Absolute Quantifizierung von Aß _1-42 In CSF eine massenspektrometrische Referenzmessverfahren verwenden

Das übergeordnete Ziel dieses Referenzmessverfahrens ist es, die Messungen eines Betas im humanen Liquor zu harmonisieren. Diese Methode kann dazu beitragen, Assays für die Messung von Liquor a beta 42 zu standardisieren, der ein Biomarker für die zentrale Amyloid-Pathologie und ein neuropathologisches Kennzeichen der Alzheimer-Krankheit ist. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie gründlich validiert ist und keine Antikörper für die Quantifizierung von AVR 142 verwendet.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie der Alzheimer-Krankheit, da sie zur Harmonisierung von Assays und zur Erleichterung der Einführung allgemeiner Grenzwerte in klinischen Studien verwendet wird. Während diese Methode Einblicke in die Amyloid-Pathologie beim Menschen geben kann, kann sie auch auf andere sterbliche Organismen wie transgene Mäuse und nichtmenschliche Primaten angewendet werden, um neue Medikamente zu entwickeln. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da AVR 142 sehr hydrophob ist und leicht an Oberflächen wie Pipettenspitzen und Röhrchen haften kann.

Geben Sie zunächst 40 Mikroliter N15 a Beta-Peptid zu 0,46 Millilitern 20 % Acetonitril und 4 % konzentriertem Ammoniak in ein 0,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen. Mischen Sie die Peptidlösung eine Minute lang auf einem Vortex-Mischer. Geben Sie 50 Mikroliter der Peptidlösung zu 1,95 Millilitern 20 % Acetonitril und 4 % konzentriertem Ammoniak in ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Mischen Sie die Peptidlösung eine Minute lang auf einem Vortex-Mischer. Bereiten Sie als Nächstes sechs Kalibratorlösungen vor, indem Sie die entsprechenden Volumina jeder Lösung in Mikrozentrifugenröhrchen mischen. Nach dem Mischen der Kalibratorlösungen werden die endgültigen Kalibratoren in zweifacher Ausführung hergestellt, indem die entsprechenden Volumina der entsprechenden Kalibratorlösungen und des menschlichen Liquors in 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen gemischt werden.

Mischen Sie jede Lösung eine Minute lang auf einem Wirbelmischer. Um den internen Standard vorzubereiten, geben Sie zunächst 32 Mikroliter 13C a Beta-Peptid zu 1,968 Millilitern 20 % Acetonitril und 4 % konzentriertem Ammoniak in ein zwei Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen. Mischen Sie die Peptidlösung eine Minute lang auf einem Vortex-Mischer.

Geben Sie anschließend 0,1 Milliliter der Peptidlösung zu 4,9 Millilitern 20 % Acetonitril und 4 % konzentriertem Ammoniak in ein Fünf-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Mischen Sie die Peptidlösung eine Minute lang auf einem Vortex-Mischer. Zur Vorbereitung der Probe des Ansprechfaktors geben Sie 40 Mikroliter natives Beta-Peptid zu 0,46 Millilitern 20 % Acetonitril und 4 % konzentriertem Ammoniak in ein 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Nach dem Mischen fügen Sie 20 Mikroliter der Peptidlösung und 20 Mikroliter von vier Mikrogramm pro Milliliter, 15N ein Beta-Peptid zu 1,96 Millilitern 20 % Acetonitril und 4 % konzentriertem Ammoniak in einem Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen hinzu. Mischen Sie die Peptidlösung eine Minute lang auf einem Vortex-Mischer. Anschließend geben Sie 20 Mikroliter der Peptidlösung zu 0,38 Millilitern künstlichem Liquor in einem 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Mischen Sie nach der Vorbereitung der Duplikate jede Lösung eine Minute lang auf einem Wirbelmischer. Nachdem Sie die Proben auf einer Walze aufgetaut haben, geben Sie 0,18 Milliliter jedes Kalibrators, jedes Ansprechfaktors und jeder unbekannten Probe in eine Ein-Milliliter-Protein-96-Deep-Well-Platte, wobei Sie darauf achten, dass die Proben in oder in der Nähe des Bodens der Vertiefungen hinzugefügt werden. Geben Sie nun 20 Mikroliter internen Standards in jede Vertiefung, indem Sie einen Tropfen des Standards an der Seite der Vertiefung nahe der Oberfläche der Probe freisetzen, ohne die Pipettenspitze einzutauchen.

Geben Sie dann 0,2 Milliliter Guanadinhydrochlorid mit fünf Molaren in jede Vertiefung. Legen Sie die Probenplatte auf einen Mikrotiterplatten-Shaker und mischen Sie die Proben 45 Minuten lang bei 1100 U/min. Nach dem Mischen 0,2 Milliliter 4%ige Phosphorsäure in jede Vertiefung geben.

Legen Sie dann die Probenplatte auf den Mikrotiterplatten-Shaker und mischen Sie kurz bei 1000 U/min. Platzieren Sie eine Behälterwanne für Abfälle unter einer 96-Well-Festphasenextraktions- oder SPE-Platte mit gemischtem Kationenaustausch in der Verteilerkammer der Extraktionsplatte. Konditionieren Sie als Nächstes das SPE-Sorptionsmittel, indem Sie 0,2 Milliliter Methanol in jede Vertiefung geben.

Äquilibrieren Sie dann das Sorptionsmittel, indem Sie 0,2 Milliliter 4%ige Phosphorsäure in jede Vertiefung geben. Übertragen Sie mit einer Achtkanalpipette alle Proben von der Deep-Well-Platte auf die SPE-Platte. Waschen Sie anschließend das Sorptionsmittel zweimal, nachdem die Proben durchlaufen wurden, indem Sie 0,2 Milliliter 4%ige Phosphorsäure in jede Vertiefung geben.

Nachdem das Waschlösungsmittel aus dem Sorptionsmittel eluiert wurde, ersetzen Sie die Vorratswanne durch Röhrchen. Eluieren Sie nun die Probe aus dem Sorptionsmittel, indem Sie zwei 50-Mikroliter-Aloquetten mit 75 % Acetonitril und 10 % konzentriertem Ammoniak hinzufügen, wobei zu beachten ist, dass diese Lösung ein sehr geringes Vakuum erfordert, um das Sorptionsmittel zu passieren. Trocknen Sie die Eluate mit Hilfe einer Vakuumzentrifugation ohne Hitzeeinwirkung.

Zum Schluss verschließen Sie die Röhrchen und frieren sie bis zur Analyse bei 80 Grad Celsius ein. Die Kalibratoren liegen nahe an der Regressionslinie mit geringen Standardabweichungen. Wenn die Kalibrierung nicht linear ist, sollte der Lauf verworfen werden, und die Abweichung ist höchstwahrscheinlich auf falsche Pipettiertechniken und/oder Fehler bei der Verdünnung der Kalibratoren zurückzuführen.

Der Variationskoeffizient der Replikate sollte vorzugsweise unter 10 % liegen, wobei das native 15N und 13C ein Beta-Eluieren aus der LC-Säule gleichzeitig mit nahezu symmetrischen Peaks und ohne signifikantes Tailing auftreten. Für jeden Peak sollten mindestens 10 Messungen durchgeführt werden, die mit einer maximalen Injektionszeit in der Methode eingestellt werden können. Die Peptide können während der MS-Analyse gleichzeitig gemessen werden, es sei denn, die Empfindlichkeit der Methode ist suboptimal, wobei bei jeder Injektion nur die interessierenden Peptide gemessen werden sollten.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in vier Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Pipettenspitzen immer zu sättigen, bevor Sie die Peptidlösung übertragen. Es ist auch wichtig, Röhren mit so wenig Hohlraumvolumen wie möglich zu verwenden.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Alzheimer-Krankheit, um die Übereinstimmung mit anderen Methoden, wie z. B. der Amyloid-PET-Bildgebung, zu erforschen. Es wurde auch verwendet, um CSF-basierten Referenzmaterialien eine Beta-142-Konzentration zuzuweisen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Kalibratoren in humanem Liquor vorbereitet und die Festphasenextraktion vor der LCMS-Analyse verwendet, um die absolute Konzentration von Beta 142 in Proben zu messen.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichem Liquor extrem gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie Handschuhe, Schutzbrillen und andere Sicherheitsmaßnahmen getroffen werden sollten.