Zuordnung von RNA-RNA-Wechselwirkungen unter Verwendung von biotinyliertem Psoralen

Das übergeordnete Ziel dieses Videos ist es, die Methode zur Sequenzierung von psoralen-vernetzten, ligierten und selektierten Hybriden oder SPLASH zu beschreiben, bei der paarweise in vivo RNA-RNA-Wechselwirkungen genomweit abgebildet werden. Bei dieser Technik handelt es sich um eine einfache Hochdurchsatzmethode zur Kartierung der RNA-Interaktion in vivo. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der RNA-Genomik zu beantworten, z. B. wie verschiedene Regionen entlang eines einzelnen RNA-Strangs oder zwischen verschiedenen RNA-Strängen miteinander interagieren.

Obwohl diese Methode Einblicke in Hefe- und menschliche Zellen liefern kann, kann sie auch auf Studien an anderen modernen Organismen angewendet werden, einschließlich Bakterien und Membranen in Zellen. Die Idee zu dieser Methode hatten wir erst, als wir eine Möglichkeit finden wollten, Wechselwirkungen molekular abzubilden. Beachten Sie, dass das folgende Verfahren mehrere Endpunkte enthält.

Zu diesen Zeiten kann das Experiment kurz oder auf unbestimmte Zeit pausiert werden. Details finden Sie im Begleittext. Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie HeLa-Zellen zweimal mit fünf Millilitern PBS waschen.

Stellen Sie die Schüssel eine Minute lang senkrecht auf, um überschüssiges PBS vollständig abtropfen zu lassen. Fügen Sie als nächstes einen Milliliter PBS hinzu, das 200 mikromolare biotinylierte Psoralen und 0,01 % Digitonin enthält, was die Zellpermeabilität erhöht. Achten Sie darauf, dass die Lösung gleichmäßig auf die Oberfläche der Zellen aufgetragen wird.

Inkubieren Sie fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Nehmen Sie nach der Inkubation den Deckel der Schale ab und legen Sie sie auf Eis in einen UV-Vernetzer, der drei Zentimeter von der UV-Lampe entfernt ist. Bestrahlen Sie 20 Minuten lang mit 365 Nanometer UV.

Nach 20 Minuten nehmen Sie die Schale aus dem Vernetzer und isolieren Sie dann das Fragment und fällen Sie die RNA aus HeLa-Zellen gemäß den Anweisungen im Begleitdokument. Laden Sie denaturierte Leiter- und RNA-Proben auf ein 8,6 Zentimeter großes, 6%iges TBE-Harnstoff-Gel. Die Zerkleinerung erfolgt durch Elektrophorese bei 180 Volt für 40 Minuten.

Färben Sie das Gel in 10 Millilitern FSME-Puffer mit einer Verdünnung von 1:10 000 Nukleinsäuregelfärbung fünf Minuten lang im Dunkeln. Während das Gel Flecken bildet, verwenden Sie eine 24-Gauge-Nadel, um ein sauberes 0,6-Milliliter-Mikrofuge-Röhrchen am Boden zu punktieren. Geben Sie es in ein zwei Milliliter Mikrofuge-Röhrchen.

Visualisieren Sie mit einem Transilluminator die Banden auf dem nachgefärbten Gel und schneiden Sie eine Gelscheibe, die 90 bis 110 Nukleotiden entspricht. Übertragen Sie die Gelscheibe in das punktierte 0,6 Milliliter Mikrofugenröhrchen in das zwei Milliliter Mikrofugenröhrchen. Die Größenauswahl ermöglicht es uns, die minimale Länge für die chimären Fragmente festzulegen und später zwischen ligierten und nicht ligierten Produkten zu unterscheiden.

Zentrifugieren Sie die Gelscheiben bei 12.000 mal g bei Raumtemperatur für zwei Minuten, um die Gelscheibe zu zerkleinern und in dem zwei Milliliter Mikrofuge-Röhrchen zu sammeln. Nach dem Schleudern das leere 0,6-Milliliter-Mikrofugenröhrchen entsorgen. Füge der zerkleinerten Gelscheibe 700 Mikroliter Elutionspuffer hinzu.

Inkubieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius mit konstanter Rotation, um die Diffusion der Proben in den Puffer zu ermöglichen. Die Gelscheiben und den Elutionspuffer in einen Zentrifugenröhrchenfilter geben und 20 Minuten lang bei 20.000 g zentrifugieren. Nach dem Schleudern werden die Gelscheiben im oberen Fach des Filters gefangen und können entsorgt werden.

Die RNA ist wie im Begleitdokument beschrieben auszufällen und zu quantifizieren. Schockfrosten und lagern Sie die RNA bei minus 80 Grad Celsius in flüssigem Stickstoff, bis sie verwendet wird. Um RNA-Vernetzungsregionen anzureichern, fügen Sie zunächst 100 Mikroliter Lysepuffer mit RNase-Inhibitor hinzu, um Streptavidin-beschichtete magnetische Kügelchen in einem Mikrofuge-Röhrchen zu waschen.

In ein konisches 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen geben Sie zwei Milliliter frisch zubereiteten Hybridisierungspuffer, einen Milliliter ergänzten Lysepuffer, 1,5 Mikrogramm fraktionierte RNA und 100 Mikroliter resuspendierte Kügelchen. Drehen Sie das Rohr sanft ein. Inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit End-to-End-Rotation.

Waschen Sie die Kügelchen nach der Inkubation fünfmal mit vorgewärmtem Waschpuffer. Legen Sie am Ende des fünften Waschgangs das Mikrofuge-Röhrchen mit den Kügelchen für eine Minute auf den Magnetständer und entfernen Sie dann den Waschpuffer. Geben Sie einen Milliliter kalten T4-Polynukleotidkinase-Puffer zu den gewaschenen Kügelchen.

Inkubieren Sie die Kügelchen fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius mit End-to-End-Rotation. Legen Sie das Mikrofuge-Röhrchen mit den Kügelchen auf den Magnetstreifen. Entfernen Sie nach einer Minute vorsichtig den Puffer.

Wiederholen Sie diesen Schritt für insgesamt zwei Wäschen und entfernen Sie den Puffer nach der letzten Wäsche. Befolgen Sie als Nächstes die Anweisungen im Begleitdokument, um die fünf Primzahlen und drei Primzahlen so zu konvertieren, dass sie ligationskompatibel sind, und führen Sie die Proximity-Ligation durch. Geben Sie nach dem Waschen 100 Mikroliter RNA-PK-Puffer zu den Kügelchen und resuspendieren Sie sie, indem Sie auf und ab pipettieren.

Erhitzen Sie die Proben auf einem Heizblock 10 Minuten lang bei 95 Grad Celsius. Anschließend kühlen Sie die Probe eine Minute lang auf Eis. Geben Sie 500 Mikroliter Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform in die Probe.

Mischen, indem Sie 10 Sekunden lang kräftig vortexen. Inkubieren Sie die Mischung 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Verwenden Sie nach der Inkubation ein Kit, um die RNA zu fällen, zu reinigen und zurückzugewinnen, und stellen Sie sicher, dass auch kleine RNAs erhalten bleiben.

Eluieren Sie die RNA in 100 Mikrolitern nukleasefreiem Wasser. Übertragen Sie 100 Mikroliter der eluierten Proben in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte auf schön. Die Probe wird auf Eis gehalten und fünf Minuten lang mit 254 Nanometern bestrahlt.

Übertragen Sie die umgekehrt vernetzte Probe in ein sauberes Mikrofugenröhrchen. Fügen Sie 10 Mikroliter Natriumacetat, einen Mikroliter Glykogen und 300 Mikroliter 100% Ethanol hinzu. Fältitieren Sie die RNA mindestens eine Stunde lang bei minus 20 Grad Celsius.

Um die RNA zurückzugewinnen, zentrifugieren Sie die gefällte RNA bei 20.000 g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie nach dem Schleudern den Überstand und fügen Sie einen Milliliter 70%kaltes Ethanol hinzu, um das RNA-Pellet zu waschen. Zentrifugieren Sie das gewaschene Pellet bei 20.000 g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius.

Entfernen Sie den Waschpuffer und fügen Sie 4,25 Mikroliter nukleasefreies Wasser hinzu, um die RNA zu resuspendieren. Übertragen Sie die RNA in ein 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchen. Schließlich wird die cDNA gemäß den Anweisungen im Begleitdokument umgekehrt transkribiert, zirkularisiert und amplifiziert.

Dieses Schema zeigt den SPLASH-Workflow. Nach Zugabe von biotinyliertem Psoralen in Gegenwart von 0,01 % Digitonin und UV-Vernetzung wird die Gesamt-RNA aus den Zellen extrahiert und ein Dot-Blot durchgeführt, um sicherzustellen, dass die Vernetzung effizient ist. Biotinylierte 20-Basen-Oligos werden dann als Positivkontrollen verwendet, um die Menge an biotinyliertem Psoralen zu titrieren, die den Zellen zugesetzt werden soll, so dass etwa eine von 150 Basen vernetzt ist.

Anschließend wird eine PCR-Amplifikation in kleinem Maßstab mit zunehmender Anzahl von PCR-Zyklen durchgeführt, um die Mindestanzahl von Zyklen zu bestimmen, die für die Tiefensequenzierung erforderlich ist. In einem effizienten Bibliotheksvorbereitungsprozess kann eine cDNA-Sequenzierungsbibliothek aus einer ausgewählten RNA-Eingabe von 1,5 Mikrogramm in weniger als 15 PCR-Amplifikationszyklen amplifiziert werden. Die Bibliothek wird dann mit zwei 150-Basenpaar-Reads auf einer High-Through-Sequencing-Maschine sequenziert.

Die Sequenzierungs-Reads werden dann entsprechend der Rechenpipeline verarbeitet. Das Endergebnis ist eine Liste gefilterter chimärer Interaktionen, die sowohl intramolekulare als auch intermolekulare RNA-RNA-Wechselwirkungen im Transkriptom umfasst. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, bei der Anwendung von SPLASH bei neuen Organismen auf biotinylierte Psoralen zu prüfen.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der RNA-Biologie, um RNA-Wechselwirkungen in verschiedenen Organismen zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine Sequenzierungsbibliothek erstellen, die paarweise RNA-Wechselwirkungen global in der Zelle erfasst.