Name: Zuordnung von RNA-RNA-Wechselwirkungen unter Verwendung von biotinyliertem Psoralen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Erfahren Sie die SPLASH-Methode zur Kartierung von RNA-RNA-Wechselwirkungen in vivo mit biotinyliertem Psoralen und Hochdurchsatz-Sequenzierung. Diese Technik ermöglicht genomweite Analysen in Hefe, Bakterien und menschlichen Zellen.

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Wir danken den Mitgliedern des Wan Labors und dem Nagarajan Labor für informative Diskussionen. N.Nagarajan wird durch die Finanzierung von A * STAR unterstützt. Y.Wan wird unterstützt durch die Förderung von A * STAR und Society in Science-Branco Weiss Fellowship.

<ol><li>Wan, Y., Kertesz, M., Spitale, R. C., Segal, E., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+transcriptome+through+RNA+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Rev.Genet%22%5BJournal%5D)">Understanding the transcriptome through RNA structure.</a> Nat.Rev.Genet. 12 (9), 641-655 (2011).</li>
<li>Kertesz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+measurement+of+RNA+secondary+structure+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide measurement of RNA secondary structure in yeast.</a> Nature. 467 (7311), 103-107 (2010).</li>
<li>Wan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+Measurement+of+RNA+Folding+Energies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide Measurement of RNA Folding Energies.</a> Mol.Cell. 48 (2), 169-181 (2012).</li>
<li>Wan, Y., Qu, K., Ouyang, Z., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+RNA+structure+using+nuclease+digestion+and+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of RNA structure using nuclease digestion and high-throughput sequencing.</a> Nat.Protoc. 8 (5), 849-869 (2013).</li>
<li>Wan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landscape+and+variation+of+RNA+secondary+structure+across+the+human+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome.</a> Nature. 505 (7485), 706-709 (2014).</li>
<li>Spitale, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+imprints+in+vivo+decode+RNA+regulatory+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms.</a> Nature. 519 (7544), 486-490 (2015).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome-wide+profiling+of+RNA+secondary+structure+reveals+novel+regulatory+features%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features.</a> Nature. 505 (7485), 696-700 (2014).</li>
<li>Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+probing+of+RNA+structure+reveals+active+unfolding+of+mRNA+structures+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo.</a> Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).</li>
<li>Kudla, G., Granneman, S., Hahn, D., Beggs, J. D., Tollervey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-linking%2C+ligation%2C+and+sequencing+of+hybrids+reveals+RNA-RNA+interactions+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A%22%5BJournal%5D)">Cross-linking, ligation, and sequencing of hybrids reveals RNA-RNA interactions in yeast.</a> Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 108 (24), 10010-10015 (2011).</li>
<li>Sugimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hiCLIP+reveals+the+in+vivo+atlas+of+mRNA+secondary+structures+recognized+by+Staufen+1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">hiCLIP reveals the in vivo atlas of mRNA secondary structures recognized by Staufen 1.</a> Nature. 519 (7544), 491-494 (2015).</li>
<li>Engreitz, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-RNA+interactions+enable+specific+targeting+of+noncoding+RNAs+to+nascent+Pre-mRNAs+and+chromatin+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RNA-RNA interactions enable specific targeting of noncoding RNAs to nascent Pre-mRNAs and chromatin sites.</a> Cell. 159 (1), 188-199 (2014).</li>
<li>Ramani, V., Qiu, R., Shendure, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+determination+of+RNA+structure+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High-throughput determination of RNA structure by proximity ligation.</a> Nat.Biotechnol. , (2015).</li>
<li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Duplex+Map+in+Living+Cells+Reveals+Higher-Order+Transcriptome+Structure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RNA Duplex Map in Living Cells Reveals Higher-Order Transcriptome Structure.</a> Cell. 165 (5), 1267-1279 (2016).</li>
<li>Sharma, E., Sterne-Weiler, T., O'Hanlon, D., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Mapping+of+Human+RNA-RNA+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell%22%5BJournal%5D)">Global Mapping of Human RNA-RNA Interactions.</a> Mol.Cell. 62 (4), 618-626 (2016).</li>
<li>Aw, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Mapping+of+Eukaryotic+RNA+Interactomes+Reveals+Principles+of+Higher-Order+Organization+and+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell%22%5BJournal%5D)">In Vivo Mapping of Eukaryotic RNA Interactomes Reveals Principles of Higher-Order Organization and Regulation.</a> Mol.Cell. 62 (4), 603-617 (2016).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Hier beschreiben wir im Detail den experimentellen und rechnerischen Workflow für SPLASH, eine Methode, die es uns ermöglicht, paarweise RNA-Interaktionen genomweit zu identifizieren. Wir haben erfolgreich SPLASH in Bakterien-, Hefe- und menschlichen Kulturen eingesetzt und erwarten, dass die Strategie weitgehend auf verschiedene Organismen unter verschiedenen zellulären Zuständen angewendet werden kann. Einer der kritischen Schritte im Protokoll ist, mit mindestens 20 μg vernetzten RNA zu beginnen, um ausreichend Mater...

Das Studium, wie Makromoleküle falten und miteinander interagieren, ist der Schlüssel zum Verständnis der Genregulation in der Zelle. Während in den vergangenen zehn Jahren viel Aufwand fokussiert wurde, um zu verstehen, wie DNA und Proteine ​​zur Genregulation beitragen, ist relativ wenig über die posttranskriptionelle Regulation der Genexpression bekannt. RNA trägt sowohl in ihrer linearen Sequenz als auch in ihrer sekundären und tertiären Struktur 1 Information. Seine Fähigkeit, sich mit sich selbst und mit anderen zu paaren, ist für seine Funktion in vivo wichtig. Jüngste Fortschritte bei der Hochdurchsatz-RNA-Sekundärstruktur-Sondierung lieferten wertvolle Einblicke in die Orte von Doppel- und Einzelstrangbereichen im Transkriptom 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , HoweDie Information über die Paarungs-Interaktionspartner fehlt noch weitgehend. Um zu bestimmen, welche RNA-Sequenz mit einer anderen RNA-Region im Transkriptom interagiert ist, benötigen wir globale paarweise Informationen. Die Abbildung von Paar-weise RNA-Interaktionen in einer globalen, unvoreingenommenen Weise war traditionell eine große Herausforderung. Während frühere Ansätze, wie CLASH 9 , hiCLIP 10 und RAP 11 , verwendet werden, um RNA-Wechselwirkungen in einer großen Skala zu identifizieren, weisen diese Techniken typischerweise die RNA-Basenpaarung für eine Untergruppe von RNAs auf, die entweder mit einem bestimmten Protein oder einer RNA-Spezies interagieren. Zu den jüngsten Entwicklungen beim Studium globaler RNA-Wechselwirkungen gehören die Methode RPL 12 , die RNA-Wechselwirkungen nicht in vivo stabilisiert und daher nur eine Untermenge von in vivo- Wechselwirkungen erfassen kann. Um diese Herausforderungen zu bewältigen, entwickelten wir und andere genomweite, unvoreingenommene Strategien für maP-RNA-Interactome in vivo unter Verwendung modifizierter Versionen des Vernetzers Psoralen 13 , 14 , 15 . In diesem Protokoll beschreiben wir die Details für die Durchführung von S- Zentren von P- Soralen-vernetzten, l- igierten und S- gewählten H- Ybriden (SPLASH), die biotinylierte Psoralen verwenden, um Basenpaarungs-RNAs in vivo zu vernetzen, gefolgt von einer Näherungsligatur und einer hohen Durchsatzsequenzierung zu Identifizieren RNA-Basenpaarungspartner genomweit ( Abbildung 1 ) 15 . In diesem Manuskript beschreiben wir die Schritte zur Durchführung von SPLASH unter Verwendung von kultivierten adhärenten Zellen, in diesem Fall HeLa-Zellen. Das gleiche Protokoll kann leicht an Suspensions-Säugetierzellen und an Hefe- und Bakterienzellen angepasst werden. Kurz gesagt werden HeLa-Zellen mit biotinyliertem Psoralen behandelt und bei 365 nm bestrahlt, um interagierende RNA-Basenpaare in vivo zu vernetzen. Die RNAs werden dann aus den Zellen extrahiert, zersplittert und angereichert für Vernetzungsregionen unter Verwendung von Streptavidinperlen. Interagierende RNA-Fragmente werden dann unter Verwendung von Proximity-Ligation miteinander ligiert und zu einer cDNA-Bibliothek zur tiefen Sequenzierung gebracht. Nach der Sequenzierung werden die chimären RNAs auf das Transkriptom / Genom abgebildet, um die RNA-interagierenden Regionen zu identifizieren, die miteinander gepaart sind. Wir haben SPLASH erfolgreich genutzt, um Tausende von RNA-Wechselwirkungen in vivo in Hefe und verschiedenen menschlichen Zellen zu identifizieren, einschließlich intramolekularer und intermolekularer RNA-Basenpaarung in verschiedenen Klassen von RNAs wie SnoRNAs, lncRNAs und mRNAs, um in die Strukturorganisation und Interaktionsmuster einzutauchen Von RNAs in der Zelle.

<table><tbody><tr><td>1 kb Plus DNA-Leiter</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>10787026 DNA-Leiter</td><td></td></tr><tr><td>10 bp DNA-Leiter</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>10821-015 DNA-Leiter</td><td></td></tr><tr><td>20% SDS-Lösung</td><td>Erste BASE</td><td>BUF-2052-1L&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>Erste BASE</td><td>BUF-3050-20X1L</td><td></td></tr><tr><td>3,0 M Natriumacetat-Lösung</td><td>Erste BASE</td><td>BUF-1151-1L-pH5,2&nbsp; &nbsp;</td><td>Erforderlich für die Nukleinsäurefällung</td></tr><tr><td>40% Acrylamid/Bis-Lösung, 19:1</td><td>Bio-Rad</td><td>1610145</td><td>TBE Harnstoff-Gelkomponente</td></tr><tr><td>Ambion Buffer Kit</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>AM9010</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfat, Molekularqualität&nbsp; &nbsp;</td><td>Promega</td><td>V3131&nbsp;</td><td>FSME Urea Gel Komponente</td></tr><tr><td>Bromphenol Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126-25G</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Merck</td><td>1.02445.1000</td><td>RNA-Extraktion</td></tr><tr><td>Einzelstrang-DNA-Ligase</td><td>Epicentre</td><td>CL9025K</td><td>CircLigase II ssDNA Ligase</td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchenfilter</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS8160-96EA</td><td>Costar Spin-X Zentrifugenröhrchenfilter</td></tr><tr><td>D5628-1G DIGITONIN KRISTALLIN</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5628-1G</td><td>Für die Zellbehandlung</td></tr><tr><td>Dark Reader Transilluminator&nbsp;</td><td>Clare Chemical Research</td><td>Dark Reader DR89X Transilluminator</td><td>Blaulicht-Transilluminator</td></tr><tr><td>DNA-Gel-Ladefarbstoff (6x)</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>R0611</td><td>Erforderlich für die Agarose-Gel-Elektroporation</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Pan BioTech</td><td>P04-03500</td><td>Für Hela-Zellkultur</td></tr><tr><td>Streptavidin-Magnetbeads</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>65002</td><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1&nbsp;</td></tr><tr><td>Magnetischer Ständer für 15&nbsp; mL Röhren</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>12301D</td><td>DynaMag-15</td></tr><tr><td>Magnetischer Ständer für 15&nbsp; mL Röhrchen</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>12321D</td><td>DynaMag-2</td></tr><tr><td>ThermoMixer</td><td>Eppendorf</td><td>5382 000.015</td><td>Eppendorf ThermoMixer&nbsp; C</td></tr><tr><td>Biotinyliertes Psoralen</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>29986</td><td>EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotin</td></tr><tr><td>F8T5/BL&nbsp;</td><td>Hitachi</td><td>F8T5/BL&nbsp;</td><td>365 nm UV-Lampe</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>10270106&nbsp; &nbsp;</td><td>Bestandteile von Hela medium</td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Promega</td><td>H5052&nbsp; &nbsp;</td><td>Komponente im Hybridisierungspuffer</td></tr><tr><td>G8T5</td><td>Sankyo-Denki</td><td>G8T5</td><td>254 nm UV-Lampe</td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>10814010</td><td>Erforderlich für die Nukleinsäurefällung</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>Nanodrop 2000</td><td>Spektralphotometer für die Nukleinsäurequantifizierung</td></tr><tr><td>Nukleasefreies Wasser&nbsp;</td><td>Erste BASE</td><td>BUF-1180-500ml&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin&nbsp; &nbsp;</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>15140122&nbsp; &nbsp;</td><td>Bestandteile von Hela medium</td></tr><tr><td>High-Fidelity-DNA-Polymerase (2x)</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>F531L&nbsp;</td><td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix mit HF-Puffer (2x)</td></tr><tr><td>Primer Set 1</td><td>New England Biolabs</td><td>E7335L&nbsp;</td><td>PCR-Primer</td></tr><tr><td>DNA-Gel-Extraktionskit</td><td>QIAgen</td><td>28106</td><td>QIAquick Gel-Extraktionskit</td></tr><tr><td>Fluorometrisches Quantifizierungskit</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>Q32854</td><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td></tr><tr><td>RNA-Aufreinigungskit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td>RNeasy Mini Kit Silica-Membran-Säule</td></tr><tr><td>Rnase Inhibitor</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>AM2696</td><td>SUPERase In</td></tr><tr><td>Reverse Transkriptase</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>18080400</td><td>SuperScript III Erststrangsynthese SuperMix</td></tr><tr><td>Nukleinsäure-Gel Stain</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>S11494</td><td>SYBR GOLD NUKLEINSÄURE 500 UL</td></tr><tr><td>T4 Polynukleotidkinase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201L</td><td>Endreparaturenzym</td></tr><tr><td>T4 RNA Ligase 1</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204L</td><td>Enzym für Proximity-Ligation</td></tr><tr><td>T4-RNA-Ligase 2, verkürzt KQ</td><td>New England Biolabs</td><td>M0373L</td><td>Enzym für die Adapterligation</td></tr><tr><td>Temed</td><td>Bio-Rad</td><td>1610801</td><td>FSME Harnstoff-Gelkomponente</td></tr><tr><td>Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>15596018</td><td>TRIzol&reg; Reagenz für die RNA-Extraktion</td></tr><tr><td>Urea</td><td>First BASE</td><td>BIO-2070-5kg&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>UV-Vernetzer</td><td>Stratagene</td><td>400072</td><td>UV Stratalinker 1800</td></tr><tr><td>UV Transilluminator</td><td>UVP</td><td>95-0417-01</td><td>Zur Visualisierung von Banden</td></tr><tr><td>Xylol Cyanol FF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X4126-10G</td><td></td></tr><tr><td>DNA-Aufreinigung it</td><td>Zymo Research&nbsp;</td><td>D4004</td><td>Zymo DNA-Konzentrator-5&nbsp;</td></tr><tr><td>Liste der benötigten Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FastQC Software</td><td>0.11.4</td><td>http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</td><td></td></tr> <tr><td>SeqPrep Software</td><td>1.0.7</td><td>https://github.com/jstjohn/SeqPrep</td><td></td></tr><tr><td>BWA Software</td><td>0.7.12</td><td>http://bio-bwa.sourceforge.net/</td><td></td></tr> <tr><td>SAMTOOLS Software</td><td>1.2.1</td><td>http://www.htslib.org/</td><td></td></tr> <tr><td>PULLSEQ Software</td><td>1.0.2</td><td>https://github.com/bcthomas/pullseq</td><td></td></tr><tr><td>STAR Software</td><td>2.5.0c</td><td>https://github.com/alexdobin/STAR</td><td></td></tr><tr><td>rem_dups.py PYTHON Skript</td><td>PYTHON 2.7.11</td><td>https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src</td><td></td></tr><tr><td>find_chimeras.py PYTHON Skript</td><td>PYTHON 2.7.11</td><td></td><td></td>https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src</tr><tr><td>pickJunctionReads.awk AWK-Skript</td><td>AWK GNU 4.1.2</td><td>https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src</td><td></td></tr><tr><td>Buffer composition</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elution buffer0.3</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>M Natriumacetat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lysis Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mM Tris-Cl pH 7,0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1% SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vor Gebrauch immer Superase-in frisch zugeben, außer beim Waschen von</td><td></td><td></td><td></td> Perlen</tr><tr><td>Proteinase K Puffer&nbsp; </stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mM NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-Cl pH 7,0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mM EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,5 % SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><stark>Hybridisierungspuffer</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>750 mM NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 % SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mM Tris-Cl pH 7,0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mM EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15% Formamid (im Dunkeln bei 4 & Grad lagern; C)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superase-in vor Gebrauch</td><td></td><td></td><td></td> immer frisch zugeben</tr><tr><td><stark>2x SSC Waschpuffer</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2x NaCl und Natriumcitrat (SSC) (verdünnt aus 20x SSC Invitrogen Stamm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,5% SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><stark>2x RNA-Fragmentierungspuffer</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 mM MgCl2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>450 mM KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>300 mM Tris-Cl pH 8,3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><stark>2x RNA-Beladung Farbstoff</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>95 % Formamid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,02 % SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,02 % Bromphenolblau</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,01 % Xylol, Cyanol</td><td></td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>1 mM EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><<tr>td colspan="4">3' RNA-Adaptersequenz: 
5rAppCTGTAGGCACCATCAAT/3ddC</td></tr><tr><td colspan="4">RT Primer-Sequenz: 
AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGGGTCGC/iSp18/CACTCA/iSp18/TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTGATGATGGTGCCTACAG</td></tr></tbody></table>

zuordnung von rna-rna-wechselwirkungen unter verwendung von biotinyliertem psoralen

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Zu wissen, wie RNAs mit sich selbst und mit anderen interagieren, ist der Schlüssel zum Verständnis der RNA-basierten Genregulation in der Zelle. Während Beispiele für RNA-RNA-Wechselwirkungen wie microRNA-mRNA-Wechselwirkungen gezeigt wurden, um die Genexpression zu regulieren, ist das volle Ausmaß, in dem RNA-Wechselwirkungen in der Zelle auftreten, noch unbekannt. Bisherige Methoden zur Untersuchung von RNA-Wechselwirkungen haben sich primär auf Teilmengen von RNAs konzentriert, die mit einem bestimmten Protein oder einer RNA-Spezies interagieren. Hier beschreiben wir eine Methode namens S equencing von P soralen vernetzt, L igated und S gewählt H ybrids (SPLASH), die genomweites Erfassen von RNA-Wechselwirkungen in vivo in einer unvoreingenommenen Weise ermöglicht. SPLASH nutzt in vivo- Vernetzung, Proximity-Ligation und High-Throughput-Sequenzierung, um intramolekulare und intermolekulare RNA-Basenpaarungspartner weltweit zu identifizieren. SPLASH kann auf verschiedene Organismen angewendet werden, einschließlich Bakterien, Hefe und menschliche Zellen, sowie aS vielfältige zelluläre Bedingungen, um das Verständnis der Dynamik der RNA-Organisation unter verschiedenen zellulären Kontexten zu erleichtern. Das gesamte experimentelle SPLASH-Protokoll dauert ca. 5 Tage und der rechnerische Workflow dauert ca. 7 Tage.

Abbildung 1 zeigt den Schema des SPLASH-Workflows. Bei der Zugabe von biotinyliertem Psoralen in Gegenwart von 0,01% Digitonin und UV-Vernetzung wird die Gesamt-RNA aus den Zellen extrahiert und ein Punkt-Blot wird durchgeführt, um sicherzustellen, dass die Vernetzung von biotinyliertem zu der RNA effizient erfolgt ist (Abbildung 2 ). Wir verwenden biotinylierte 20-Basen-Oligos als positive Kontrollen, um die Menge an biotinylie...

Hier beschreiben wir die Methode des S- Zensierens von P- Soralen-vernetzten, l- igierten und S- gewählten H- Ybriden (SPLASH), die eine genomweite Abbildung von intramolekularen und intermolekularen RNA-RNA-Wechselwirkungen in vivo ermöglichen. SPLASH kann angewendet werden, um RNA-Interaktome von Organismen einschließlich Hefe, Bakterien und Menschen zu untersuchen.

Zuordnung von RNA-RNA-Wechselwirkungen unter Verwendung von biotinyliertem Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Das übergeordnete Ziel dieses Videos besteht darin, die Methode zur Sequenzierung von Psoralen-vernetzten, ligierten und selektierten Hybridmolekülen oder SPLASH zu beschreiben, bei der paarweise in vivo RNA-RNA-Interaktionen genomweit kartiert werden. Diese Technik ist eine einfache, hochdurchsatzfähige Methode zur Abbildung von RNA-Interaktionen in vivo. Mit dieser Methode können zentrale Fragen im Bereich der RNA-Genomik beantwortet werden, beispielsweise, wie verschiedene Regionen entlang eines einzelnen RNA-Strangs oder zwischen verschiedenen RNA-Strängen miteinander interagieren.Obwohl diese Methode Einblicke in Hefe- und menschliche Zellen ermöglichen kann, lässt sie sich auch auf Studien an anderen modernen Organismen einschließlich Bakterien und Membranen in Zellen anwenden. Die Idee zu dieser Methode entstand ursprünglich, als wir nach einer Möglichkeit suchten, molekulare Wechselwirkungen abzubilden. Beachten Sie, dass das folgende Verfahren mehrere Unterbrechungspunkte enthält.Zu diesen Zeitpunkten kann das Experiment kurzfristig oder unbegrenzt unterbrochen werden. Einzelheiten finden sich im begleitenden Text. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die HeLa-Zellen z

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Forschung

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Genetik

RNA-Transkripte sind Gegenstand intensiver posttranskriptioneller Regelung, die durch eine Vielzahl von trans-agierenden RNA-bindende Proteine ​​(RBPs) vermittelt wird. Hier präsentieren wir Ihnen eine verallgemeinerbare Methode zur Identifizierung und präzise auf Transkriptom-weiten Skala der RNA-Bindungsstellen von RBPs.

PAR-Clip - Ein Verfahren zur Transkriptom-weiten die Bindungsstellen des RNA-bindende Proteine ​​Identifizieren

RNA-Protein-Wechselwirkungen sind das Herzstück vieler zellulärer Prozesse. Hier beschreiben wir eine in vivo Methode, um spezifische RNA zu isolieren und neue Proteine zu identifizieren, die mit ihr assoziiert sind. Dies könnte ein neues Licht darauf werfen, wie RNAs in der Zelle reguliert werden.

Neuartige RNA-bindende Proteine ​​Isolation durch die rasche Methodik

Laser werden häufig in Untersuchungen der zellulären Antwort auf DNA-Schädigung verwendet. Jedoch erzeugen sie Läsionen, deren Abstand, Frequenz und Kollisionen mit Replikationsgabeln werden selten charakterisiert. Hier beschreiben wir einen Ansatz, der die Bestimmung dieser Parameter mit Laser lokalisiert Interstrang- Vernetzungen ermöglicht.

Einzelmolekülanalyse von Laser Lokalisierte Psoralen Addukten

Wir beschreiben ein Protokoll zur RNA-bindende Proteine und RNA-bindende Regionen in lebenden Zellen mit UV-vermittelten Photocrosslinking und Massenspektrometrie.

Probenvorbereitung für Masse Spektrometrie-basierte Identifikation der RNA-bindende Regionen

Hier präsentieren wir ein Interaktom-Capture-Protokoll, das auf Arabidopsis thaliana Blatt-Mesophyll-Protoplasten angewendet wird. Diese Methode beruht kritisch auf in vivo UV-Vernetzung und ermöglicht die Isolierung und Identifizierung von p-mRNA-bindenden Proteinen aus einer physiologischen Umgebung.

MRNA Interactome Capture aus Pflanzenprotoplasten

Ein detailliertes Protokoll zur Anwendung der Klick Chemie-gestützte RNA-Interaktom erfassen (CARIC) Strategie um Proteine binden beide Codierung und Forensisches identifizieren RNAs wird vorgestellt.

Erfassung und Identifizierung von RNA-bindende Proteine mit Click-Chemie-gestützte RNA-Interaktom erfassen (CARIC) Strategie

RNA/Proteinkomplexe gereinigt mit Botin Streptavidin-Strategie sind Lösung unter denaturierenden Bedingungen in einer Form ungeeignet für die weitere Reinigung und Funktionsanalyse eluiert. Hier beschreiben wir eine Änderung dieser Strategie, die einen Foto-spaltbaren Linker in RNA und einem sanften UV-Elution Schritt nachgeben native und voll funktionsfähige RNA/Proteinkomplexe nutzt.

Einzelschritt-Reinigung der makromolekularen komplexe mit RNA an Biotin und ein Foto-spaltbaren Linker befestigt

Hier beschreiben wir die Montage von RNA-Polymerase II (Pol II) Dehnungskomplexen, die nur kurze synthetische DNA- und RNA-Oligonukleotide und gereinigte Pol II erfordern. Diese Komplexe sind nützlich für die Untersuchung von Mechanismen, die der kotranskriptiellen Verarbeitung von Transkripten im Zusammenhang mit dem Pol-II-Dehnungskomplex zugrunde liegen.

Künstliche RNA-Polymerase II-Dehnungskomplexe zur Sezieren von co-transkriptionellen RNA-Verarbeitungsereignissen

Hier werden Protokolle für biochemische In-vitro-Tests mit Biotin-Etiketten vorgestellt, die für die Untersuchung von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen weit verbreitet sein können.

In Vitro biochemische Assays mit Biotin-Etiketten zur Untersuchung von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen

In dieser Arbeit stellen wir eine optimierte in vitro Methode vor, um Proteininteraktoren spezifischer RNA-Sequenzen aufzudecken, zu quantifizieren und zu validieren, wobei Gesamtproteinextrakt aus menschlichen Zellen, Streptavidin-Kügelchen, die mit biotinylierter RNA beschichtet sind, und Massenspektrometrie-Analysen verwendet werden.

Eine optimierte quantitative Pull-Down-Analyse von RNA-bindenden Proteinen unter Verwendung kurzer biotinylierter RNA

Erfahren Sie die SPLASH-Methode zur Kartierung von RNA-RNA-Wechselwirkungen in vivo mit biotinyliertem Psoralen und Hochdurchsatz-Sequenzierung. Diese Technik ermöglicht genomweite Analysen in Hefe, Bakterien und menschlichen Zellen.

Zuordnung von RNA-RNA-Wechselwirkungen unter Verwendung von biotinyliertem Psoralen

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