Name: Sublimation von DAN Matrix für die Erkennung und Visualisierung von Gangliosiden in Rattenhirngewebe für die MALDI-Imaging-Massenspektrometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Erfahren Sie die Sublimation von DAN-Matrix zur Detektion und Visualisierung von Gangliosiden in Rattenhirngewebe mittels MALDI-Imaging-Massenspektrometrie. Diese Methode ermöglicht hochwertige Lipidbildgebung.

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Wir möchten Kristina Jurcic in der MALDI MS-Einrichtung der University of Western Ontario sowie dem National Sciences and Engineering Council (NSERC) für die Finanzierung dieser Arbeit danken. Die Autoren möchten sich auch bei der Caprioli-Gruppe (Vanderbilt University, TN) und der Chaurand-Gruppe (Université de Montreal, QC) für ihre Ratschläge zur Optimierung der in diesem Manuskript vorgestellten Sublimationstechnik bedanken.

Alle Tier Verfahren für den Umgang unten, um sich an der University of Western Ontario Tierpflege Komitee (2016-014) beschrieben. 1. Gewebepräparation und Sectioning <ol><li> Extrahieren Hirngewebe von Ratten durch einen Prozess bekannt als &quot;frisch gefroren Extraction&quot; (FFE). <ol><li> Euthanize die Ratte mit einer Überdosis Pentobarbital-Natrium und überwachen Reflexe in den Gliedern. Sobald alle Reflexe aufgehört haben, trennen den Kopf der Ratte eine Guillotine mit. </li><li> Trennen Sie vorsichtig die Muskeln und andere Gewebe aus dem Schädel mit einem Skalpell. Verwenden Knochenschneidezangen den Schädel zu brechen, das Gehirn zu belichten, von der Basis des Schädels (Foramen magnum) mit dem vorderen Teil beginnen. </li><li> Sobald das Gehirn ausgesetzt ist, es vorsichtig mit einem Spatel chirurgischen aushöhlen und sofort für Flash Einfrieren auf zerstoßenem Trockeneis statt. HINWEIS: Das Gehirn wird sehr formbar sein. Daher extreme Vorsicht walten, wenn das Gehirn Platzierung aufTrockeneis. Wenn das Gehirn zerdrückt oder gegen eine Oberfläche gedrückt wird, wird er seine Form ändert und in dieser Position fixieren. </li></ol></li><li> Entfernen Sie frische gefrorene Gewebe (nicht mit Formaldehyd durchbluteten oder in OCT eingebettet) von - 80 ° C Gefrierschrank und auf Trockeneis. </li><li> Legen Sie einige Tropfen Wasser auf einem Kryostat Halter und auf entweder Trockeneis oder Kryostaten freeze bar. Drücken Sie Gewebe leicht auf Kryostaten Halter, wie es beginnt, bis das Wasser gefriert um die Basis des Gewebes und verankert sie an Ort und Stelle zu frieren und zu halten. Fügen Sie zusätzliches Wasser weiter in das Gewebe an der Halterung zu sichern, falls erforderlich. HINWEIS: Das Wasser wird zur Montage Gewebe, um anstelle der OCT Medien verwendet, um eine Kontamination des Gewebes mit den Verbindungen zu vermeiden, die die Erfassung des gewünschten Signals beeinflussen können. </li><li> Position Gewebe in Kryostaten. § Gewebe bis zur gewünschten anatomischen Lage. Stellen Sie sicher, dass die Schnittstärke zwischen 8 - 12 &amp; mgr; m. HINWEIS: Wenn Gewebe in kommunalen Kryostaten sectioningGeräte, ist es zwingend notwendig, dass getrennte Materialien wie Messer, Bürsten, Stabis und Halter, um eine Kontamination mit Vergussmassen zu vermeiden, verwendet werden. Das Innere des Kryostaten sollte auch gründlich mit Ethanol vor der Verwendung gereinigt werden. </li><li> Unter Verwendung des Kryostaten Stabilisator, abgeflachte langsam Abschnitt Gewebeschnitten. Löcher oder Markierungen auf dem Gewebe kann auftreten, wenn der Überrollbügel Platzierung ist falsch oder Klinge ist stumpf. Bewegen Sie das Gewebe in die Mitte des Schneidens Plattform sauber Pinseln verwenden. </li><li> Montage <ol><li> Frieren leitfähigen Folien oder Metallplatten, die durch sie in den Kryostaten platziert, während das Schneiden. Wenn der Schlitten vollständig gefroren, vorsichtig das geschnittene Gewebe auf die leitfähige Oberfläche des sauberen Pinseln mit Folie zu gelangen. Sobald alle Gewebeschnitte korrekt auf der Folie positioniert sind, legen Sie einen Finger unter der Folie, gegenüber dem Gewebe, und drücken Sie, bis der Abschnitt auftaut. HINWEIS: Abschnitte während des Auftauprozeß falten oder rollen kann, wennVerwendung dieses Montageverfahren. Dies kann durch Halten der Folie in dem Kryostaten verringert werden, wenn das Gewebe aufgetaut. Wenn diese Fragen problematisch werden, eine Alternative ist warm Einhängemethode unten aufgeführt. </li><li> Alternativ nehmen Sie ein Raumtemperatur Indiumzinnoxid (ITO) Schieber (oder Metallplatte) und leicht auf gefrorenen Gewebeschnitt nach unten auf das Aufschneiden Plattformoberfläche, leitfähige Seite nach unten drücken. Dies wird zu dem Gewebeschnitt Auftauen führen gleichmäßig auf die Oberfläche der Folie mit wenig Kräuseln oder Falten des Gewebes. HINWEIS: Die Kondensation unter dem Abschnitt auftreten können bei der Montage mit dieser Methode, die zum Verlust bestimmter Proteine ​​und Lipide führen kann. </li></ol></li><li> Die Objektträger mit dem Gewebe in einem Exsikkator während 5 - 10 min. </li></ol> 2. Sublimatorschiffchen Gerät Set-up HINWEIS: Führen Sie diese Schritte in einem Abzug. <ol><li> Legen Sie ein Sandbad in einem Aluminiumbehälter auf einer heißen Platte, mit der heißen Platte auf einem Metall-Scherenbühnegeeigneter Oberfläche (dh größer als die Kochplatte). Schalten Sie auf der heißen Platte und die Temperatur auf 140 ° C. HINWEIS: Der Schmelzpunkt für DAN-Matrix ist zwischen 187 bis 190 ° C. Verpassen Sie nicht diese Temperatur auf der Heizplatte nicht überschreiten. <ol><li> Wenn die heiße Platte mit einer Temperatur-Feedback-Sonde ausgestattet ist, verwenden Sie es Sandtemperatur während des Experiments zu überwachen und Temperaturkonstanz zu gewährleisten. Diese Funktion kann über verschiedene Sublimation Experimente mit dem Experiment Reproduzierbarkeit unterstützen. HINWEIS: Das Sandbad sollte in einem Aluminiumbehälter als Glasbehälter enthalten sein können, bei hohen Temperaturen zerbrechen. </li></ol></li><li> Platzieren 300 mg von DAN-Matrix auf der Bodenfläche des -Sublimationsapparatur. Legen Sie die Matrix in der Mitte der Vorrichtung und verteilt in einer gleichmäßigen Schicht in der ungefähren Breite und Länge des Schlittens sublimiert werden. VORSICHT: DAN-Matrix ist giftig. Daher ist es wichtig, Handschuhe tragen, Masken und SicherheitSchutzbrille zu allen Zeiten, wenn das pulverförmige Matrix Handhabung. DAN sollte im Dunkeln gelagert werden, da sie lichtempfindlich ist. </li><li> Band, das eine Metallplatte, auf die innere Oberfläche der Vorrichtung mit der Platte über die gesamte Oberfläche des Objektträgers während der Sublimation Kühl direkten Kontakt mit dem Boden des Kondensators, um sicherzustellen, gleichmäßige Verteilung der Temperatur zu machen. Alternativ Sand der Boden des Kondensators um eine flache Oberfläche zu gewährleisten. <ol><li> Legen Sie das Band entlang der äußeren Kanten der Platte und sich an den Seiten des inneren Glaswaren. Wenn das Band unter der Platte angeordnet ist, und haftet an dem Boden der inneren Glasoberfläche kann die Temperaturverteilung nicht gleichmäßig sein und in ungleichmäßigen Matrix Verteilung über die Oberfläche des Objektträgers führen könnte. </li><li> Kleben Sie ein Leerzeichen (Test) gleiten diagonal über die Oberfläche der Metallplatte mit dem Band wieder an den äußeren Rändern des Schlittens platziert. </li></ol></li><li> Verbinden Sie die oberen und unteren Abschnitte der Vorrichtung, wit einem Gummi-O-Ring in der Mitte eine vollständige Abdichtung zu gewährleisten. </li><li> Legen Sie ein Metall U-Gelenk um die Mitte des Gerätes und ziehen Laster, bis die obere und die untere Hälfte der Vorrichtung sind eng miteinander versiegelt. Legen Sie in den Metall-O-Ring über dem Sandbad. </li><li> Nehmen Sie eine Hand voll zerstoßenes Eis und legen Sie es in den Kondensator. Füllen Kondensator ¼ mit kaltem Wasser auf ½ Eisbrei zu schaffen. Die Eisbrei wird die Metallplatte auf der Innenseite der Vorrichtung kühlen und anschließend den Schieber daran haften. Warten mindestens 5 min für die Temperatur einen stabilen Zustand zu erreichen. </li><li> Gießen Sie 300 ml Ethanol in der Kühlfalle Behälter und legen Sie das Glas in den Behälter. Drop 2 bis 3 kleine Stücke Trockeneis in das Ethanol in der Unterseite des Kühlfalle Behälter. Die Kühlfalle Eingang hat ein Glasrohr mit dem Boden des Zylinders ausgeführt wird, während das Ausgangssignal nicht. </li><li> Schließen Sie die Vakuumpumpe an den Kühlfalle Ausgang Gummischlauch mit. Verwenden Sie ein anderes Stück GummiSchlauch der Kühlfalle Eingang mit dem -Sublimationsapparatur zu verbinden. Stellen Sie sicher, dass der Schlauch fest Metallklammern verwenden, wenn verfügbar gesichert ist. </li><li> Verwenden Sie die Vakuumpumpe ein Vakuum von 30 zu liefern - 50 mT. Die Pumpe für mindestens 5 min für Druckausgleich auszuführen. Schraubstöcke auf U-Ring der Sublimation Vorrichtung kann wieder festgezogen werden müssen, sobald die Vakuumpumpe aufgrund von vermindertem Druck in die Vorrichtung eingeschaltet wird. HINWEIS: Es wird dringend empfohlen, dass ein Vakuum-Messgerät an der Pumpe angebracht werden, um den Druck des Vakuums während des Experiments zu überwachen und auf undichte Stellen in Druck zu testen, um die höchstmögliche Reproduzierbarkeit zwischen den Experimenten zu erreichen. Allerdings sind die meisten Pumpen einen konstanten Druck aufrecht zu erhalten, damit der Sensor möglicherweise nicht für erfahrene Anwender wesentlich sein. Außerdem können Vakuumdichtung Fett verwendet werden, um Vakuumdruck helfen halten. </li></ol> 3. Sublimation <ol><li> Stellen Sie sicher, dass das Sandbad Temperatur stabilized bei 140 ° C und daß die Vorrichtung in dem Metall-O-Ring über dem Sandbad mit allen Schlauch verbunden gesichert ist und das Vakuum eingeschaltet. </li><li> Zeitschaltuhr für 7 min, aber nicht Timer starten. Langsam heben auf die -Sublimationsapparatur die Scherenbühne und Sandbad, bis die U-Gelenk des Sublimatorschiffchen deutlich über dem O-Ring-Metall ist. Dieser zusätzliche Platz kann für die Einstellung der Vorrichtung auf dem Sand. <ol><li> drücken Sie schnell die Sublimatorschiffchen sanft auf der Sandoberfläche, um sicherzustellen, dass die Vorrichtung gleichmäßig auf dem Sand sitzt, und dann sofort den Timer zu starten. </li></ol></li><li> Wenn der Timer ertönt, schalten Sie die Vakuumpumpe und vorsichtig absenken die Scherenbühne, bis der Sublimatorschiffchen ausgeschaltet ist nicht mehr das Sandbad zu berühren und sicher in der Metall-O-Ring sitzt. <ol><li> Langsam die Mikro-Entlüftungs lösen Ventildruck in der Vorrichtung zu lösen. Lösen Sie die Metallschelle um den Gummischlauch der -Sublimationsapparatur und beginnen langsam das Rohr zu lösen. Sobald die rubber Rohr leicht biegen, um die Röhre zu einer Seite zu ermöglichen, Restdruck entweichen gelockert wurde. </li><li> Bei Umgebungsdruck zurückkehrt, vorsichtig den Gummischlauch von der -Sublimationsapparatur entfernen. </li></ol></li><li> Lösen Sie die Laster auf der U-Verbindung des Gerätes und zu entfernen. Trennen Sie vorsichtig die beiden Hälften der -Sublimationsapparatur und ziehen Sie die Folie von der Oberseite des inneren Glaswaren aus. Untersuchen Folie zu bestätigen auch Matrix-Verteilung. HINWEIS: Wenn Matrix uneben ist, kann die pulverförmige Matrix in dem Boden des Sublimators neu positioniert werden, oder der Sublimator Vorrichtung kann für die nächste Folie in den Sand neu positioniert werden. Die Sublimation Vorgang mehrmals wiederholt werden, können die gleiche Matrix, jedoch wird die Matrix wird schließlich dunkler aus wiederholten Wärmebelastung und der Menge an Pulver, verringert sich, dass die Sublimation der Zeit geringfügig angepasst werden müssen kompensiert werden. Aus diesem Grund ist es wichtig, die Menge von Matrix bei überwachenng sublimierte nach jedem Experiment Konsistenz in Matrixablagerung zwischen den Folien, um sicherzustellen, </li><li> Wenn die Verteilung und Menge der Matrix sublimiert ausreichend ist, kleben Sie eine neue Folie mit Gewebe auf der Innenseite des Sublimatorschiffchen und wiederholen Sie Abschnitt 3. HINWEIS: Für die Qualitätskontrolle (QC) Zwecke kann die Menge der Matrix sublimierte nach jedem Experiment gemessen werden , indem die Folie vor und nach der Sublimation Wiege- und das Gewicht der sublimierten Matrix mit der Oberfläche des Schiebers Dividieren 2 sollte beachtet werden , dass aufgrund der mangelnden Präzision der meisten Skalen über vier Dezimalstellen und Variabilität zwischen den Skalen sollten diese Messungen nur einen Leitfaden für die optimale Matrix Ablagerung auf eine voll quantifizierbare Mittel der QC im Gegensatz verwendet werden, sofern nicht ein hoher Präzisionswaage (siehe Abbildung verwendet wird , 3). </li></ol> 4. Tissue Storage / Rehydrierung <ol><li> Nach Sublimation, Dias lagern in einem verschlossenen Behälter oder kleine Cassette in verschlossenen Plastikbeutel. </li><li> Inkubieren Dias in -20 ° C Gefrierschrank für 2 Stunden oder über Nacht. HINWEIS: Das Ziel des Gefriervorgangs ist als Rehydratisierungsschritt für die Desorption von Gewebematerialien in die Matrix zu wirken. Der Gefriervorgang ist auch gezeigt worden für bis zu 1 Woche Abbau von Lipidsignalen zu verhindern , wenn bei -80 ° C 12 gespeichert. Aus diesem Grund wird der Zeit die Menge der Proben in der Tiefkühltruhe aufbewahrt werden kann bis zu einem gewissen Grad variiert werden, um die Bedürfnisse des Experimentators zu entsprechen, ohne Signalerfassungs signifikant zu verändern (wie in unserem Labor beobachtet). Wir haben jedoch eine gewisse Verfärbung der Matrix bemerkt, wenn Proben länger als 24 h bei -20 ° C eingefroren. Daher empfehlen wir die Abbildung der sublimierten Gewebe vor dieser Zeit oder Gewebe bei -80 ° C für längere Inkubationszeiten zu speichern. </li><li> Objektträger aus der Gefriertruhe (und Behälter) und in einem Exsikkator 5 - 10 min. </li></ol> 5. Imaging und Analyse <ol><li> Die Objektträger aus Exsikkator und gelten Instrument Standards Massengenauigkeit von MALDI Instrument während der Bildgebung zu gewährleisten. Die Art der Standards werden in Abhängigkeit von Instrumentierungs variieren. Standards sind in der Regel gleichmäßig über den gesamten Objektträger, das umgebende Gewebe abgebildet werden (3D) angewendet. </li><li> Legen Sie Abgleiten in MALDI Instrument und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers für die Bildgebung Experimente (Instrumentenverfahren für eine 1000 optimiert werden soll - 2000 Massenbereich). Repräsentative Ergebnis (Abbildung 4) wurde in Reflectron Negativ - Modus mit einer 70 &amp; mgr; m - Raster und 20 Schüsse / Spektrum (Erfassungszeit ~ 2 h) erworben. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Diese Arbeit Details eines standardisierten Protokolls von Matrix Sublimation auf das Gewebe für die Detektion von negativ geladenen Lipiden, wie Ganglioside, in MALDI IMS Experimenten. Probenvorbereitung für MALDI IMS ist sehr variabel und muss angepasst werden, um die einzigartigen Eigenschaften des Analyten von Interesse zu passen. Die Anwendung der Matrix auf die Gewebeprobenoberfläche ist ein wichtiger Aspekt des Probenherstellungsverfahrens im Hinblick auf die Qualität der Ergebnisse in IMS. Besondere Vorsicht ist...

Matrix-unterstützte Laser-Desorptions / Ionisations (MALDI) Imaging-Massenspektrometrie (IMS) entwickelt sich zu einem sehr begehrt Technik zur Visualisierung der räumlichen Verteilung von Lipiden, Peptiden und Proteinen in intakten Probenoberflächen. MALDI IMS wurde zuvor als analytische Technik für die vorgereinigten Analyten bekannt, aber in den letzten Jahren hat es sich in vielen anderen Disziplinen wegen der Fähigkeit, die Genauigkeit der Massenspektrometrie zu kombinieren mit einer hohen Auflösung optisch / anatomischer Referenzpunkte ohne das die Aufmerksamkeit müssen für jede externe Kennzeichnung. Da die wissenschaftliche Pool von Forschern diese Technik verwendet wird, weiter zu wachsen ist Bedarf an standardisierten, einfach zu folgen Protokolle erhöht in der Entwicklung und Optimierung von IMS Experimente zu unterstützen. Ganglioside, eine Gruppe von Membranlipiden sehr reichlich vorhanden in dem Zentralnervensystem, sind ideal für MALDI IMS Experimente wie ihre Lage in der Membran eingebettet ist, stellt sicher, speziES unmöglich mit konventionellen Immuno-Kennzeichnung zu erkennen. Darüber hinaus haben wir gezeigt, MALDI IMS verwenden, dass diese Lipide, die als Modulatoren von Zellsignalen funktionieren, unter anderem einzigartige anatomische Verteilungsmuster im gesunden Gehirn von Nagetieren, die 3 nach einer Hirnschädigung verändert, 4, 5. Ganglioside werden mit einer höheren Massenbereich im Vergleich zu den meisten Lipidspezies, und sind daher am meisten geeignet für die MALDI Bildgebungs Plattform befinden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55254/55254fig1.jpg" /> Abbildung 1: Workflow von MALDI IMS Experiment. Schematische Darstellung des allgemeinen Arbeitsablauf eines MALDI IMS Experiment unter Verwendung von Sublimation. Gewebe bei -80 ° C eingefroren ist in einem Kryostaten geschnitten und 10 &amp; mgr; m Abschnitte sind thaw auf leitfähigen ITO Objektträger aufgebracht. Der Objektträger wird dann in einem Exsikkator bis zur Sublimation platziert. slides in die Sublimation Vorrichtung eingeführt und eine gleichmäßige Schicht der Matrix ist auf der Gewebeprobenoberfläche aufgetragen. Die Proben werden über Nacht in einem -20 ° C Gefrierschrank eingefroren dann in einem Exsikkator für 10 Minuten gestellt. Sobald Normen angewandt wurden, werden die Proben in das MALDI Instrument eingeführt, wo ein Laser über das Gewebe gerichtet ist, verursacht desorbierten Moleküle in der Matrix zu ionisieren. Die Ionen wandern ein Flugrohr nach unten und getrennt auf der Grundlage ihrer Masse (time-of-flight / TOF), bis sie den Detektor erreichen. Die Informationen über die Ionenfluss von Analyten in einem vorbestimmten Masse-zu-Ladung (m / z) -Bereich wird sowohl als Molekularbild und Massenspektrum angezeigt. Diese Daten können verwendet werden, um sowohl zu visualisieren und die Ionenfluss des Analyten von Interesse innerhalb des abgebildeten Gewebes zu quantifizieren. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55254/55254fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55254/55254fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Probenvorbereitungfür MALDI IMS ist sehr variabel, da jeder Schritt des Verfahrens an den Analyten von Interesse angepasst werden müssen. Das bestimmende Merkmal der MALDI-basierten Experimenten ist die Verwendung einer Matrix-Beschichtung auf die Probenoberfläche vor der Analyse abgeschieden. Zusätzlich zu der Rolle zu absorbieren und Strahlungsenergie von dem Laser während des Ablationsprozesses zu übertragen, dient die Matrix auch verschiedene Analyten aus der Probe zu isolieren, wodurch die Analyse der Verbindungen von Interesse zu erleichtern 6, 7. Homogenes Aufbringen der Matrix auf die Probenoberfläche ist der wichtigste Schritt bei der Probenvorbereitung. Eine falsche Matrix Abscheidung kann zu großen heterogenen Matrix Kristallformationen führen und die Entwicklung von Artefakten, niedrige Ionensignal und schlechte Reproduzierbarkeit 7. Aufgrund der Affinität bestimmter Matrices spezifischen Analyten zu isolieren, kann die Art der Matrix für ein Experiment ausgewähltdeutlich das Ergebnis zu verändern. Die Matrizen verwendet für die Bildgebung von Proteinen und Peptiden unterscheiden sich oft von denen, für die Bildgebung verwendeten Lipide und das Verfahren wird weiter durch die Notwendigkeit für zusätzliche Verfahren, wie Waschen und Rehydratation Schritte, um kompliziert erfolgreich Signale von Gewebe erkennen. Obwohl Waschschritte zur Verbesserung der Lipidsignale existieren 8, sind sie keine Voraussetzung für die Detektion der meisten Lipidspezies. Wenn eine Matrix für eine Lipidbildgebungsexperiment auswählt, ist es wichtig, dass die Polarität des Lipids von Interesse, da dies zu prüfen, wird der Bereich von geeigneten Matrizen renzen. Enthalten beispielsweise Ganglioside Sialinsäurereste, die sie insgesamt eine negative Polarität geben. Es gibt eine Reihe von Matrizen, die effektiv zu desorbieren und zu ionisieren Ganglioside aus Gewebe; jedoch Faktoren wie Matrix abgeleiteten Peaks im Spektrum und Stabilität der Matrix unter Vakuum muß in Betracht gezogen werden. 1,5-Diaminonaphthalin (DAN) Matrix ist ausreichend stabil , um unter Vakuumbedingungen Instrument für die meisten Abbildungsanwendungen und hat einen hohen Grad an Empfindlichkeit für Lipid Desorption gezeigt und kann sowohl in 2 positive und negative Ionenarten für die Analyse von Lipiden verwendet werden. DAN Matrix, wenn im Vergleich zu anderen negativen Lipid Affinitätsmatrizen wie Dihydroxybenzoesäure (DHB), 9-Aminoacridin (9-AA) und 5-Chloro-2-Mercaptobenzothiazol (CMBT), konnte am effizientesten Gangliosiden aus Rattenhirn desorbieren Gewebe im negativen Ionenmodus (Manuskript in Vorbereitung). die entsprechende Methode der Matrixablagerung Auswahl von gleicher Bedeutung ist selbst die Matrix zu wählen. Nassmatrixabscheidungsverfahren, wobei die feste Matrix in einem organischen Lösungsmittel gelöst wird, und durch pneumatische oder automatisierten Sprüher oder spotters abgeschieden sind besonders wirksam für die Desorption von Proteinen und Peptiden als die Flüssigkeit die Probe für zusätzliche zuzulassen permeiertction von Verbindungen und Co-Kristallisation mit der Matrix. Obwohl diese Techniken auch für die Lipid - Anwendungen verwendet werden kann, Analyt Delokalisierung und ungleichmäßige Matrix Kristallformationen sind häufige Vorkommen aufgrund der hohen Menge und Löslichkeit von Lipiden in Lösungsmitteln, insbesondere in Gewebe 2, 9. Weil Lipiden leicht aus Gewebe ionisiert werden, trockene Matrix Abscheidungstechniken, wie Sublimation, bieten eine einfache, kostengünstige Alternative zu Sprüher während viele der Nachteil dieser Techniken zu umgehen. Der Erfolg der Sublimierung in MALDI IMS Experimente auf Merkmale wie mikrokristalline Matrix Morphologie zugeschrieben , die für Matrix-Analyt - Bindung, erhöhte Matrix Reinheit der Oberfläche erhöht, und homogene Matrix Ablagerung zu einer erhöhten Reproduzierbarkeit im Vergleich zu nassen Matrixtechniken , 1, 10. Sublimation invoLves eine pulverisierte Matrix unter Vakuum unmittelbar unterhalb einer gekühlten Probenoberfläche Heizgas-Phasenübergang des pulverförmigen Matrix, gefolgt von der Abscheidung auf die Gewebeprobenoberfläche in Feststoff zu ergeben. Während der Sublimation, können Matrixablagerung durch Variieren Faktoren wie Zeit, Temperatur und Druck zu liefern hoch reproduzierbare Ergebnisse gesteuert werden. Ein einzelnes Sublimation Experiment kann überall nehmen von 5 bis 20 min in Abhängigkeit von der Art der Matrix ausgewählt wird, die mehrmals vor der Entsorgung wieder eingesetzt werden können. Die Vorrichtung kann zu einem Bruchteil des Preises von automatischen Sprüher im Handel erworben werden und ist leicht auseinander zur Reinigung und Wartung entnommen. Die niedrigen Kosten und die relative Einfachheit dieser Matrix-Abscheidungstechnik machen es für die Forscher ideale Beginn oder die Erweiterung auf Lipid-Imaging-Anwendungen in MALDI IMS. Auch wenn die Informations Protokolle für die Sublimation von Geweben für IMS haben Detaillierung 11 berichtet worden, einige standardisierte Protokolle existieren which konzentrieren sich auf die Basis-Workflow beteiligt mit einer Sublimation Experiment Durchführung für die Bildgebung mit hoher Masse Lipide im Negativ-Ionen-Modus, so dass es schwierig ist, die Technik ohne aufwendige Versuch und Irrtum zu etablieren. Im Folgenden ist ein experimentelles Protokoll, diese Lücke für die Sublimation von DAN Matrix auf Rattenhirnschnitten für hochauflösende Bildgebung und Detektion von Gangliosiden zu füllen Ziel. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55254/55254fig2.jpg" /> Abbildung 2: -Sublimationsapparatur. Fotografie (A) und schematische Darstellung (B) der -Sublimationsapparatur. Die Vakuumpumpe wird durch Gummischlauch in eine Kühlfalle, gefüllt mit 300 ml Ethanol verbunden. Die Kühlfalle wird dann durch Gummischlauch zur Sublimation Vorrichtung verbunden. Die Vorrichtung besteht aus zwei separaten Teilen von Glaswaren, die zusammen mit einem Metall-U-joint abgedichtet sind. Die obere Hälfte des Sublimatorschiffchenenthält den Kondensator, der mit Eisbrei gefüllt ist. Die Probenplatte wird auf den Boden des Kondensators abgeklebt, im Inneren des abgedichteten Glasapparatur. Die untere Hälfte der -Sublimationsapparatur enthält die DAN-Matrix gleichmäßig verteilt die Probenplatte gegenüber. Während der Sublimation wird die Glasapparatur auf einem Sandbad mit einer heißen Platte erhitzt auf 140 ° C gebracht direkt darunter. Der Temperaturfühler trägt, durch Rückkopplung des Sandbad Temperatur im Vergleich zu der voreingestellten Temperatur für das Experiment eine stabile Temperatur während der Sublimation Experiments aufrechtzuerhalten. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55254/55254fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55254/55254fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

<table><tbody><tr><td>Sublimator</td><td>Chemglass Life Sciences</td><td>CG3038-01</td><td></td></tr><tr><td>1,5-Diaminonapthalin (DAN) Matrix</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D21200&nbsp;</td><td>ca. 100 g</td></tr><tr><td>Kryostat</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td></td><td>CryoStar NX50</td></tr><tr><td>Heizplatte mit Temperaturrückmeldung</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>HP88857290</td><td>Isotemp ADVD 7x7 HP 100 - 120 V</td></tr><tr><td>Edelstahl Wagenheber</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>2216479</td><td>10x10</td></tr><tr><td>Kühlfalle</td><td></td><td></td><td>Sonderanfertigung</td></tr><tr><td>Vakuumpumpe</td><td>Franklin Electric</td><td>1102180403</td><td>Savant VP100 Zweistufige</td></tr><tr><td>Indium-Zinnoxid (ITO) Objektträger</td><td>Hudson Surface Technology</td><td>PSI 1111000</td><td>Typ II, je 1,1 mm/25</td></tr><tr><td>MALDI TOF/TOF 5800 Instrument</td><td>AB Sciex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Exsikkator</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2797</td><td>Tisch-Exsikkator</td></tr></tbody></table>

sublimation von dan matrix für die erkennung und visualisierung von gangliosiden in rattenhirngewebe für die maldi-imaging-massenspektrometrie

Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

Probenvorbereitung ist der Schlüssel für eine optimale Detektion und Visualisierung von Analyten in Matrix-unterstützte Laser-Desorption / Ionisation (MALDI) Imaging-Massenspektrometrie (IMS) Experimenten. Bestimmen des geeigneten Protokolls während der Probenvorbereitungsprozess folgen kann schwierig sein, da jede Stufe optimiert werden, müssen mit den einzigartigen Eigenschaften der Analyten von Interesse entsprechen. Dieser Prozess beinhaltet nicht nur eine kompatible Matrix zu finden, die die Moleküle von Interesse effizient desorbieren und ionisieren kann, sondern auch die entsprechende Matrix Abscheidungstechnik ausgewählt wird. Beispielsweise eine nasse Matrix Abscheidungstechnik, die eine Matrix in einem Lösungsmittel aufgelöst ist, beinhaltet, superior zur Desorption der meisten Proteine ​​und Peptide, während trockene Matrix Abscheidungstechniken besonders wirksam sind für die Ionisation von Lipiden. Sublimation hat sich als hocheffizientes Verfahren zur Trockenmatrixablagerung zum Nachweis von Lipiden in Gewebe durch MALDI IMS aufgrund der homogenei berichtetty der Matrix Kristallablagerung und minimale Analyten Delokalisierung im Vergleich zu vielen Nassabscheidungsverfahren 1, 2. Im weitesten Sinne handelt es mit den Proben gegen eine kalte Oberfläche gepresst in einer vakuumdichten Kammer, die eine Probe und pulverisierten Matrix platzieren. Die Vorrichtung wird dann in ein erwärmtes Bad (Sand oder Öl) gesenkt, was zu Sublimation des pulverförmigen Matrix auf der Probenoberfläche gekühlt Gewebe. Hier beschreiben wir ein Sublimations-Protokoll 1,5-Diaminonaphthalin (DAN) -Matrix für die Detektion und Darstellung von Gangliosiden in dem Rattenhirn unter Verwendung von MALDI IMS.

Nach Beendigung der Sublimation Experiment wurden die beiden Hälften der Glasapparatur sind in der Abzugshaube und dem Schieber getrennt ist , zu dem Kondensator abgeklebt, kann (3A) entfernt werden. An dieser Stelle sollte der Schieber für unebene Matrix Verteilung und die Zeit, die Temperatur oder die Platzierung der Vorrichtung in dem Sandbad untersucht werden kann für die nächste Folie angepasst werden. Eine erfolgreiche DAN Sublimation Experiment in eine gleichmäßig...

Ein Protokoll für die Sublimation der DAN-Matrix auf Rattenhirngewebe zum Nachweis von Gangliosiden mittels MALDI Imaging Massenspektrometrie wird vorgestellt.

Sublimation von DAN Matrix für die Erkennung und Visualisierung von Gangliosiden in Rattenhirngewebe für die MALDI-Imaging-Massenspektrometrie

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass ...

Das übergeordnete Ziel dieses Sublimationsprotokolls besteht darin, einen detaillierten und leicht nachvollziehbaren Prozess zur Probenvorbereitung für die Detektion von Gangliosiden in MALDI-Bildgebungs-Massenspektrometrie-Experimenten bereitzustellen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Neurobiologie zu beantworten, darunter die anatomische Verteilung und Funktion von Gangliosiden sowohl im gesunden Gehirn als auch bei Gehirnerkrankungen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie für die hochwertige Abbildung vieler Lipidarten mit nur geringen Modifikationen des Protokolls angepasst werden kann.Um dieses Verfahren zu beginnen, entnehmen Sie das Gehirngewebe aus der Ratte und bereiten Sie es gemäß dem schriftlichen Protokoll für den Kryostaten vor. Danach positionieren Sie das Gewebe im Kryostaten und schneiden es bis zur gewünschten anatomischen Stelle. Stellen Sie sicher, dass die Schneiddicke zwischen acht und 12 Mikrometern liegt. Schneiden Sie den flachgelegten Gewebeschnitt mithilfe der Anti-Roll-Stange des Kryostaten langsam ab. Löcher oder Markierungen im Gewebe können auftreten, wenn die Position der Rollstange nicht korrekt ist oder wenn die Klinge stumpf ist.Bewegen Sie das Gewebe mit sauberen Pinseln in die Mitte der Schneideplattform. Zum Abbilden des Gewebes leitfähige Objektträger oder Metallplatten einfrieren, indem sie während des Schneidens in den Kryostaten gelegt werden. Wenn der Objektträger vollständig eingefroren ist, das Gewebeschnittpräparat vorsichtig mit sauberen Pinseln auf die leitfähige Oberfläche des Objektträgers bringen.Sobald alle Gewebeschnitte korrekt auf dem Objektträger positioniert sind, legen Sie einen Finger unter den Objektträger gegenüber dem Gewebe und drücken Sie, bis der Schnitt aufgetaut ist. Anschließend stellen Sie die Objektträger mit dem Gewebe für fünf bis zehn Minuten in einen Trockenschrank. Alternativ verwenden Sie einen warmen Objektträger und drücken ihn leicht, leitfähige Seite nach unten, gegen die abgeflachten Gewebeschnitte.Arbeiten Sie im Abzug und stellen Sie ein Sandbad in einen Aluminiumbehälter auf einen Heizblock. Der Heizblock sollte auf einem Metallscherenlift mit der geeigneten Oberfläche stehen. Schalten Sie den Heizblock ein und stellen Sie die Temperatur auf 140 Grad Celsius ein.Verwenden Sie die Temperatur-Rückkopplungssonde, um die Temperatur des Sandes während des gesamten Experiments zu überwachen und eine Temperaturkonstanz sicherzustellen. Danach geben Sie 300 Milligramm DAN-Matrix auf die untere Fläche der Sublimationsapparatur. Verteilen Sie die Matrix in einer gleichmäßigen Schicht in der Mitte der Apparatur über die ungefähre Breite und Länge des zu sublimierenden Objektträgers.Platzieren Sie eine Metallplatte auf der inneren Oberfläche des Apparats, sodass die Platte direkt mit dem Boden des Kondensators in Kontakt steht. Befestigen Sie einen leeren Testobjektträger diagonal über die Oberfläche der Metallplatte, wobei das Klebeband an den äußeren Kanten des Objektträgers angebracht wird. Verbinden Sie den oberen und unteren Teil des Apparats mit einem gummierten O-Ring in der Mitte, um eine vollständige Abdichtung sicherzustellen.Platzieren Sie ein metallenes U-Gelenk um die Mitte der Apparatur und ziehen Sie die Schraubstöcke fest, bis die obere und untere Hälfte der Apparatur fest miteinander verbunden sind. Stellen Sie anschließend die Apparatur in den metallenen O-Ring über dem Sandbad. Geben Sie danach eine Handvoll zerstoßenen Eis in den Kühler.Füllen Sie den Kühler zu einem Viertel bis zur Hälfte mit kaltem Wasser, um eine Eisschlamm-Mischung zu erzeugen. Die Eisschlamm-Mischung kühlt die Metallplatte auf der Innenseite der Apparatur und dadurch auch den darauf befestigten Objektträger. Warten Sie mindestens fünf Minuten, bis die Temperatur einen stabilen Zustand erreicht hat.Danach 300 mL Methanol in den Kältefallebehälter geben und die Glasware in den Behälter stellen. Die Vakuumpumpe mit dem Ausgang der Kältefalle über einen Gummischlauch verbinden. Einen weiteren Gummischlauch verwenden, um den Eingang der Kältefalle mit der Sublimationsapparatur zu verbinden.Stellen Sie sicher, dass der Schlauch mit Metallklemmen fest befestigt ist. Verwenden Sie die Vakuumpumpe, um ein Vakuum von 30 bis 50 Millitorr zu erzeugen. Lassen Sie die Pumpen mindestens fünf Minuten lang laufen, damit sich der Druck ausgleichen kann.Legen Sie zwei bis drei kleine Stücke Trockeneis in den Ethanol am Boden des Kältefalleimers. Die Kältefalle verhindert, dass Matrixpartikel sich in der Vakuumpumpe ansammeln. Die Schraubklemmen am U-Ring der Sublimationsapparatur müssen möglicherweise nach dem Einschalten der Vakuumpumpe nachgezogen werden, da der Druck in der Apparatur abnimmt.Stellen Sie sicher, dass die Temperatur des Sandbades bei 140 Grad Celsius stabilisiert ist. Überprüfen Sie außerdem, ob das Vakuum eingeschaltet ist und ob die Apparatur mit angeschlossenem Schlauchsystem in dem metallischen O-Ring oberhalb des Sandbades befestigt ist. Stellen Sie den Timer auf sieben Minuten, starten Sie ihn jedoch noch nicht.Heben Sie die Scherenhebebühne und den Sandbad langsam bis zur Sublimationsapparatur an, bis das U-Gelenk des Sublimators deutlich über dem metallischen O-Ring liegt. Dieser zusätzliche Freiraum ermöglicht eine Justierung der Apparatur auf dem Sand. Drücken Sie den Sublimator kurz und vorsichtig auf die Sandoberfläche, um sicherzustellen, dass die Apparatur gleichmäßig auf dem Sand steht.Starten Sie dann sofort die Stoppuhr. Wenn der Timer ertönt, schalten Sie die Vakuumpumpe aus und senken vorsichtig den Scherenheber, bis der Sublimator die Sandbadheizung nicht mehr berührt und sicher im Metall-O-Ring steht. Öffnen Sie langsam das Mikroventil, um den Druck im Apparat abzulassen.Lösen Sie die Metallklemme um den Gummischlauch der Sublimationsapparatur und beginnen Sie langsam, den Schlauch zu lockern. Sobald der Gummischlauch leicht gelockert ist, biegen Sie den Schlauch zur Seite, um einem Restdruck das Entweichen zu ermöglichen. Wenn der Umgebungsdruck wiederhergestellt ist, nehmen Sie den Gummischlauch vorsichtig von der Sublimationsapparatur ab.Als Nächstes lösen Sie die Schraubbacken am Gelenk des Apparats und entfernen Sie diese. Trennen Sie vorsichtig die beiden Hälften der Sublimationsapparatur und ziehen Sie den Objektträger von der Oberseite des inneren Glasgeräts ab. Untersuchen Sie den Objektträger, um eine gleichmäßige Matrixverteilung zu bestätigen.Wenn die Verteilung und Menge des sublimierten Matrixmaterials ausreicht, befestigen Sie einen neuen Objektträger mit Gewebe mit Klebeband an der Innenseite des Sublimators und wiederholen Sie den Sublimationsprozess. Fahren Sie mit der Bildgebung und Analyse wie im Textprotokoll beschrieben fort. Das Massenspektrum zeigt die ionische Abundanz von Anolyten im Massenbereich von 1000 bis 2000 an.Die wichtigsten Ganglioside der A-Serie sind entlang des Spektrums gekennzeichnet. Dargestellt ist hier das entsprechende molekulare Bild der Ganglioside im Rattenhirn. Das molekulare Bild zeigt die anatomische Verteilung mehrerer Gangliosid-Spezies mittels Farbkodierung, die überlagert und pseudokoloriert wurden, unter Verwendung der ImageJ-Software.Im Allgemeinen können Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da es viele Variablen im Prozess der Probenvorbereitung gibt, die die Qualität der IMS-Ergebnisse beeinflussen können und die oft in berichteten Protokollen nicht erwähnt werden. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, die Menge an sublimierter Matrix nach jedem Experiment zu überwachen und die Sublimationsdauer entsprechend für den Objektträger anzupassen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern den Weg, um die Rolle von Membranlipiden wie Gangliosiden nach Gehirnverletzungen, bei Ner-Jone-Krankheit und beim natürlichen Alterungsprozess zu untersuchen.Obwohl diese Methode Einblicke in die Häufigkeit und anatomische Verteilung von Lipiden im Gehirn ermöglichen kann, ist sie auch auf andere Systeme anwendbar, einschließlich Gewebe außerhalb des Gehirns sowie pflanzliche und Insektenmodelle. Das Arbeiten mit beschädigten Wurzeln kann äußerst gefährlich sein, und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen, Masken und Augenschutz sollten stets beachtet werden, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.

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Forschung

JoVE Journal

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Neurowissenschaften

Dopamin-Substitutionstherapie Pharmakotherapie mit L-DOPA ist das am häufigsten verwendete symptomatischen Behandlung der Parkinson-Krankheit, sondern wird durch Nebenwirkungen einschließlich der zwangsweisen abnormen Bewegungen, bezeichnet Dyskinesie...

MALDI-Imaging-Massenspektrometrie von Neuropeptiden bei Parkinsonpatienten

Eine spezifische und sensitive Methode, um Einblick in die Expression von Glykosphingolipid Antigene Immunsystem Organe und Zellen zu gewinnen beschrieben. Das Verfahren nutzt die Ionenfallenmassenspektrometer ermöglicht stufenweise Fragmentierung Glycosphingolipid Moleküle zur Strukturanalyse gegenüber chemisch synthetisierten Standard.

Massenspektrometrische Analyse Glycosphingolipid Antigene

Dithranol (DT, 1,8-Dihydroxy-9 ,10-dihydroanthracen-9-on) wurde zuvor als ein MALDI-Matrix für die Gewebeabbildung für kleine Moleküle berichtet wurde, Protokolle für die Verwendung von DT für die MALDI-Imaging von endogenen Lipiden auf die Hier werden Oberflächen von Gewebeschnitten von Positiv-Ionen-MALDI-MS auf einem ultrahochauflösenden Quadrupol-FTICR Instrument zur Verfügung gestellt.

Dithranol als Matrix für Matrix Assisted Laser Desorption / Ionisation Imaging auf einem Fourier-Transformations-Ionen-Zyklotron-Resonanz-Massenspektrometer

Eine massenspektrometrische Bildgebungsquelle (MSI), die bei Atmosphärendruck betrieben wird, wurde durch Kopplung von Laserdesorption im mittleren Infrarot und Elektrospray-Nachionisation entwickelt. Als energieabsorbierende Matrix wurde eine exogene Eismatrix verwendet, um die resonante Desorption von gewebebezogenem Material zu erleichtern. Dieses Manuskript enthält ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Durchführung der IR-MALDESI MSI bei einer Ganzkörper-Neugeborenenmaus.

Ganzkörper-Massenspektrometrie Imaging durch Infrarot-Matrix-assistierte Laser-Desorptions-Elektrospray-Ionisations (IR-MALDESI)

Molekularer Bildgebung mit der Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung-basierte bildgebende Massenspektrometrie (MALDI-IMS) erlaubt die gleichzeitige Zuordnung von mehreren Analyten in biologischen Proben. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Erfassung und Visualisierung von Amyloid β Protein Hirngewebe von Alzheimer-Krankheit und zerebralen Amyloid-Angiopathie Proben mit MALDI-IMS.

Visualisierung von Amyloid-β-Einlagen in das menschliche Gehirn mit Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung bildgebende Massenspektrometrie

Das Ziel dieses Protokolls ist es, detaillierte Anleitungen zur Probenvorbereitung bei der Planung von Experimenten mit MALDI MSI zur Maximierung des metabolischen und molekularen Nachweises in biologischen Proben bereitzustellen.

Probenvorbereitung für metabolisches Profiling mittels MALDI-Massenspektrometrie-Bildgebung

Ganglioside sind Sialinsäure-tragende Glykosphingolipide, die im Gehirn besonders häufig vorkommen. Ihre amphipathische Natur erfordert organische/wässrige Extraktions- und Reinigungstechniken, um eine optimale Erholung und genaue Analysen zu gewährleisten. Dieser Artikel bietet einen Überblick über die analytische und präparative Gangliosidextraktion, -reinigung und -chromatographie-Analyse.

Gangliosidextraktion, -reinigung und -profilierung

Für die massenspektrometrische Bildgebung (MSI) von Hirnorganoiden wurde eine fortschrittliche Methode entwickelt, die es ermöglicht, die Metabolitenverteilungen innerhalb dieser Modelle abzubilden. Diese Technologie bietet Einblicke in die Stoffwechselwege und Metabolitensignaturen des Gehirns während der frühen Entwicklung und bei Krankheiten und verspricht ein tieferes Verständnis der menschlichen Gehirnfunktion.

Molekulare Bildgebung von Organoiden des menschlichen Gehirns mittels Massenspektrometrie 

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von microMS für die fluoreszenzgesteuerte Einzelzell-MALDI-2-Massenspektrometrie, die ein verbessertes molekulares Profiling von primären neuronalen Zellen der Ratte ermöglicht.

Fluoreszenzgesteuerte matrixgestützte Laserdesorption/Ionisation mit laserinduzierter Postionisations-Massenspektrometrie einzelner Nervenzellen von Ratten

Dieses Protokoll beschreibt die wichtigsten Schritte, um eine rigorose und reproduzierbare Messung sowohl von Glykogen- als auch von N-gebundenen Glykanen mittels Massenspektrometrie-Bildgebung zu ermöglichen.

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Erfahren Sie die Sublimation von DAN-Matrix zur Detektion und Visualisierung von Gangliosiden in Rattenhirngewebe mittels MALDI-Imaging-Massenspektrometrie. Diese Methode ermöglicht hochwertige Lipidbildgebung.

Sublimation von DAN Matrix für die Erkennung und Visualisierung von Gangliosiden in Rattenhirngewebe für die MALDI-Imaging-Massenspektrometrie (Video) | JoVE Journal

Sublimation von DAN Matrix für die Erkennung und Visualisierung von Gangliosiden in Rattenhirngewebe für die MALDI-Imaging-Massenspektrometrie

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