Probenvorbereitung für Masse Spektrometrie-basierte Identifikation der RNA-bindende Regionen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, RNA-bindende Proteine in lebenden Zellen zu identifizieren und ihre RNA-Bindungsregionen mittels UV-vermittelter Photo-Crosslinking-Technik gefolgt von Massenspektrometrie zu kartieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Epigenetik zu beantworten, beispielsweise welche epigenetischen Regulatoren an RNA gebunden sind und welche Proteinbereiche für die Wechselwirkungen erforderlich sind. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass keine Reinigung der Protein-RNA-Komplexe erforderlich ist, wodurch nur geringe Materialmengen benötigt werden und Proteine erfasst werden können, die an jede Art von RNA gebunden sind.

Wie dargestellt, konzentriert sich diese Methode auf nukleäre Proteine, da dies unser wissenschaftliches Interesse ist, könnte jedoch mit geringfügigen Modifikationen der Fraktionierungsschritte auch zur Untersuchung von RNA und bindenden Proteinen in anderen zellulären Kompartimenten verwendet werden. Nachdem die Maus-ES-Zellen gemäß dem Textprotokoll kultiviert und expandiert wurden, vermehren Sie die Zellen auf die erforderliche Anzahl von 10-Zentimeter-Platten. Bevor die Platten konfluent werden, geben Sie vier SU direkt in das Medium ein, um eine Endkonzentration von 500 Mikromolar zu erreichen.

Lassen Sie die 4sU-Kontrollplatten unbehandelt. Schütteln Sie die Platten vorsichtig, um das 4sU gleichmäßig im Medium zu verteilen, und stellen Sie sie dann für zwei Stunden in denselben Zellkultur-Inkubator zurück. Die Effizienz der 4sU-Inkorporierung variiert je nach Zelltyp, weshalb es möglicherweise notwendig ist, die Konzentration und die Inkubationszeit zu optimieren, um eine effiziente Vernetzung sicherzustellen und Toxizität zu minimieren.

Als Nächstes überführen Sie die Platten in einen Eisbehälter und entsorgen das Medium. Anschließend spülen Sie die Platten vorsichtig mit 5 Milliliter eiskaltem PBS. Geben Sie 2 Milliliter eiskaltes PBS hinzu und stellen Sie die Platten ohne Deckel in einen Vernetzer, der mit UV-B-emittierenden Lampen ausgestattet ist.

Bestrahlen Sie die Platten mit einer Energie von 1 Joule pro Quadratzentimeter. Eine effiziente UV-Vernetzung ist entscheidend. Wir empfehlen die Verwendung von UV-B-Licht, jedoch kann auch UV-A verwendet werden.

In jedem Fall sollte die verwendete Menge an UV-Energie optimiert werden und kann mittels PAR-CLIP oder ChIRP überwacht werden. Verwenden Sie Zellabheber, um die Zellen zu sammeln, und überführen Sie sie in kalte PBS-Lösung in kegelförmigen Röhrchen. Anschließend zentrifugieren Sie die Zellen bei 2000 × g und vier Grad Celsius für fünf Minuten.

Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in fünf Milliliter eiskaltem PBS mit 2 Millimolar EDTA und 0,2 Millimolar PMSF. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Erwarten Sie fünf bis zehn Millionen und zehn bis zwanzig Millionen Zellen von 10-Zentimeter- und 15-Zentimeter-Platten respectively.

Anschließend die Zellen bei 2000 × g und 4 °C fünf Minuten lang zentrifugieren. Um Kerne aus den Zellen zu isolieren, kaltes Puffer A gemäß dem im Text beschriebenen Protokoll herstellen. Vor der Verwendung 0,5 mmolaren DTT und 0,2 mmolaren PMSF zur gewünschten Menge an Puffer A hinzufügen. 2 mL des kalten Puffers zur Zellprobe hinzufügen, um diese zu waschen, danach die Zellen bei 2500 × g und 4 °C fünf Minuten lang zentrifugieren.

Entfernen Sie den Überstand und geben Sie Puffer A, der mit 0,2 Prozent eines nichtionischen, nicht-denaturierenden Detergens ergänzt wurde, hinzu. Anschließend rotieren Sie die Probe bei 4 Grad Celsius für fünf Minuten. Nach dem Zentrifugieren der Zellen bei 2500 × g für fünf Minuten entfernen Sie den Überstand. Das Pellet besteht aus intakten Kernen, die frei von Zytoplasma sind.

Um die Kerne zu lysieren, 200 Mikroliter Lysispuffer dem Röhrchen hinzufügen. Die Probe mit einer 1/8-Zoll-Sonde bei einer Amplitude von 50 Prozent für fünf bis zehn Sekunden beschallen, um die Chromatin-DNA zu fragmentieren. Die Probe bei 12.000 × g für fünf Minuten zentrifugieren und nur 175 Mikroliter Überstand abnehmen, um das Pellet zu vermeiden.

Als Nächstes die Proteinkonzentration mittels Bradford-Assay oder einer ähnlichen Methode bestimmen. Anschließend das Protein in den verschiedenen Proben mit Lysepuffer auf 1 Milligramm pro Milliliter oder die niedrigste Probenkonzentration verdünnen. Eine 5-Millimolar-DTT-Lösung zum nukleären Lysat hinzufügen und die Probe eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren.

Danach 14 Millimolar Iodacetamid aus frischer Stammlösung zugeben und das Lysat 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Das Lysat mit dem fünffachen Volumen 50 Millimolar Ammoniumbicarbonat verdünnen und dann Trypsin hinzufügen. Die Probe über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Um einen maßgeschneiderten Stage-Tipp pro Probe herzustellen, geben Sie eine Scheibe aus Festphasen-Extraktionsmaterial der Typ C18 in den Boden einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze. Geben Sie 50 Mikroliter Oligo-R3-Rückstandsphase-Harz auf die C18-Scheibe, setzen Sie den Stage-Tipp in einen Zentrifugieradapter und stellen Sie den Adapter in ein 1,5-Milliliter-Mikrofugengefäß. Geben Sie 100 Mikroliter 100-prozentiges Acetonitril zu den Spitzen, um diese zu waschen.

Anschließend die Tips bei 1000 × g für eine Minute zentrifugieren, um das Lösungsmittel zu entfernen. Die Tips mit 50 µL 0,1-prozentiger Trifluoressigsäure oder TFA äquilibrieren. Danach erneut zentrifugieren.

Formi­saure in einer Konzentration von 100 Prozent zu der verdauten Prote­inprobe hinzufügen, um den pH-Wert auf 2 bis 3 zu senken. Anschließend die Probe auf eine selbst­hergestellte Stage-Tip auftragen und die Probe bei 1000 × g eine Minute lang zentrifugieren, bis die gesamte Probe die Spitze durchlaufen hat. Die gebun­denen Peptide mit 50 Mikroliter 0,1-prozentiger TFA waschen.

Danach wird die Probe bei 1000 × g für eine Minute zentrifugiert, und die Peptide werden eluiert, indem 50 µL Elutionspuffer zum Stage-Tipp gegeben und erneut bei 1000 × g für eine Minute zentrifugiert werden, um den Elutionspuffer aus dem Tipp zu pressen. Die Probe wird unter Verwendung einer Vakuumzentrifuge, die auf 150 × g und 1 bis 3 kPa eingestellt ist, für eine Stunde getrocknet. Um vernetzte RNA aus der Probe zu entfernen, wird das Pellet in 50 µL 2× Nukleasepuffer resuspendiert.

Messen Sie die Peptidkonzentration bei 280 Nanometern unter der Annahme von 1 Milligramm pro Milliliter Peptide für einen A280 von 1. Verwenden Sie 2x Nuklease-Puffer, um alle Proben auf 1 Milligramm pro Milliliter oder auf die niedrigste Konzentration einzustellen, und bereiten Sie anschließend einen Master-Mix aus 50 Mikroliter Wasser und 1 Mikroliter hochreiner Nuklease pro Probe vor. Kombinieren Sie 50 Mikroliter Peptidprobe mit 50 Mikroliter Wasser-Nuklease-Master-Mix.

Als Nächstes die Probe eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Schließlich die Nanoflüssigkeitschromatographie, Massenspektrometrie und Datenverarbeitung gemäß dem Textprotokoll durchführen. Diese Abbildung zeigt ein Vulkandiagramm eines RBR-id-Ergebnisses aus mausischen ES-Zellen.

Peptide, die mit einer RNA-Erkennungsmotiv-Domäne überlappen, sind blau dargestellt und zeigen sehr konsistente Depletionsniveaus. Ein RNA-bindendes Peptid aus HNRNPC ist rot hervorgehoben. Dargestellt ist hier eine Wärmekarte der RBR-id-Scores, die als Schätzung der RNA-Bindewahrscheinlichkeit eines Proteinbereichs berechnet werden.

Die Bewertung wird auf die Oberfläche der Spleißosomen-Untereinheit U1-70k projiziert. Die intensive rote Farbe in der Nähe der RNA-Kontaktstelle, wie sie durch die Kristallstruktur bestimmt wurde, weist auf eine korrekte Identifizierung der Protein-RNA-Interaktion hin. In dieser Abbildung wird TET2 als ein neuartiges RBP präsentiert, und die RNA-Bindungsaktivität wird einer C-terminalen Region zugeordnet, indem die RBR-id-Bewertung entlang der primären Sequenz des Proteins dargestellt wird.

Schließlich könnte die Notwendigkeit dieses neuartigen RBR verifiziert werden, indem PAR-CLIP mit der Wildtyp-Sequenz durchgeführt und das Signal mit dem eines Mutanten, der das vorhergesagte RBR fehlt, verglichen wird. Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung innerhalb von sieben bis acht Stunden an zwei Tagen durchgeführt werden. Vor der Vernetzung können Zellen mit verschiedenen Behandlungen stimuliert werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise wie die Differenzierung beginnt oder wie der Zellzyklus RNA-Protein-Interaktionen reguliert.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Extras erzeugt, die vernetzte Protein-RNA-Komplexe enthalten, um mithilfe der Massenspektrometrie Bindungsstellen von Protein-RNA-Wechselwirkungen zu identifizieren.