Auf Papier basierende Vorrichtungen zur Isolierung und Charakterisierung von extrazellulärer Vesikel

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, extrazelluläre Vesikel mit Hilfe einer papierbasierten Plattform zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst mit zwei Polystyrolplatten mit zirkulärer Zellulose laminiert wird, wobei Papierausschnitte auf einer Anordnung von registrierten Durchgangslöchern ausgerichtet sind. Der zweite Schritt besteht darin, Moleküle, die extrazelluläre Vesikel an die Papiertestzone binden würden, chemisch zu konjugieren.

Anschließend kann die biologische Probe direkt auf die Papiertestzone pipettiert werden, und nach dem Spülschritt werden extrazelluläre Vesikel isoliert. Der letzte Schritt besteht darin, eingefangene extrazelluläre Vesikel mittels Elektronenmikroskopie, Eliza oder Transkriptomanalyse zu charakterisieren. Letztendlich können Untergruppen extrazellulärer Vesikel aus nur 10 Mikroliter großen Serumproben gereinigt und konzentriert werden.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Ultra-Education besteht also darin, dass sie viel sanfter zusammenzubauen und einfach durchzuführen ist. Die Demonstration des Verfahrens wird ein Doktorand sein. Beginnen Sie mit zwei Blättern Polystyrol und erstellen Sie eine Anordnung von kreisförmigen Ausschnitten.

Jeder weist einen Durchmesser von weniger als fünf Millimetern mit einem manuellen Locher oder einem CAD-Cutterplotter auf. Schneiden Sie außerdem eine Reihe von Chromatographie-Papierscheiben mit fünf Millimetern Durchmesser mit einem Locher aus. Lege ein Styroporblatt auf die Bank und lege eine einzelne Papierscheibe auf jedes entsprechende Durchgangsloch.

Sandwichen Sie die Papierscheiben, indem Sie das zweite Blatt Polystyrol registrieren und überlagern. Überprüfen Sie die Gesamtausrichtung, bevor Sie das Sandwich in einem Thermolaminator verkleben. Beginnen Sie als Nächstes mit der chemischen Oberflächenmodifikation der Papierscheiben, indem Sie das laminierte Gerät in eine Plasmakammer einsetzen.

Aktivieren Sie die Papieroberfläche kurz mit Sauerstoffplasma, sobald das Kammervakuum freigesetzt wird, überführen Sie das Papiergerät sofort in die Zylinlösung und inkubieren Sie es 30 Minuten lang. Stellen Sie die Raumtemperatur ein. Entfernen Sie überschüssige Spuren, indem Sie das Gerät mit fünf Millilitern 200-prozentigem Ethanol spülen.

Inkubieren Sie dann das Gerät 15 Minuten lang mit A-G-M-B-S-Linkerlösung. Stellen Sie die Raumtemperatur ein. Entfernen Sie überschüssiges Linkermolekül mit reichlich Ethanolspülungen.

Inkubieren Sie das Gerät anschließend eine Stunde lang bei vier Grad Celsius mit Avadon und entfernen Sie das ungebundene Avadon mit einer Fünf-Milliliter-PBS-Wäsche. Das Gerät kann dann entweder mit dem Antikörperbindungsschritt fortfahren oder bei Bedarf vier Wochen lang bei vier Grad Celsius gelagert werden. Pipettieren Sie nach dem Aufstecken von Aden 10 Mikroliter Blockierlösung auf die freiliegenden Bereiche der Papierscheibe und inkubieren Sie das Papier 10 Minuten lang.

Wiederholen Sie bei Raumtemperatur die Zugabe von 10 Mikrolitern Blockierlösung und die 10-minütige Inkubation bei Raumtemperatur. Um die Biofunktionalisierung des freiliegenden Papiersubstrats abzuschließen, pipettieren Sie zwei weitere Male 10 Mikroliter der biotinylierten Einfangmoleküle auf die Discs und inkubieren Sie 10 Minuten lang. Bei Raumtemperatur für extrazelluläre Vesikel können die Einfangmoleküle der Wahl entweder Anti-CD 63-Antikörper oder ein Xin-Fünf-Antikörper sein. Wiederholen Sie das Pipettieren mit 10 Mikrolitern und den 10-minütigen Inkubationsvorgang.

Zwei weitere Male Nach dem Einfangen der Molekülbindung. Waschen Sie überschüssige Einheiten durch Pipettieren ab. 10 Mikroliter des entsprechenden Waschpuffers auf jede Papierscheibe geben.

Inkubieren Sie die Wäsche eine Minute lang bei Raumtemperatur und wiederholen Sie die 10-Mikroliter-Wasch- und eine Minute Inkubationsschritte noch zwei weitere Male. Das voll funktionsfähige Papiergerät ist nun bereit für die Isolierung extrazellulärer Vesikel aus Serum oder Kammerwasser für die Serumverarbeitung. Sammeln Sie 10 Milliliter peripheres Blut in einem Vacutainer-Röhrchen und drehen Sie das Röhrchen fünfmal vorsichtig um.

Platzieren Sie den Schlauch in einer vertikalen Position und warten Sie 30 Minuten. Stellen Sie Raumtemperatur ein und zentrifugieren Sie die Blutprobe 15 Minuten lang. Stellen Sie die Raumtemperatur ein.

Übertragen Sie die obere durchsichtige Serumschicht in ein sauberes Kunststoffröhrchen und entsorgen Sie die untere halbfeste Phase. Klären Sie das Serum 30 Minuten lang bei einer höheren Zentrifugationsgeschwindigkeit. Stellen Sie die Raumtemperatur ein.

Den Überstand in ein frisches Röhrchen umfüllen und feine Partikel entfernen, indem der Überstand durch einen 0,8-Mikrometer-Filter geleitet wird. Das resultierende gefilterte Serum kann sofort verwendet oder bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden. Sollen die extrazellulären Vesikel aus dem Humor extrahiert werden, sollte das Kammerwasser direkt durch invasive Verfahren von Patienten entnommen und die Proben bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden.

Bis zur Verwendung sind keine Filtrations- oder Klärungsschritte für Glaskörperproben erforderlich. Um extrazelluläre Vesikel entweder aus Serum oder Kammerwasser zu isolieren, pipettieren Sie fünf Mikroliter der biologischen Probe auf jede biofunktionalisierte Papiersubstratscheibe. Inkubieren Sie den Spot eine Minute lang bei Raumtemperatur und wiederholen Sie das Pipettieren mit fünf Mikrolitern und den einminütigen Inkubationsprozess.

Zwei weitere Male Nach der Affinitätsbindung spülen Sie ungebundene Vesikel ab, indem Sie zuerst 10 Mikroliter des entsprechenden Waschpuffers pipettieren. Inkubieren Sie den Puffer eine Minute lang bei Raumtemperatur und wiederholen Sie die 10-Mikroliter-Wäsche und die anschließende Inkubation. Treten Sie noch zwei weitere Male auf.

Die eingefangenen extrazellulären Vesikel sind nun bereit für die folgenden nachgeschalteten Assays, um die eingefangenen Vesikel auf der funktionalisierten Papierträgerpipette zu fixieren: 10 Mikroliter 0,5 x Karnofsky-Fixativ auf jede Papierscheibe. Lassen Sie die Vernetzungsreaktion 10 Minuten lang bei Raumtemperatur ablaufen und spülen Sie alle Scheiben fünf Minuten lang mit reichlich PBS aus. Entwässern Sie anschließend die Papiersubstrate, indem Sie die folgenden Waschgänge der Reihe nach anwenden.

Eine 35%Ethanol-Inkubation, zwei 50%Ethanol-Inkubationen, zwei 70%Ethanol-Inkubationen, zwei 95%Ethanol-Inkubationen und vier 100%Ethanol-Inkubationen. Lassen Sie die Ethanollösung bei jeder einzelnen Wäsche 10 Minuten lang bei Raumtemperatur auf den Papierscheiben inkubieren. Wenn das Papiergerät knochentrocken gesputtert wird, beschichten Sie die Proben mit einer 18-Nanometer-Schicht aus Palladiumgold in einem Metallsputter.

Führen Sie die Probe in ein Rasterelektronenmikroskop ein und führen Sie eine Mikroskopie bei fünf Kilovolt durch, um eine übermäßige Aufladung der biologischen Probe zu verhindern und eingefangene Vesikel über Immunoassays zu erkennen. Beginnen Sie damit, fünf Mikroliter Anti-CD neun Primärantikörper auf jede Papierscheibe zu geben und eine Minute lang bei Raumtemperatur zu inkubieren. Entfernen Sie alle ungebundenen Antikörper, indem Sie das Papiergerät mit 30 Millilitern PBS bei Raumtemperatur durch mechanisches Rühren waschen.

Pipettieren Sie anschließend fünf Mikroliter Meerrettichperoxidase-konjugierten Sekundärantikörper auf jedes Papier. Mit der Scheibe einscheiben und eine Minute bei Raumtemperatur inkubieren. Waschen Sie das Gerät mit 30 Millilitern PBS durch mechanisches Rühren, um ungebundene Sekundärantikörper zu entfernen.

Zum Schluss geben Sie fünf Mikroliter Farb- und metrische Substratmischung auf jedes Papier.Disc. Inkubieren Sie die Reaktion 20 bis 30 Minuten lang bei Raumtemperatur und scannen Sie die daraus resultierende Änderung der Sonderfarbenintensität mit einem Desktop-Scanner. Isolieren Sie zunächst einzelne Papierscheiben vom Bulk-Gerät, indem Sie mit einer Schere oder einer Rasierklinge Bereiche von überschüssigem Polystyrollaminat entfernen.

Legen Sie jede Papierscheibe in eine saubere 1,5-Milliliter-Mikrozentrifuge. Zwei Lys die eingefangenen Vesikel durch Zugabe von 265 Mikrolitern Lysepuffer. Und 35 Mikroliter PVP-basierter Polysaccharid-Entfernungsträger zu jedem Röhrchenwirbel kräftig.

Um ein vollständiges Vesikel, eine Lyse und eine Dislokation der freigesetzten RNA-Moleküle zu gewährleisten, geben Sie 30 Mikroliter Homogenatlösung in den Lysat-Wirbel, um das Röhrchen zu mischen und 10 Minuten lang auf Eis zu inkubieren. Als nächstes fügen Sie dem Lysat 330 Mikroliter saures Phenol-Chloroform-Gemisch hinzu, um eine korrekte phasenspezifische Trennung der RNA von den Proteinen und der DNA zu gewährleisten, und zwar mindestens 15 Sekunden lang pro Röhrchen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen fünf Minuten lang bei voller Geschwindigkeit.

Bei Raumtemperatur wird die RNA, die die obere wässrige Phase enthält, in ein frisches 1,5-Milliliter-Röhrchen überführt und die untere organische Phase verworfen. Geben Sie 1,25 wässrige Volumina im Wert von 100 % Ethanol zur RNA und wirbeln Sie sie kurz vortexen, um sie zu mischen. Tragen Sie dann die Mischung auf eine kommerzielle RNA-Feststoffextraktionssäule auf.

Zentrifugieren Sie das Röhrchen 15 Sekunden lang bei Raumtemperatur und verwerfen Sie die Durchflussfraktion. Waschen Sie die Säule mit 700 Mikrolitern Arbeitslösung. Nummer eins, zentrifugieren Sie das Röhrchen fünf bis 10 Sekunden lang und verwerfen Sie den Durchfluss.

Waschen Sie anschließend die Säule mit 500 Mikrolitern Arbeitslösung. Nummer zwei: Zentrifugieren Sie das Röhrchen fünf bis 10 Sekunden lang. Entsorgen Sie den Durchfluss und wiederholen Sie die Wäsche noch einmal.

Entfernen Sie das restliche Ethanol mit einem letzten einminütigen Schleudern bei Raumtemperatur und geben Sie die getrocknete Extraktionssäule in ein frisches 1,5-Milliliter-Röhrchen. Fügen Sie 100 Mikroliter vorgewärmtes R-RNA-freies Wasser hinzu. Zentrifugieren Sie das Röhrchen fünf bis 10 Sekunden lang bei voller Geschwindigkeit und entsorgen Sie bei Bedarf die obere Extraktionssäule.

Konzentrieren und reinigen Sie das RNA-EIT mit einem kommerziellen RNA-Cleanup-Kit unter Verwendung von fluoreszenzmarkiertem Biotin. Als Reporter für die Mobilisierung an der Oberfläche. Die Wirksamkeit und Spezifität des Papierfunktionalisierungsprotokolls kann durch den Vergleich der hohen Fluoreszenz auf der vernetzermodifizierten Oberfläche mit nicht funktionalisierten Papieroberflächen verglichen werden.

Darüber hinaus ermöglicht das ordnungsgemäß funktionalisierte Papiersubstrat, wenn das Reportermolekül durch einen biotinylierten Anti-CD-63-Antikörper ersetzt wird, eine höhere extrazelluläre Vesikeleinfangrate gegenüber einem Papiersubstrat mit Negativkontrolle. Wenn verschiedene Fängermoleküle auf Papiersubstraten immobilisiert werden, scheinen verschiedene Untergruppen extrazellulärer Vesikel unter Verwendung der Papiervorrichtung unterschiedliche Größenverteilungen zu zeigen. Man kann auch sowohl auf den intravesikalen RNA-Gehalt als auch auf die Häufigkeit von vesikelspezifischen Oberflächenproteinen testen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie den Anstieg an extrazellulären Les mit einem papierbasierten Gerät isolieren und versorgen können.