Fluoreszenzgesteuerte matrixgestützte Laserdesorption/Ionisation mit laserinduzierter Postionisations-Massenspektrometrie einzelner Nervenzellen von Ratten

Unsere Forschung konzentriert sich auf die Entwicklung von bildgesteuerten, einzelzelligen MALDI-Massenspektrometrie-Workflows mit hohem Durchsatz, um zelluläre Heterogenität aufzudecken und die molekularen Profile mit der Zellidentität, -funktion und -reaktion in komplexen Systemen zu verknüpfen.

Fortschrittliche Instrumente wie MALDI-2 und Massenspektrometer mit hoher räumlicher Auflösung ermöglichen eine gezielte, ortsaufgelöste Analyse einzelner Zellen, erhöhen die Empfindlichkeit und erweitern den Umfang der molekularen Profilerstellung in komplexen Geweben. Zu den aktuellen Herausforderungen gehören die eingeschränkte Sensitivität, die Reproduzierbarkeit über Proben hinweg und die komplexe Datenanalyse. MALDI-Daten sind oft spärlich und große Datensätze mit Tausenden von Zellen und Hunderten von Molekülen erfordern robuste Rechenwerkzeuge.

Dieses Protokoll schließt die Lücke in Hochdurchsatzmethoden zur Analyse einzelner Zellen und sogar Organellen und ermöglicht sehr detaillierte Untersuchungen der Heterogenität und gewinnt Einblicke in die Molekular- und Zellbiologie und -funktion.

Dieses Protokoll ermöglicht eine schnelle, gezielte Analyse von Zellen, die über den Objektträger verstreut sind, wodurch die Notwendigkeit einer Zellmanipulation oder eines vollflächigen Scannens entfällt und der Durchsatz erheblich erhöht wird.

[Erzähler] Spülen Sie zunächst jeden Objektträger mit zwei bis drei Millilitern 150 Millimolar Ammoniumacetat aus, um Glycerin- und Salzkristalle zu entfernen, die die Mikroskopie und das Auftragen der MALDI-Matrix beeinträchtigen können, und trocknen Sie die Objektträger dann unter einem sanften Stickstoffstrahl oder lassen Sie sie vollständig an der Luft trocknen. Legen Sie den getrockneten Objektträger in den Mikroskoptisch. Fokussieren Sie das Mikroskop mit mindestens 10 Stützpunkten, die gleichmäßig über den gesamten Objektträger verteilt sind. Mit Filtern, die für DAPI und Hellfeld-Bildgebung geeignet sind, können Sie ein gekacheltes Fluoreszenzbild des gesamten Objektträgers mit 5- bis 10-facher Vergrößerung aufnehmen, um sicherzustellen, dass die Passermarken auf den Objektträgern eindeutig im Bild erfasst werden. Fügen Sie die gekachelten Bilder mit einer Mikroskopiesoftware wie ZEN ZEISS zusammen. Stellen Sie sicher, dass die vertikal angrenzenden Kacheln nicht versetzt sind. Verarbeiten und exportieren Sie jedes zusammengefügte Bild als BigTIFF-Datei mit der Mikroskopie-Software oder als Standard-TIFF, wenn die endgültige Bildgröße weniger als zwei Gigabyte beträgt. Lösen Sie 20 Milligramm 2,5-Dihydroxyacetophenon in 1,5 Millilitern Aceton. Legen Sie die Objektträger in den Halter der Sublimationskammer und setzen Sie dann den Halter in das Sublimationsgerät ein. Pipettieren Sie die gelöste Matrixlösung auf den Keramikwafer und lassen Sie das Aceton vollständig verdampfen, dann schließen Sie die Sublimationskammer, um sie zu verschließen. Füllen Sie die Kühlmittelkammer mit einem Eiswasser-Slush und platzieren Sie diesen sicher auf der Sublimationskammer. Schalten Sie die Vakuumpumpe ein und lassen Sie das System fünf Minuten lang äquilibrieren. Beginnen Sie die Sublimation, indem Sie die Kammer fünf Minuten lang auf 200 Grad Celsius erhitzen. Nehmen Sie nach fünf Minuten das Eiswasserbad aus der Kammer. Drehen Sie die Temperatur auf 25 Grad Celsius und platzieren Sie einen Kühlkörper auf der Oberseite der Kammer. Entlüften Sie die Sublimationskammer langsam, um den Druck abzulassen. Öffnen Sie die Kammer und entfernen Sie vorsichtig die Objektträger. Öffnen Sie MicroMS und dezimieren Sie die BigTIFF-Mikroskopiebilder mit der Bildgruppenoption, um sowohl Hellfeld- als auch Fluoreszenzkanäle aufzunehmen. Navigieren Sie zum Tool Bloboptionen, und passen Sie die maximale und minimale Blobgröße an, um den akzeptablen Blobgrößenbereich zu definieren. Legen Sie den Schwellenwert des Fluoreszenzkanals für die Blob-Erkennung fest. Geben Sie den Wert für die Zirkularität an, um zu definieren, wie kreisförmig die identifizierten Zellen sein müssen, um berücksichtigt zu werden, und wählen Sie die Farbe aus. Verwenden Sie die Option Blob Suchen, um Blobs zu erkennen. Wenn Sie dazu aufgefordert werden, speichern Sie die Blobliste unter einem gewünschten Namen. Verwenden Sie das Werkzeug Entfernungsfilter, um den Mindestabstand zwischen den einzelnen Zellen festzulegen. Testen Sie den Fehler über Testpunkte, um den Offset-Fehler genau zu bestimmen. Legen Sie die Objektträger mit dem MTP Slide Adapter II in das Gerät ein. Nachdem Sie mit MicroMS an den Computer zurückgekehrt sind, greifen Sie über eine Remote-Desktop-Anwendung auf den Massenspektrometer-Computer zu. Wenn Sie das Instrument zum ersten Mal verwenden, überprüfen Sie seine Position, indem Sie zu Tools und dann zu den Instrumenteneinstellungen navigieren. Zeigen Sie im Popup-Fenster die Koordinaten mit ihren X- und Y-Positionen an, und wählen Sie jeden dieser spezifischen Punkte auf der Schiebeadapter-II-Geometrie aus. Aktualisieren Sie die X- und Y-Positionen im MicroMS-Fenster. Navigieren Sie mit der Kamera und den Tischsteuerungen des Massenspektrometers zu einer leicht identifizierbaren Stelle auf dem Objektträger und kopieren Sie die Koordinaten des Geräts. Suchen Sie in MicroMS die gleiche Position im Mikroskopbild, klicken Sie mit der rechten Maustaste und geben Sie die Koordinaten in das Popup-Fenster ein. Runden Sie die Koordinaten auf die nächsten ganzen Zahlen und trennen Sie sie durch ein Leerzeichen. Nachdem drei Registrierungspunkte hinzugefügt wurden, färbt sich einer der Kreise rot, was darauf hinweist, dass er die am weitesten von der Registrierung abweichende Position ist. Löschen Sie den Registrierungspunkt mit Strg + Rechtsklick, und versuchen Sie es erneut. Wechseln Sie unter Datei zu Speichern und dann zu Registrierung, um die Registrierungsdatei zu speichern. Wenn die Blobs auf der Folie sichtbar sind, gehen Sie zu Datei, Speichern und dann zu Instrumentenpositionen, um die Instrumentenpositionsdatei zu speichern, und übertragen Sie diese Datei dann mit der Remote-Desktop-Software auf den Instrumentencomputer. Öffnen Sie die benutzerdefinierte XEO-Datei und kopieren Sie den Inhalt in den MTP Slide Adapter II . XEO-Datei auf dem Gerätecomputer. Speichern Sie die Datei, um diese Geometriedatei mit den Positionen der Zellen zu aktualisieren. Klicken Sie auf die Registerkarte Automatisierung und wählen Sie Neu, um einen neuen automatischen Lauf zu erstellen. Ziehen Sie über den angezeigten Probenbereich, um die Zellen auszuwählen, und klicken Sie mit der rechten Maustaste, um sie der Analyseliste hinzuzufügen. Speichern Sie den automatischen Lauf und klicken Sie auf Automatischen Lauf starten, um mit der Erfassung zu beginnen. Diese Abbildung zeigt, wie die Einzelzell-MALDI-2-Massenspektrometrie eine lipidbasierte zelluläre Heterogenität in und innerhalb verschiedener Hirnregionen aufdeckt. Bei der UMAP-Analyse (Uniform Manifold Approximation and Projection) wurden die Zellen nach Hirnregionen getrennt und unterschiedliche Cluster für Striatum, Hippocampus und Kortex gebildet. Das Clustering in Leiden offenbarte vier lipidbasierte Zellsubpopulationen. Zusätzlich wurden clusterspezifische Lipidsignaturen mit unterschiedlichen Intensitätsprofilen über annotierte Lipide hinweg beobachtet. Massenspektren von sechs kortikalen Zellen zeigten ebenfalls eine konsistente Lipiddetektion über Objektträger hinweg. Darüber hinaus zeigten kortikale Zellen aus verschiedenen Objektträgern überlappende UMAP-Verteilungen, was auf minimale Batch-Effekte hindeutet.