Herstellung von dreidimensionalen Papierbasis Microfluidic Devices für Immunoassays

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, unseren Prozess zur Herstellung dreidimensionaler papierbasierter Geräte zu demonstrieren, den wir als Plattform für die Entwicklung von Point-of-Care-Immunoassays verwenden. Diese Methode bietet eine papierbasierte Mikrofluidik-Plattform mit einem zuverlässigen Herstellungsprozess, so dass Zeit und Mühe auf die Entwicklung von Assays statt auf das Design von Geräten verwendet werden können. Der Hauptvorteil unserer Technik besteht darin, dass sie es ermöglicht, viele Geräte parallel und in einer Menge vorzubereiten, die für akademische Forschungsprojekte wünschenswert ist.

Im Allgemeinen werden neue Benutzer mit dieser Methode Schwierigkeiten haben, da bei der Herstellung von Geräten viele Variablen zu berücksichtigen sind, wie z. B. die richtige Ausrichtung der Schichten. Fehler können dazu führen, dass Geräte nicht richtig funktionieren. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da es schwierig sein kann, sich die Montage vorzustellen, wenn nur die in den Manuskripten enthaltenen Details verwendet werden.

Bereiten Sie zunächst Schichten von qualitativem Filterpapier vor, indem Sie ein Standardblatt Papier in ein Standardpapierformat zuschneiden, um die Musterung mit einem Wachsdrucker zu erleichtern. Legen Sie ein geschnittenes Blatt Papier in das Druckerfach ein. Drucken Sie dann zuvor entworfene Schichten.

Schneiden Sie anschließend eine Reihe von Nylonmembranen mit einem Tischpapierschneider in Bögen und achten Sie dabei auf einen sorgfältigen Umgang mit der Nylonmembran, um ihre Unversehrtheit zu erhalten und vor Rissen zu schützen. Lagern Sie unbenutztes Material in einem Exsikkatorschrank, da Nylonmembranen feuchtigkeitsempfindlich sind. Drucken Sie mit einem Wachsdrucker ein Capture-Layer-Muster auf ein Blatt Kopierpapier und kleben Sie es an einen Leuchtkasten, der als Leitfaden für die Positionierung der Nylonmembran dient.

Legen Sie anschließend ein sauberes Blatt Kopierpapier auf das zuvor gedruckte Blatt Kopierpapier. Kleben Sie das saubere Blatt Papier an den Leuchtkasten, aber kleben Sie die beiden Blätter nicht zusammen. Legen Sie nun ein zugeschnittenes Blatt Nylonmembran auf das saubere Blatt Kopierpapier und achten Sie darauf, dass die Membran den bedruckten Bereich der unteren Schicht des Kopierpapiers bedeckt.

Klebe alle vier Seiten der Nylonmembran auf das leere Blatt Kopierpapier. Legen Sie ein Blatt Nylonmembran, das von dem darauf befestigten Kopierpapier getragen wird, in das Druckerfach mit manuellem Einzug ein. Drucken Sie dann jeweils ein Blatt Nylonmembran.

Kleben Sie die gedruckten Schichten auf einen Acrylrahmen, um eine gleichmäßige Erwärmung über und unter der Schicht zu erzielen, wenn sie in einen Schwerkraftkonvektionsofen gestellt wird. Lege nun die Schichten für 30 Sekunden bei 150 Grad Celsius in den Ofen, bis das Wachs in die Dicke des Papiers schmilzt. Nachdem Sie das Papier aus dem Ofen genommen haben, bestätigen Sie, dass das Wachs die Dicke des Papiers durchdrungen hat, indem Sie es umdrehen und auf Unvollkommenheiten im Design prüfen.

Entfernen Sie das Papier und die Nylonmembran vom Acrylrahmen. Entfernen Sie dann die Nylonmembran mit einem Papierschneider vom Stützblatt des Kopierpapiers. Mustern Sie doppelseitige Klebefolienbögen mit einem Roboter-Messerplotter mit zuvor vorbereiteten Designdateien.

Kleben Sie anschließend eine Musterschicht Papier, die mit Klebstoff hinterlegt werden muss, mit der bedruckten Seite nach unten auf einen Leuchtkasten. Ziehen Sie eine Seite der Schutzfolie von der Klebstoffplatte ab. Drücken Sie das Musterblatt Kleber und die Papierschicht zusammen.

Legen Sie dann das teilmontierte Gerät in einen Schutzschieber. Führen Sie anschließend die resultierende zweischichtige Anordnung durch eine automatisierte Laminiermaschine, um den Klebstoff und das Papier vollständig zusammenzudrücken und alle Lufteinschlüsse von den angrenzenden Schichten zu entfernen. Kleben Sie eine konjugierte Schicht so auf einen Acrylrahmen, dass die zu behandelnde hydrophile Zone aufgehängt ist und nicht mit dem Rahmen in Berührung kommt.

Geben Sie 2,5 Mikroliter BSA und ein X PBS in die hydrophile Zone auf der konjugierten Schicht. Nachdem Sie die Probe zwei Minuten lang bei Raumtemperatur trocknen gelassen haben, trocknen Sie sie fünf Minuten lang bei 65 Grad Celsius. Fügen Sie anschließend fünf Mikroliter von fünf kolloidalen Goldnanopartikeln hinzu, die an einen Anti-Beta-hCG-Antikörper konjugiert sind, und wiederholen Sie dann den Trocknungsvorgang.

Kleben Sie eine seitliche Kanalschicht so auf einen Acrylrahmen, dass die zu behandelnde hydrophile Zone aufgehängt ist und nicht mit dem Rahmen in Berührung kommt. Fügen Sie 10 Mikroliter Blockiermittel hinzu, um den Seitenkanal zu behandeln, und wiederholen Sie dann den gleichen Trocknungsvorgang, der für die konjugierte Schicht verwendet wurde. Kleben Sie anschließend eine Fangschicht auf einen Acrylrahmen, so dass die zu behandelnde hydrophile Zone aufgehängt ist und nicht mit dem Rahmen in Kontakt kommt.

Behandeln Sie die Erfassungsschicht mit fünf Mikrolitern Anti-Alpha-hCG-Antikörper. Nachdem Sie die Probe zwei Minuten lang bei Raumtemperatur trocknen gelassen haben, trocknen Sie sie acht Minuten lang bei 65 Grad Celsius. Fügen Sie zwei Mikroliter Blockiermittel hinzu und wiederholen Sie dann den gleichen Trocknungsvorgang, der für die Fangschicht verwendet wurde.

Kleben Sie die Waschschicht mit der bedruckten Seite nach oben an den Leuchtkasten. Wenn Ausrichtungslöcher verwendet werden, entfernen Sie diese mit einem handgeführten Lochwerkzeug aus den nachfolgenden Lagen. Entfernen Sie die Schutzfolie auf der Rückseite der Fangschicht, um den Klebstoff freizulegen.

Richten Sie die Erfassungsschicht über der Waschschicht aus, indem Sie die Ausrichtungslöcher als Leitfaden verwenden, drücken Sie dann die beiden Schichten zusammen und vermeiden Sie es, die hydrophilen Zonen zu berühren, um eine Kontamination oder Beschädigung des Geräts zu minimieren. Entfernen Sie anschließend die Schutzfolie auf der Rückseite der Inkubationsschicht, um den Klebstoff freizulegen. Richten Sie die Inkubationsschicht über der Erfassungsschicht aus, und drücken Sie sie zusammen.

Fahren Sie mit dem Hinzufügen von Layern auf diese Weise fort, bis alle aktiven Layer zusammengesetzt sind. Legen Sie nun das teilmontierte Gerät in einen Schutzschieber und befestigen Sie die Schichten mit einem Laminiergerät fest. Entfernen Sie die Schutzfolie auf der Rückseite der Waschschicht und kleben Sie die Tupfschicht auf die Unterseite des Geräts.

Schneiden Sie nach dem Laminieren, um die Montage des dreidimensionalen mikrofluidischen Geräts auf Papierbasis abzuschließen, die gewünschte Anzahl von Geräten mit einer Schere aus den Blättern der vollständig montierten Geräte aus. Geben Sie 20 Mikroliter einer positiven Kontrollprobe mit hCG-Puffer in die hydrophile Zone auf der Oberseite des Geräts. Sobald die Probe vollständig in das Gerät eingedrungen ist, fügen Sie 15 Mikroliter Waschpuffer hinzu.

Nachdem das erste Aliquot des Waschpuffers vollständig in das Gerät eingedrungen ist, fügen Sie ein zweites Aliquot von 15 Mikrolitern Waschpuffer hinzu. Um die Ergebnisse des Assays anzuzeigen, ziehen Sie die drei oberen Schichten des Geräts mit einer Pinzette ab, um die Erfassungsschicht freizulegen. Das Wachsdruckverfahren kann verwendet werden, um hydrophobe Barrieren in papierbasierten mikrofluidischen Geräten zu bilden, und erzeugt fluidische Wege mit reproduzierbaren Abmessungen, was für Assays mit wiederholbaren Leistungen und Dauerzeiten von entscheidender Bedeutung ist.

Die Leistungsfähigkeit des papierbasierten hCG-Immunoassays wurde durch die parallele Durchführung von 35 positiven und 35 negativen Assays demonstriert. Der Variationskoeffizient für jeden Datensatz wurde auf 1 % für Assays mit negativen Proben und 3 % für Assays mit positiven Proben bestimmt. Eine Fehlausrichtung zwischen den Schichten, die den Inkubationskanal und die Einfangzone umfassen, kann zur Entwicklung eines unregelmäßigen Musters im positiven Signal führen, was zu einer Fehlinterpretation des qualitativen Signals führen kann.

Wenn das Wachs nicht in ausreichender Menge gedruckt wird oder nicht vollständig durch die Dicke des Papiers schmilzt, kann die Integrität der resultierenden hydrophoben Barrieren beeinträchtigt werden und zu Undichtigkeiten im Gerät führen. Assays, die länger als erwartet dauern, können auf eine Fehlfunktion bei der Herstellung eines Geräts hinweisen. Papierbasierte mikrofluidische Geräte bieten Forschern eine vielseitige Plattform für die Entwicklung kostengünstiger analytischer Point-of-Care-Tests.

Es gibt zwar eine Reihe von Anwendungen, aber der Ansatz, den wir hier demonstrieren, führt zu einer allgemeinen Gerätearchitektur zur Durchführung von Immunoassays, die im Gesundheitswesen von entscheidender Bedeutung sind. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, während des Herstellungsprozesses und vor der Behandlung der Schichten mit teuren biochemischen Reagenzien auf Unvollkommenheiten zu prüfen. Einmal gemeistert, kann diese Methode, vom Drucken der Schichten bis zum Zusammenfügen der behandelten Schichten, verwendet werden, um in zwei Stunden ein Blatt mit funktionellen Immunoassays vorzubereiten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie dreidimensionale papierbasierte Geräte hergestellt werden, und sich wohl genug fühlen, um diese Plattform auf andere interessante Assay-Arten zuzuschneiden.