Targeted In Situ mutagenèse de Histone gènes dans la levure bourgeonnante

L’objectif global de cette procédure est de générer des mutations spécifiques dans les gènes d’histones à leurs emplacements chromosomiques endogènes dans les cellules de levure en bourgeonnement. Cette méthode peut être utilisée pour déterminer la contribution de résidus d’histones spécifiques dans une variété de processus qui utilisent la chromatine comme substrat, tels que la transcription de l’ADN, chaque combinaison. Le principal avantage de cette technique est que des gènes d’histones spécifiques peuvent être ciblés pour la mutagénèse malgré le fait que chez la levure, chaque protéine d’histones est codée par deux gènes non alléliques hautement homologues.

Après avoir généré une souche de levure avec le gène d’histone cible inactivé et remplacé par URA3, générez des produits de PCR pour deux fragments partiellement chevauchants du gène d’histone cible en mettant en place la réaction suivante pour la première moitié du gène. Pour la seconde moitié du gène, mettez en place une réaction PCR similaire à l’aide de différentes amorces. Placez les réactions dans un thermocycleur et configurez le programme suivant.

Exécutez 20 à 50 microlitres de réactions PCR sur un gel d’agarose à bas point de fusion à 0,9 % dans un tampon TBE. Ensuite, utilisez une lame de rasoir propre pour découper les produits PCR du gel et transférez chaque section dans un tube de 1,5 millilitre. Conservez les morceaux d’agarose à 20 degrés Celsius jusqu’au moment de l’utiliser.

Pour préparer l’ADN modèle pour les réactions de PCR afin de générer des produits PCR de taille normale, faites fondre les sections d’agarose dans un bloc de chaleur à 65 degrés Celsius pendant cinq minutes. Faites tourbillonner les tubes toutes les une à deux minutes pour aider à la fonte. Transférez une quantité définie d’agarose fondue de chaque échantillon dans un seul tube de microcentrifugation et mélangez le tube par vortex.

Utilisez-le comme modèle pour la PCR de fusion et conservez-le à 20 degrés Celsius jusqu’à utilisation. Pour amplifier une grande quantité de produit PCR de taille normale, configurez six réactions PCR chacune avec les réactifs suivants. Placez les tubes dans le thermocycleur et exécutez les réactions avec les paramètres suivants.

Concentrez les produits de PCR par précipitation et utilisez-les pour la cotransformation avec le plasmide de base conformément au protocole de texte. Pour dépister la perte du gène URA3 à la suite de l’intégration du produit PCR, répliquez les cellules sur plaque des plaques 1 à 20 en retirant le couvercle de la plaque et en pressant la plaque contenant les colonies sur du velours stérile. Transférez les cellules du velours dans une plaque à 5 FOA en appuyant sur la plaque sur le velours.

Incuber les plaques à 30 degrés Celsius pendant deux jours. Ensuite, inspectez soigneusement les plaques pour la croissance. Après avoir strié et incubé les colonies candidates sur des plaques YPD conformément au protocole textuel, répliquez chaque plaque de purification YPD sur une plaque YPD fraîche, sur une plaque de chute dépourvue d’uracile pour vérifier la perte du gène URA3, et sur une deuxième plaque de chute pour surveiller la présence ou l’absence du plasmide de base.

Après l’incubation, identifier une colonie de chaque échantillon candidat qui se développe sur la plaque de YPD, mais qui ne pousse pas sur l’une ou l’autre des plaques de chute. Reposez ces colonies sur des assiettes YPD fraîches. Comme par exemple pour une intégration correcte de l’allèle mutant à l’aide de la PCR selon le protocole texte.

Cette figure montre les résultats de la PCR pour la génération de deux fragments de HHT2 partiellement chevauchants avec les mutations souhaitées qui aboutissent finalement à un changement de codon AGA à GAA produisant une mutation R53E. Le résultat d’une réaction de PCR par fusion qui a généré les produits de PCR de taille normale est illustré ici. Les produits de PCR de taille normale contenaient respectivement 195 et 220 régions de paires de bases homologues aux régions en amont et en aval du cadre de lecture ouvert HHT2 pour favoriser la recombinaison homologue.

Dans cet exemple de transformation, les produits PCR de taille normale ont été cotransformés avec le plasmide marqué HIS-3 et les transformants ont été sélectionnés sur des plaques dépourvues d’histidine. Les colonies positives pour HIS ont ensuite été dépistées pour la résistance à la 5-FOA. Des exemples de candidats ainsi que des échantillons peu susceptibles de représenter les événements d’intégration souhaités sont présentés.

12 échantillons candidats ont été identifiés et soumis à une analyse PCR pour le remplacement du gène URA3 par des produits PCR mutants. Quatre candidats ont montré l’intégration d’un produit PCR au bon endroit. L’un de ces candidats est montré dans le couloir quatre.

La mutation AG2GA générant un nouveau site de restriction EcoR1, la digestion avec EcoR1 a été effectuée sur l’un des échantillons PCR d’intégration réussis pour démontrer que la séquence mutante avait bien été incorporée dans le génome. Une fois que tous les réactifs sont disponibles, il devrait être possible d’obtenir des cellules de levure hébergeant les mutations d’histones souhaitées dans un délai de 15 à 20 jours. Une fois que la mutation souhaitée a été générée dans la souche hôte, les cellules exprimant la protéine histone cible uniquement à partir du gène mutagénisé peuvent être obtenues par des croisements génétiques appropriés.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que les périmètres des réactions PCR peuvent devoir être ajustés en fonction de la nature des amorces spécifiques utilisées dans les expériences et des tailles attendues des produits PCR. Bien que cette procédure soit bien adaptée à la mutagenèse des gènes d’histones car elle permet de cibler un gène d’histone spécifique malgré la présence d’un deuxième gène non allélique hautement homologue, elle peut également être utilisée pour générer des mutations à d’autres emplacements génomiques. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer des mutations ciblées des histones NC2 chez la levure en bourgeonnement en utilisant une combinaison d’approches PCR et de techniques de génétique de la levure.

N’oubliez pas que l’exposition aux rayons UV peut être extrêmement dangereuse et que des lunettes de protection, des écrans et des vêtements doivent toujours être utilisés lorsque vous travaillez avec un transilluminateur UV. Portez également des gants, des lunettes de protection et des vêtements de protection tout au long de la plupart des étapes de la procédure.