Probenvorbereitung für Masse Spektrometrie-basierte Identifikation der RNA-bindende Regionen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, RNA-bindende Proteine in lebenden Zellen zu identifizieren und ihre RNA-Bindungsregionen mittels UV-vermittelter Photovernetzung und anschließender Massenspektrometrie zu kartieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Epigenetik zu beantworten, etwa welche epigenetischen Regulatoren an RNA gebunden sind und welche Proteinregionen für die Wechselwirkungen benötigt werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie keine Reinigung der Protein-RNA-Komplexe erfordert und daher wenig Material benötigt und Proteine identifiziert, die an jede Art von RNA gebunden sind.

Wie vorgestellt, konzentriert sich diese Methode auf nukleäre Proteine, da dies unser wissenschaftliches Interesse ist, aber mit geringfügigen Modifikationen in den Fraktionierungsschritten könnte sie zur Untersuchung von RNA und Bindungsproteinen in anderen strukturellen Kompartimenten verwendet werden. Nach der Kultivierung und Expansion von Maus-ESCs gemäß dem Textprotokoll expandieren Sie die Zellen auf die erforderliche Anzahl von 10-Zentimeter-Platten. Bevor die Platten die Konfluenz erreichen, geben Sie vier SU direkt in das Medium bis zu einer Endkonzentration von 500 Mikromolaren.

Lassen Sie 4sU Kontrollschalen unbehandelt. Schütteln Sie die Platten vorsichtig, um das 4sU gleichmäßig im Medium zu verteilen, und stellen Sie die Platten dann für zwei Stunden wieder in denselben Gewebekultur-Inkubator. Die Effizienz des 4sU-Einbaus variiert je nach Zelltyp, und daher kann es notwendig sein, die Konzentration und Inkubationszeit zu optimieren, um eine effiziente Vernetzung zu gewährleisten und die Toxizität zu minimieren.

Übertragen Sie dann die Platten in einen Eiskübel und entsorgen Sie das Medium. Verwenden Sie dann 5 Milliliter eiskaltes PBS, um die Platten vorsichtig zu spülen. Fügen Sie 2 Milliliter eiskaltes PBS hinzu und legen Sie die Platten ohne Deckel in einen Vernetzer, der mit UV-B-emittierenden Lampen ausgestattet ist.

Bestrahlen Sie die Platten mit einer Energieeinstellung von 1 Joule pro Quadratzentimeter. Eine effiziente UV-Vernetzung ist entscheidend. Wir empfehlen die Verwendung von UV-B-Licht, aber auch UV-A kann verwendet werden.

In jedem Fall sollte die Menge der eingesetzten UV-Energie optimiert werden und kann durch PAR-CLIP oder ChIRP überwacht werden. Verwenden Sie Zellheber, um die Zellen zu sammeln und in konischen Röhrchen in eiskaltes PBS zu überführen. Dann zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 2000 g und vier Grad Celsius.

Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Zellpellet in fünf Millilitern eiskaltem PBS mit 2 Millimolar EDTA und 0,2 Millimolar PMSF. Zählen Sie mit einem Hämozytometer die Zellen. Erwarten Sie fünf bis zehn und zehn bis zwanzig Millionen Zellen von 10-Zentimeter- bzw. 15-Zentimeter-Platten.

Zentrifugieren Sie die Zellen dann fünf Minuten lang bei 2000 g und 4 Grad Celsius. Um Zellkerne aus den Zellen zu isolieren, bereiten Sie den eiskalten Puffer A vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Geben Sie vor der Verwendung 0,5 Millimolar DTT und 0,2 Millimolar PMSF in die gewünschte Menge Puffer A. Geben Sie 2 Milliliter des kalten Puffers zu den Zellen, um sie zu waschen, und drehen Sie die Zellen dann fünf Minuten lang bei 2500 g und vier Grad Celsius.

Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie Puffer A hinzu, der mit 0,2 Prozent eines nichtionischen, nicht denaturierenden Reinigungsmittels ergänzt ist, und drehen Sie die Probe dann fünf Minuten lang bei 4 Grad Celsius. Nachdem Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 2500 g gedreht haben, entfernen Sie den Überstand. Das Pellet besteht aus intakten Kernen ohne Zytoplasma.

Um die Zellkerne zu lysieren, geben Sie 200 Mikroliter Lysepuffer in das Röhrchen. Verwenden Sie eine 1/8-Zoll-Sonde, um die Probe zu beschallen, um das Chromatin fünf bis zehn Sekunden lang bei einer Amplitudeneinstellung von 50 Prozent zu scheren. Schleudern Sie die Probe fünf Minuten lang bei 12000 mal g und sammeln Sie nur 175 Mikroliter Überstand, um das Pellet zu vermeiden.

Messen Sie anschließend die Proteinkonzentration mit dem Bradford-Assay oder einer ähnlichen Technik. Verwenden Sie dann einen Lysepuffer, um das Protein in den verschiedenen Proben auf 1 Milligramm pro Milliliter oder die niedrigste Probenkonzentration zu verdünnen. Geben Sie 5 millimolare DTT-Lösung in das Kernlysat und inkubieren Sie die Probe eine Stunde lang bei Raumtemperatur.

Fügen Sie dann 14 millimolare Iodacetamid aus frischer Brühe hinzu und inkubieren Sie das Lysat bei Raumtemperatur im Dunkeln für 30 Minuten. Verdünnen Sie das Lysat mit dem fünffachen Volumen von 50 Millimolar Ammoniumbicarbonat und fügen Sie dann Trypsin hinzu. Inkubieren Sie die Probe über Nacht bei 37 Grad Celsius.

Um eine individuell angefertigte Tischspitze pro Probe herzustellen, legen Sie eine Scheibe mit Festphasenextraktions-C18-Material in den Boden einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze. Geben Sie 50 Mikroliter Oligo R3 Reverse-Phased-Harz auf die C18-Scheibe, platzieren Sie dann die Tischspitze in einem Zentrifugationsadapter und platzieren Sie den Adapter in einem 1,5-Milliliter-Mikrofuge-Röhrchen. Geben Sie 100 Mikroliter 100 Prozent Acetonitril zu den Spitzen, um sie zu waschen.

Zentrifugieren Sie dann die Spitzen eine Minute lang bei 1000 mal g, um das Lösungsmittel zu entfernen. Äquilibrieren Sie die Spitzen mit 50 Mikrolitern 0,1 Prozent Trifluoressigsäure oder TFA. Drehen Sie sie dann erneut.

Fügen Sie der verdauten Proteinprobe 100 Prozent Ameisensäure hinzu, um den PH-Wert auf 2 bis 3 zu senken. Laden Sie dann die Probe auf eine speziell angefertigte Tischspitze und zentrifugieren Sie die Probe eine Minute lang bei 1000 mal g, bis die gesamte Probe durch die Spitze geht. Waschen Sie die gebundenen Peptide mit 50 Mikrolitern 0,1 Prozent TFA.

Nachdem die Probe eine Minute lang bei 1000-mal g gedreht wurde, eluieren Sie die Peptide, indem Sie 50 Mikroliter Elutionspuffer an die Tischspitze geben und eine Minute lang bei 1000-mal g zentrifugieren, um den Elutionspuffer aus der Spitze zu drücken. Verwenden Sie eine Vakuumzentrifuge mit einer Temperatur von 150 g und 1 bis 3 Kilopascal für eine Stunde, um die Probe zu trocknen. Um vernetzte RNA aus der Probe zu entfernen, suspendieren Sie das Pellet in 50 Mikrolitern 2x Nukleasepuffer

Messen Sie die Peptidkonzentration bei 280 Nanometern unter der Annahme von 1 Milligramm pro Milliliter Peptide für und A280 von 1. Verwenden Sie 2x Nukleasepuffer, um alle Proben auf ein Milligramm pro Milliliter oder auf die niedrigste Konzentration einzustellen, und bereiten Sie dann einen Mastermix aus 50 Mikrolitern Wasser plus 1 Mikroliter hochreiner Nuklease pro Probe vor. Kombinieren Sie 50 Mikroliter Peptidprobe mit 50 Mikrolitern Wasser plus Nuklease-Mastermix.

Inkubieren Sie die Probe dann eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Führen Sie schließlich die Nanoflüssigkeitschromatographie, die Massenspektrometrie und die Datenverarbeitung gemäß dem Textprotokoll durch. Diese Abbildung zeigt ein Vulkandiagramm eines RBR-ID-Ergebnisses von Maus-ESCs.

Peptide, die sich mit einer RNA-Erkennungsmotivdomäne überlappen, sind blau markiert und weisen sehr konsistente Depletionsniveaus auf. Ein RNA-bindendes Peptid aus HNRNPC ist rot hervorgehoben. Hier sehen Sie eine Heatmap von RBR-ID-Scores, die als Schätzung der RNA-Bindungswahrscheinlichkeit einer Proteinregion berechnet werden.

Der Score wird auf die Oberfläche der spleißosomalen Untereinheit U1-70k projiziert. Die hellrote Farbe in der Nähe des RNA-Kontakts, die durch die Kristallstruktur bestimmt wird, weist auf eine korrekte Identifizierung der Protein-RNA-Wechselwirkung hin. In dieser Abbildung wird TET2 als neuartiges RBP dargestellt und die RNA-Bindungsaktivität wird auf eine C-terminale Region abgebildet, indem der RBR-ID-Score entlang der primären Sequenz des Proteins aufgetragen wird.

Schließlich konnte die Notwendigkeit für diese neuartige RBR verifiziert werden, indem PAR-CLIP unter Verwendung der Wildtyp-Sequenz durchgeführt und das Signal mit dem einer Mutante verglichen wurde, der die vorhergesagte RBR fehlte. Einmal gemeistert, kann diese Technik in sieben bis acht Stunden über zwei Tage durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Vor dem Cross-Linking können Zellen mit verschiedenen Behandlungen stimuliert werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. wie die Differenzierung beginnt oder wie der Zellzyklus RNA-Protein-Interaktionen reguliert.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Extras mit vernetzten Protein-RNA-Komplexen generieren können, um Stellen von Protein-RNA-Wechselwirkungen mit der Massenspektrometrie zu identifizieren.