Absolute Quantifizierung von Aß

Das übergeordnete Ziel dieses Referenzmessverfahrens ist die Harmonisierung der Messung von Aβ in menschlichem CSF. Diese Methode kann zur Standardisierung von Assays zur Bestimmung von CSF-Aβ42 beitragen, das ein Biomarker für zentrale amyloide Pathologie und ein neuropathologisches Kennzeichen der Alzheimer-Krankheit ist. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie gründlich validiert ist und keine Antikörper zur Quantifizierung von Aβ42 verwendet.

Die Auswirkungen dieser Technik reichen bis hin zur Therapie der Alzheimer-Krankheit, da sie zur Harmonisierung von Assays und zur Einführung allgemeiner Grenzwerte in klinischen Studien eingesetzt werden könnte. Während diese Methode Einblicke in die Amyloid-Pathologie beim Menschen ermöglichen kann, lässt sie sich auch auf andere sterbliche Organismen wie transgene Mäuse und nichtmenschliche Primaten anwenden, um neue Wirkstoffe zu entwickeln. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da AVR 142 sehr hydrophob ist und leicht an Oberflächen wie Pipettenspitzen und Röhrchen haften kann.

Fügen Sie zunächst 40 µL des N15-markierten Beta-Amyloid-Peptids in einem 0,5-mL-Mikrozentrifugenröhrchen zu 0,46 mL 20 %iger Acetonitril-Lösung mit 4 % konzentrierter Ammoniaklösung hinzu. Mischen Sie die Peptidlösung eine Minute lang in einem Vortex-Mischer. Geben Sie anschließend 50 µL der Peptidlösung zu 1,95 mL 20 %iger Acetonitril-Lösung mit 4 % konzentrierter Ammoniaklösung in ein 2-mL-Mikrozentrifugenröhrchen hinzu.

Mischen Sie die Peptidlösung eine Minute lang auf einem Vortex-Mischer. Bereiten Sie anschließend sechs Kalibratorlösungen vor, indem Sie die entsprechenden Volumina jeder Lösung in Mikrozentrifugenröhrchen mischen. Nach dem Mischen der Kalibratorlösungen bereiten Sie die endgültigen Kalibratoren im Duplikat vor, indem Sie die entsprechenden Volumina der jeweiligen Kalibratorlösungen und menschlichen CSF in 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mischen.

Jede Lösung eine Minute lang im Vortex-Mischer vermischen. Zum Herstellen des internen Standards zunächst 32 Mikroliter 13C a beta Peptid zu 1,968 Millilitern 20%igen Acetonitrils und 4%iger konzentrierter Ammoniaklösung in einem zwei Milliliter fassenden Mikrozentrifugenröhrchen hinzufügen. Die Peptidlösung eine Minute lang im Vortex-Mischer vermischen.

Fügen Sie als Nächstes 0,1 Milliliter der Peptidlösung in einem 5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen zu 4,9 Milliliter 20 %iger Acetonitril- und 4 %iger konzentrierter Ammoniaklösung hinzu. Mischen Sie die Peptidlösung eine Minute lang auf einem Vortex-Mischer. Zum Herstellen der Probe für den Ansprechfaktor geben Sie 40 Mikroliter natives A-Beta-Peptid in einem 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen zu 0,46 Milliliter 20 %iger Acetonitril- und 4 %iger konzentrierter Ammoniaklösung hinzu.

Nach dem Mischen 20 Mikroliter der Peptidlösung und 20 Mikroliter von vier Mikrogramm pro Milliliter 15N-a-Beta-Peptid zu 1,96 Milliliter 20 %iger Acetonitril- und 4 %iger konzentrierter Ammoniaklösung in einem 2-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen hinzufügen. Die Peptidlösung eine Minute lang auf einem Vortex-Mischer mischen. Danach 20 Mikroliter der Peptidlösung zu 0,38 Milliliter künstlichem Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) in einem 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen hinzufügen.

Nach der Herstellung von Verdopplungen jede Lösung eine Minute lang mit einem Vortex-Mischer vermischen. Nach dem Auftauen der Proben auf einem Rollapparat je 0,18 Milliliter der einzelnen Kalibratoren, Reaktionsfaktoren und unbekannten Proben in eine 96-Loch-Tiefenmikrotiterplatte mit einer Fassung von einem Milliliter geben und sicherstellen, dass die Proben in oder nahe dem Boden der Vertiefungen hinzugefügt werden. Danach 20 Mikroliter der internen Standards in jede Vertiefung geben, indem ein Tropfen des Standards an der Wand der Vertiefung nahe der Probenoberfläche abgegeben wird, ohne die Pipettenspitze einzutauchen.

Dann fügen Sie 0,2 Milliliter fünf molarer Guanidinhydrochlorid-Lösung zu jedem Brunnen hinzu. Stellen Sie die Probenplatte auf einen Mikroplatten-Shaker und mischen Sie die Proben 45 Minuten lang bei 1100 U/min. Nach dem Mischen geben Sie 0,2 Milliliter 4 %iger Phosphorsäure zu jedem Brunnen hinzu.

Danach die Probenplatte auf den Mikroplatten-Shaker stellen und kurz bei 1000 U/min mischen. Ein Reservoir-Tablett für Abfall unter einer gemischt-modigen Kationenaustausch-96-Loch-Festphasenextraktionsplatte (SPE-Platte) in der Extraktionsplatten-Manifold-Kammer platzieren. Anschließend das SPE-Sorbens durch Zugabe von 0,2 Milliliter Methanol zu jedem Loch konditionieren.

Anschließend wird das Sorbens durch Zugabe von 0,2 Milliliter 4 %iger Phosphorsäure zu jedem Brunnen equilibriert. Unter Verwendung einer Acht-Kanal-Pipette werden alle Proben von der Tiefbrunnenplatte auf die SPE-Platte übertragen. Danach wird das Sorbens zweimal gewaschen, nachdem die Proben durchgelaufen sind, indem jeweils 0,2 Milliliter 4 %iger Phosphorsäure zu jedem Brunnen gegeben werden.

Nachdem das Waschmittel vom Sorptionsmittel eluiert ist, ersetzen Sie die Sammelschale durch Reagenzröhrchen. Eluieren Sie nun die Probe vom Sorptionsmittel, indem Sie zwei Portionen à 50 Mikroliter einer 75 %igen Acetonitril-Lösung mit 10 % konzentrierter Ammoniak zugeben. Beachten Sie, dass diese Lösung einen sehr geringen Unterdruck benötigt, um durch das Sorptionsmittel zu fließen. Trocknen Sie die Eluate durch Vakuumzentrifugation, ohne Wärmezufuhr.

Schließlich verschließen Sie die Röhrchen und frieren Sie diese bis zur Analyse bei 80 Grad Celsius ein. Die Kalibratoren liegen nahe an der Regressionsgeraden mit geringen Standardabweichungen. Falls die Kalibrierung nichtlinear ist, sollte der Durchlauf verworfen werden; die Abweichung ist höchstwahrscheinlich auf falsche Pipettiermethoden und/oder Verdünnungsfehler der Kalibratoren zurückzuführen.

Der Variationskoeffizient von Replikaten sollte vorzugsweise unter 10 % liegen. Das native 15N und 13C eines Beta eluiert gleichzeitig aus der LC-Säule mit nahezu symmetrischen Peaks und ohne signifikante Ausläufer. Für jeden Peak sollten mindestens 10 Messungen durchgeführt werden, die durch eine maximale Injektionszeit in der Methode angepasst werden können. Die Peptide können während der MS-Analyse gleichzeitig gemessen werden, es sei denn, die Empfindlichkeit der Methode ist suboptimal; in diesem Fall sollten für jede Injektion nur die Peptide von Interesse gemessen werden.

Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung innerhalb von vier Stunden durchgeführt werden. Während des Verfahrens ist es wichtig, stets die Pipettenspitzen mit der Peptidlösung zu sättigen, bevor diese übertragen wird. Außerdem ist es wichtig, Röhrchen mit möglichst geringem Totvolumen zu verwenden.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg dafür, dass Forscher im Bereich der Alzheimer-Krankheit die Übereinstimmung mit anderen Methoden, wie der Amyloid-PET-Bildgebung, untersuchen konnten. Sie wurde außerdem verwendet, um Beta-142-Konzentrationen Referenzmaterialien auf Basis von Liquor zuzuordnen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Kalibratoren in menschlichem Liquor hergestellt werden und wie die Festphasenextraktion vor der LC-MS-Analyse genutzt wird, um die absolute Konzentration von Beta-142 in Proben zu bestimmen.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichem Zerebrospinalflüssigkeit äußerst gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie Handschuhe, Schutzbrille und andere Sicherheitsvorkehrungen stets getroffen werden sollten, während dieser Vorgang durchgeführt wird.