwachen und die Sublimationszeit für den Objektträger entsprechend zu ändern. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher, die Rolle von Membranlipiden wie Gangliosiden nach Hirnverletzungen, der Ner-Jone-Krankheit und dem natürlichen Alterungsprozess zu erforschen.

Diese Methode kann einen Einblick in die Häufigkeit und anatomische Verteilung von Lipiden im Gehirn geben, sie kann aber auch auf andere Systeme angewendet werden, einschließlich Gewebe außerhalb des Gehirns und sogar auf Pflanzen- und Insektenmodelle. Die Arbeit mit beschädigten Wurzeln kann äußerst gefährlich sein, und bei der Durchführung dieses Verfahrens sollten immer Vorsichtsmaßnahmen wie Handschuhe, Masken und Augenschutz getroffen werden.