Name: Absolute Quantifizierung von Aß 1-42 In CSF eine massenspektrometrische Referenzmessverfahren verwenden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Lernen Sie die absolute Quantifizierung von Aβ 1-42 in humanem Liquor mittels massenspektrometrischer Referenzmessung. Diese validierte Methode ohne Antikörper standardisiert Biomarker-Assays für die Alzheimer-Forschung.

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Diese Arbeit wurde im Auftrag der International Federation of Clinical Chemistry Working Group on CSF Proteins durchgeführt, die folgende Zusammensetzung hat: Kaj Blennow (Vorsitzender) und Henrik Zetterberg, Universität Göteborg, Schweden; Les Shaw und Magdalena Korecka, Universität Philadelphia, PA, USA; Ingrid Zegers, Institut für Referenzmaterialien und -messungen, Geel, Belgien; Piotr Lewczuk, Universitätsklinikum Erlangen, Deutschland; und Rand Jenkins, PPD Bioanalytical Laboratory, Richmond, VA, USA; Randall Bateman, Washington University, MO, USA; und H Vanderstichele, Innogenetics NV, Gent, Belgien. Diese Arbeit war auch Teil der Global Consortium for Biomarker Standardization CSF Reference Methods Working Group, die von Maria C. Carrillo, Ph.D., Senior Director, Medical & Scientific Relations, Alzheimer's Association, geleitet wird. Die Studie wurde vom Schwedischen Forschungsrat unterstützt (Zuschüsse #14002, #521-2011-4709 und #2013-2546); die Knut and Alice Wallenberg Foundation; Demensförbundet; und die Stiftungen von Emil und Wera Cornell, Aina Wallström und Mary-Ann Sjöblom, Gun und Bertil Stohne, Magnus Bergvall und Gamla Tjänarinnor.

Hinweis: Dieses Protokoll erfordert Aliquots von mindestens 50 &amp; mgr; l, mit einer Konzentration von 50 ug / ml für jedes Aß-Peptid, als Ausgangsmaterial. Die Aß-Peptide sollten in 20% Acetonitril (ACN) und 4% konzentrierter Ammoniaklösung in entionisiertem Wasser (v / v) und gelagert bei 80 ° C aufgelöst werden. Achtung: Siehe Tabelle 1 für Sicherheitshinweise. 1. Herstellung der Lösungen <ol><li> Herstellung von 100 ml 20% ACN und 4% konzentrierter Ammoniaklösung in entionisiertem Wasser (v / v) mit 20 ml ACN verdünnt und 4 ml konzentrierter Ammoniak (~ 25%) in deionisiertem Wasser. Stellen Sie das Endvolumen auf 100 ml mit VE-Wasser. Machen Sie jeden Tag frisch. </li><li> Vorbereitung 50 ml 5 M Guanidin-Hydrochlorid durch Auflösen von 26,08 g Guanidin-Hydrochlorid in deionisiertem Wasser auf ein Endvolumen von 50 mL. Aufbewahren bei 20 ° C und frisch monatlich machen. </li><li> Bereiten 200 ml 4% ige Phosphorsäure in deionisiertem Wasser (v /v) von 9,4 ml konzentrierter Phosphorsäure verdünnen (~ 85%) in destilliertem Wasser. Stellen Sie das Endvolumen auf 200 ml mit VE-Wasser. Im Kühlschrank aufbewahren und wöchentlich frisch zu machen. </li><li> Vorbereitung 50 ml 75% ACN und 10% konzentrierter Ammoniaklösung (v / v) in entionisiertem Wasser mit 37,5 ml ACN verdünnt und 5 ml konzentriertem Ammoniak (~ 25%) in deionisiertem Wasser. Stellen Sie das Endvolumen auf 50 ml mit VE-Wasser. Machen Sie jeden Tag frisch. </li><li> mindestens 2,5 ml menschlichen CSF für die Kalibratoren auftauen, von de-identifizierte übrig gebliebenen Proben aus der klinischen Routine-Analyse erhalten. </li><li> Bereiten künstlichen CSF, enthaltend 150 mM Na, 3,0 mM K 1,4 mM Ca, 0,8 mM Mg, 1,0 mM P, und 155 mM Cl in deionisiertem Wasser und fügen Rinderserumalbumin in einer Endkonzentration von 4 mg / mL. Nur 1 ml pro Analyse benötigt, sondern bereiten ein großes Volumen, aliquoten es und Speicher für den späteren Gebrauch. </li></ol> 2. Herstellung der Kalibratoren <ol><li> Bereiten 0,5 ml 4 &amp; mgr; g / mL 15 NAβ 1-42 Peptid durch Zugabe von 40 &amp; mgr; l von 50 &amp; mgr; g / mL 15 NAβ 142 bis 0,46 ml 20% ACN und 4% konzentriertem Ammoniak in einer 0,5-ml - Mikrozentrifugenröhrchen. Mit Hilfe eines Vortex-Mischer für 1 min. </li><li> Bereiten 2 ml 100 ng / ml 15 NAβ 1-42 Peptid durch Zugabe von 50 &amp; mgr; l der 4 &amp; mgr; g / mL 15 NAβ 142-1,95 ml 20% ACN und 4% konzentriertem Ammoniak in einem 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Mit Hilfe eines Vortex-Mischer für 1 min. </li><li> Bereiten Sie sechs Kalibratorlösungen (AF) durch die Volumina jeder Lösung in Tabelle 2 angegeben zu mischen. Verwenden Sie 0,5, 1,5 und 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Mit Hilfe eines Vortex-Mischer für 1 min. </li><li> Bereiten Sie die endgültige Kalibratoren (in zweifacher Ausfertigung) in 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen durch die entsprechenden Kalibrierlösungen Hinzufügen und menschlichen CSF gemäß Tabelle 3. Mischen auf einem Vortex-Mischer für 1 min. </li></ol> 3. Vorbereitung des internen Standards <ol><li> Bereiten 2 ml von 0,8 &amp; mgr; g / mL 13 CAβ 1-42 Peptid durch Zugabe von 32 &amp; mgr; l von 50 &amp; mgr; g / mL 13 CAβ 142 bis 1,968 ml 20% ACN und 4% konzentriertem Ammoniak in einem 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Mit Hilfe eines Vortex-Mischer für 1 min. </li><li> Bereiten 5 ml 16 ng / ml 13 CAβ 1-42 Peptid durch Zugabe von 0,1 ml von 0,8 ug / ml bis 4,9 ml 20% ACN und 4% konzentriertem Ammoniak in einem 5 ml - Mikrozentrifugenröhrchen. Mit Hilfe eines Vortex-Mischer für 1 min. </li></ol> 4. Vorbereitung der Responsefaktor Probe HINWEIS: Die Responsefaktor (RF) Bestimmung wird durchgeführt , um die Konzentration des markierten Peptids zur Kalibrierung (15 NAβ 1-42) verwendet zu bestimmen. Dies erfordert , dass die Konzentration des nativen Aß 1-42 Peptid wurde unter Verwendung von Aminosäureanalyse (AAA) bestimmt. Somit wird das Volumen und die Konzentration von nativen Aß 1-42 Peptid Aliquotsmüssen die Anforderungen der AAA zu erfüllen. <ol><li> Bereiten 0,5 ml 4 &amp; mgr; g / mL nativen (unmarkiert) A &amp; bgr; 1-42 durch Zugabe von 40 ul von 50 ug / ml nativem Aß 1-42 bis 0,46 ml 20% ACN und 4% konzentriertem Ammoniak in einer 0,5-ml - Mikrozentrifugenröhrchen. Mit Hilfe eines Vortex-Mischer für 1 min. </li><li> Bereiten Sie eine 2-ml 40 ng / ml Mischung aus einheimischen und 15 NAβ 1-42 durch Zugabe von 20 &amp; mgr; l von 4 ug / ml nativen Aß 1-42 und 20 &amp; mgr; l von 4 ug / ml 15 NAβ 1-42 bis 1,96 ml 20% ACN und 4% konzentriertem Ammoniak in einem 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Mit Hilfe eines Vortex-Mischer für 1 min. </li><li> In 20 ul der 40 ng / ml Mischung auf 0,38 ml künstlichem CSF in einem 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Bereiten Sie Duplikate und mischen auf einem Vortex-Mischer für 1 min. </li></ol> 5. Probenvorbereitung HINWEIS: auftauen die Proben auf einer Walze bei Raumtemperatur gemessen werden. <ol><li>In 0,18 ml jeder Kalibrator, Responsefaktor und unbekannten Probe (einschließlich der Qualitätskontrolle [QC] Proben, falls verwendet) zu einem 1 ml Protein 96-Deep-Well - Platte, nach 1 (eine vollständige Platte unter der Annahme verwendet wird ). Achten Sie darauf, um die Proben in oder in der Nähe, der Boden der Vertiefungen hinzuzufügen. </li><li> In 20 ul des internen Standards in jede Vertiefung (dh Kalibratoren, Responsefaktoren, QCs und Unbekannten); ist es entscheidend, den Tropfen an der Seite des Schachts nahe der Oberfläche der Probe zu lösen, ohne die Pipettenspitze eingetaucht. </li><li> In 0,2 ml 5 M Guanidin-Hydrochlorid in jede Vertiefung. </li><li> Platzieren Sie die Probenplatte auf einem Schüttler und mischen Sie die Proben für 45 Minuten bei 1100 Umdrehungen pro Minute. Die optimale Frequenz kann je nach Instrumentierung abweichen. Die Frequenz und Amplitude des Mischers so, dass die Lösungen gründlich gemischt und keine Tropfen des internen Standards oder CSF sind auf der Seite der Vertiefungen ungemischten gelassen. </li><li> In 0,2 ml 4% Phosphorsäurezu gut jeder. Vortex kurz mischen. </li></ol> 6. Festphasenextraktion HINWEIS: In jedem Waschen, Laden und Eluierungsschritte gelten die niedrigste mögliche Vakuum nach Zugabe der Lösung ist und schrittweise nach Bedarf erhöhen, um die Lösung zu laden oder zu eluieren. Deaktivieren Sie das Vakuum zwischen jedem Lade- und Elutionsschritt. <ol><li> Setzen Sie ein Vorratsfach für Abfall unter einem gemischten Modus, Kationenaustausch, 96-Well Festphasenextraktion (SPE) Platte in der Extraktionsplatte Verteilerkammer. </li><li> Erhaltung der SPE Sorbens durch Zugabe von 0,2 ml Methanol zu jeder Vertiefung. </li><li> Äquilibrieren das Sorbens durch Zugabe von 0,2 ml 4% ige Phosphorsäure zu jeder Vertiefung. </li><li> Übertragen Sie alle Proben (etwa 0,62 ml in jeder Vertiefung) aus dem Deep-Well-Platte an der SPE-Platte. Verwenden Sie einen Acht-Kanal-Pipette, wenn die Proben aus dem Deep-Well-Platte an der SPE-Platte zu übertragen; es ist nicht entscheidend, um die gesamte oder gleiche Volumina aller Proben zu übertragen, da die Proben einen Praktikanten enthaltenal-Standard, der für Variationen kompensieren. </li><li> Waschen des Sorbens, nachdem die Proben durch Zugabe von 0,2 ml 4% -iger Phosphorsäure in jede Vertiefung durchlaufen haben. </li><li> Nach dem Waschlösungsmittels aus dem Sorbens eluiert wurde, mit einer Sammelplatte oder Rohre, die die Vorratsfach ersetzen. </li><li> Eluieren der Probe aus dem Sorbens durch zweimalige Zugabe von 50 &amp; mgr; l von 75% ACN / 10% konzentriertem Ammoniak, und beachten Sie, dass diese Lösung eine sehr niedrige Vakuum erfordert durch das Sorbens zu passieren. Denken Sie daran, das Vakuum zwischen jeder Zugabe zu deaktivieren. <ol><li> Optional: Verschließen Sie die Sammelplatte oder Rohre und sie bei -80 ° C einfrieren. Entfernen Sie die Dichtung von der Sammelplatte oder Rohre vor 6.8.2 zu Schritt fortfahren. </li><li> Trocknen Sie die Eluate durch Verwendung von Vakuum-Zentrifugation (ohne Anwendung von Wärme); Dies kann von einem bis zu mehreren Stunden dauern, abhängig von der Vakuumzentrifuge. </li><li> Verschließen Sie die Behälter und frieren sie bei -80 ° C. </li></ol></li></ol> 7. Flüssige Chromatographie <ol><li> Vorbereitung der mobilen Phase A (5% ACN und 0,3% konzentriertem Ammoniak in entionisiertem Wasser [v / v]), B (4% deionisiertes Wasser und 0,1% konzentriertem Ammoniak in ACN [v / v]) und Nadelspülung (50% ACN und 4% konzentriertem Ammoniak in entsalztem Wasser [v / v]). <ol><li> Für 500 ml der mobilen Phase A, 25 ml ACN und 1,5 ml konzentrierter Ammoniak zu entionisiertem Wasser. Stellen Sie die endgültige Volumen auf 500 ml mit VE-Wasser. </li><li> Für 500 ml der mobilen Phase B, 500 &amp; mgr; l konzentrierter Ammoniak und 25 ml VE-Wasser zu ACN. Stellen Sie die endgültige Volumen auf 500 ml mit ACN. </li><li> Bereiten 250 ml Nadelspülung durch Zugabe von 120 ml ACN und 10 ml konzentriertem Ammoniak zu entionisiertem Wasser. Stellen Sie das Endvolumen auf 250 ml mit entionisiertem Wasser. </li><li> Setzen Sie den mobilen Phasen A und B und Nadelwaschflaschen öffnet in einem Ultraschallbad für 20 Minuten vor dem Gebrauch mit dem LC-System </li></ol></li><li> Man löst jede Probe mit 25 &amp; mgr; l von 20% ACN und 4% KonzenAmmoniaklösung ted und legen Sie sie auf einem Schüttler für 20 min. Zentrifuge nach unten den Proben und legen Sie sie in den Autosampler (halten bei 7 ° C). </li><li> Injizieren 20 ul der Probe auf einem 1 x 250 mm 2 Polystyrol-Divinylbenzol (Reversed Phase) monolithische Säule bei 50 ° C gehalten. <ol><li> Verwenden , um die LC - Gradienten in Tabelle 4 gezeigt mit einer Durchflussrate von 0,3 mL / min. Umleiten die ersten beiden und die letzten fünf Minuten zu verschwenden (post-Säule) unter Verwendung eines Umleitungsventil, um die Verunreinigung des Massenspektrometers zu reduzieren. </li></ol></li></ol> 8. massenspektrometrische Analyse HINWEIS: Diese Parameter für einen Quadrupol-Orbitrap Hybrid-Massenspektrometer mit aheated Elektrospray-Ionisierung Quelle ausgestattet verwendet wurden. <ol><li> Die Parameter für den Ionenquelle gemäß Tabelle 5. </li><li> Stellen Sie das MS - Gerät die 4+ Ladungszustände von nativen Aß 1-42 (1,129.48 Massen zu isolierenLadungs-Verhältnis [m / z]), 15 NAβ 1-42 (1.143,00 m / z) und 13 CAβ 1-42 (1,179.50 m / z) in der Quadrupol - Massenanalysator mit einer Isolationsbreite von 2,5 m / z. </li><li> Fragment, das die isolierten Peptide in der Kollisionszelle mit einer normalisierten Kollisionsenergie (NCE) von 17,0. Diese müssen möglicherweise für jedes Instrument, selbst des gleichen Typs abgestimmt werden (und insbesondere dann, wenn andere Arten von Instrumenten, wie beispielsweise einem Triple-Quadrupol-MS). </li><li> Notieren Sie sich die Fragmentspektren mit einer Auflösung von 17.500, mit einer automatischen Verstärkungsregelung Ziel von 2 x 10 5 Kosten und einem maximalen Einspritzzeit von 250 ms. </li></ol> 9. Datenverarbeitung <ol><li> Verwenden , um die Summe der Produkt - Ionen (mit einem Massentoleranz von ± 250 Millimasseneinheiten [MMU]) in Tabelle 6 die chromatographischen Bereiche für jedes Peptid berechnet. Beachten Sie, dass die Ionenarten und Zahlen werden nur für die native Aß gezeigt <sub&gt; 1-42 Produkt - Ionen, da sie die gleichen für beide 15 NAβ 1-42 und 13 CAβ 1-42. </li><li> Bestimmen Sie die durchschnittliche Reaktionsfaktor der beiden Reaktionsfaktor Proben durch die Fläche unter der Kurve dividiert (chromatographischen Peak) von 15 NAβ 1-42 mit der Fläche unter der Kurve von nativen Aß 1-42. </li><li> Stellen Sie die Konzentration des 15 NAβ 1-42 für die Kalibrierung verwendet , indem er mit dem Reaktionsfaktor in Schritt 9.2 berechnet multipliziert wird . </li><li> Einer Eichkurve , die durch die Flächenverhältnisse von 15 NAβ 1-42 bis 13 CAβ 1-42 von den beiden Sätzen von Kalibratoren gegen die Konzentration aufgetragen ist . </li><li> Berechnen der Steigung und Achsenabschnitt der Kalibrierungskurve lineare Regression verwendet wird. </li><li> Berechnen Sie den Flächenverhältnis von nativen Aß 1-42 auf den internen Standard (13 CAβ 1-42) für unbekannten Proben. </li><li> Extrapolation der Konzentration von unbekannten Proben aus der Kalibrierungskurve unter Verwendung der Steigung und Achsenabschnitt in Schritt 9.5. </li></ol>

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JP und EP berichten keine Offenlegungen. HZ war Mitglied des Beirats von Roche Diagnostics, Eli Lilly und Pharmasum Therapeutics. KB war als Berater oder Mitglied des Beirats von Fujirebio Europe, IBL International und Roche Diagnostics tätig. HZ und KB sind Mitbegründer von Brain Biomarker Solutions in Göteborg AB, einem auf GU Venture basierenden Plattformunternehmen an der Universität Göteborg.

Für das Verfahren beschrieben, stattdessen eine Ersatzmatrix zu verwenden, haben wir den Surrogat - Analyt - Ansatz 13, 14, 15, 16, die Kalibrierung im menschlichen CSF ermöglicht. Der Ersatz Analyt Ansatz beinhaltet zwei verschiedene isotopenmarkierten Standards. Eine (15 NAβ 142) wird verwendet , um die Kalibrierungskurve in menschlichen CSF zu erzeugen, während eine an...

Alzheimer-Krankheit (AD) ist die häufigste Form der Demenz und betrifft etwa 35 Millionen Menschen weltweit 1. Die neuropathologischen Kennzeichen der Krankheit weit verbreitet in den Mittelpunkt der AD Pathogenese zu liegen glaubte , sind intrazelluläre Neurofibrillen von hyperphosphorylated Tau - Protein 2 und extrazellulären Plaques , bestehend aus aggregierten Amyloid-beta (Aß) Peptide 3. Im Einklang mit dieser Situation hat die Beurteilung der Plaque Pathologie in vivo durch Biomarker vor kurzem in den Forschungs diagnostischen Kriterien für AD 4 aufgenommen. Für CSF Messungen von Aß 1-42, sind mehrere Immunoassays zur Verfügung und werden in vielen klinischen Laboratorien 5 verwendet. Die Konzentration von A &amp; bgr; 1-42 in CSF beträgt ungefähr 50% niedriger in AD - Patienten als in der kognitiv normalen älteren Personen, was die Abscheidung des Peptids in Plaques im br6 ain, 7. Diese Biomarker sind hauptsächlich unter Verwendung von Immunoassays analysiert (dh Antikörper-basierte Techniken), aber diese Assays können durch Matrixeffekte 8 beeinflusst werden. Die Verwendung von Immuntests auf verschiedenen Technologieplattformen und den Mangel an Standardisierung Assay 9, 10 aufgrund der Einführung von globalen abgeschnittene Konzentrationen schwer 11, 12. Eine analytisch validierte RMP würde die einheitliche Kalibrierung von verschiedenen Assay-Plattformen ermöglichen, idealerweise in eine bessere Vergleichbarkeit zwischen den Analyseplattformen zurückgehen und in eine bessere Kontrolle der Faktoren, die die Gesamtmess Variabilität beitragen. Die absolute Quantifizierung von Aß 1-42 des entwickelten LC-MS / MS - Verfahren überwindet viele der Probleme im Zusammenhang mit dem Antikörper-basierten techniques. Das Verfahren, aufgeführt als RMP durch den Gemischten Ausschuss für Rückverfolgbarkeit in der Labormedizin (JCTLM Datenbank - Identifizierungsnummer C11RMP9), werden verwendet , um die absolute Konzentration von Aß 1-42 in zertifiziertes Referenzmaterial (CRM) , um zu bestimmen CSF Aß 1 zu harmonisieren -42 Messungen über Techniken und Analyseplattformen. Die beschriebene Workflow sollte für die Entwicklung der Kandidatenreferenzverfahren für Peptide und Proteine ​​in anderen Bereichen der Medizin von Bedeutung sein.

<table><tbody><tr><td>Eppendorf Protein LoBind Mikrozentrifugenröhrchen, 0,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022431081</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Protein LoBind Mikrozentrifugenröhrchen, 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022431081</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Protein LoBind Mikrozentrifugenröhrchen, 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022431102</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Protein LoBind Mikrozentrifugenröhrchen, 5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030 108.310</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Protein LoBind Deepwell Plates 96</td><td>Eppendorf</td><td>951032905</td><td></td></tr><tr><td>Micronic 0,75 mL Polypropylen-Röhrchen, V-Bottom</td><td>Micronic</td><td>MPW32071BC3</td><td>Röhrchen werden zum Sammeln von SPE-Eluat verwendet, aber es können auch andere Sammelvorrichtungen verwendet werden, wie z. B. 96-Well-Platten.</td></tr><tr><td>Micronic Split TPE Capcluster für 96 Ind. Röhrchen</td><td>Micronic</td><td>MP53026</td><td>Kappen für Micronic Röhrchen.</td></tr><tr><td>Micronic Loborack-96 weiß mit hoher Abdeckung mit Strichcode</td><td>Micronic</td><td>MPW51015BC3</td><td>Halterung für Micronic Röhren.</td></tr><tr><td>Biohit Optifit Spitzen 1,2 mL</td><td>Sartorius</td><td>791210</td><td>Wird verwendet, um bis zum Boden der LoBind Deepwell-Platten (96-Well) zu reichen. Andere schmale Tipps könnten auch funktionieren.</td></tr><tr><td>Waters Oasis MCX 96-Brunnen & Mikro; Elutionsplatte</td><td>Wasser</td><td>186001830BA&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Waters Plate Verteiler Reservoirwanne</td><td>Wässer</td><td>WAT058942</td><td></td></tr><tr><td>Wässer Extraktionsplatte Verteiler für Oasis 96-Well Platten</td><td>Wässer</td><td>186001831</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumhydroxidlösung, puriss. p.a., reag. ISO, reag. Ph. Eur., ~25% NH3 Basis</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30501-1L-D</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril, Fern-UV HPLC Gradient Grade, 2,5 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>A/0627/17X</td><td></td></tr><tr><td>ortho-Phosphorsäure 85%, ACS,ISO,Reag. Ph Eur</td><td>Merck Millipore</td><td>1005731000</td><td></td></tr><tr><td>Guanidinhydrochlorid, 500 g</td><td>Thermo Scientific</td><td>24110</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Q-exactive Hybrid Quadrupol Orbitrap Massenspektrometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFALGMAZR</td><td>Mit mitgeliefertem Dionex Ultimate 3000 LC & Autosampler.</td></tr><tr><td>Dionex ProSwift RP-4H Monolith-Säule (1,0 x 250 mm)</td><td>Dionex</td><td>066640</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin, lyophilisiertes Pulver, geeignet für (für die Molekularbiologie), nicht acetyliertes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6917</td><td></td></tr><tr><td>Beta-Amyloid (1-42), Ultra Pure, TFA</td><td>rPeptid</td><td>A-1002-2</td><td></td></tr><tr><td>15N Beta-Amyloid (1-42), einheitlich markiertes</td><td>rPeptid</td><td>A-1102-2</td><td></td></tr><tr><td>13C Beta-Amyloid (1-42),</td> einheitlich <td>markiertes rPeptid</td><td>A-1106-2</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotiterplattenschüttler, TiMix 2</td><td>Edmund B&uuml; HLER</td><td>6110 000</td><td></td></tr></tbody></table>

absolute quantifizierung von aß<sub&gt; 1-42</sub&gt; in csf eine massenspektrometrische referenzmessverfahren verwenden

Absolute Quantification of A&#946;1-42 in CSF Using a Mass Spectrometric Reference Measurement Procedure

Die Alzheimer-Krankheit (AD) ist die häufigste neurodegenerative Erkrankung bei älteren Menschen und macht 60-80% aller Demenzfälle aus. Derzeit basiert die Diagnose von AD auf kognitiven Tests und Untersuchungen des mentalen Zustands, aber das Peptid Amyloid-beta (Aβ) in der Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) wird zunehmend in klinischen Studien und Umgebungen verwendet. Wie bei den meisten Protein- und Peptid-Biomarkern erfolgt die Quantifizierung mit antikörperbasierten Techniken, wie z. B. dem Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA). Die Variabilität innerhalb und zwischen den Laboratorien dieser Assays erschwert jedoch die Verwendung als diagnostischer Marker in der klinischen Routine.
Es wurde ein Antikörper-unabhängiges Referenzmessverfahren (RMP) entwickelt, das auf der Festphasenextraktion (SPE) und der Flüssigchromatographie (LC)-Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) basiert, bei der stabile, isotopenmarkierte Aβ-Peptide als interne Standards verwendet wurden, die eine absolute Quantifizierung ermöglichen. Für die Messungen wurde ein hochauflösendes Quadrupol-Orbitrap-Hybridinstrument verwendet. Die Methode ermöglicht die Quantifizierung von Liquor Aβ1-42 zwischen 150-4.000 pg/ml.

Die Platte Setup in Abbildung 1 für eine volle Platte der Proben verwendet. Wenn weniger unbekannte Proben zu analysieren, sollte der zweite Kalibrator, RF, und QC-Sets nach der ersten Hälfte der unbekannten Proben platziert werden. Wie in Figur 2 zu sehen ist , sind die Kalibratoren nahe der Regressionslinie mit geringen Standardabweichungen. Diese Methode hat einen geringeren Grad an Quantif...

Es wird ein Referenzmessverfahren für die absolute Quantifizierung von Aβ1-42 in humanem Liquor beschrieben, das auf Festphasenextraktion und Flüssigkeitschromatographie und Tandem-Massenspektrometrie basiert.

Absolute Quantifizierung von Aß<sub&gt; 1-42</sub&gt; In CSF eine massenspektrometrische Referenzmessverfahren verwenden

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disease among the elderly and accounts for 60-80% of all cases of dementia. Currently, the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Referenzmessverfahrens ist die Harmonisierung der Messung von Aβ in menschlichem CSF. Diese Methode kann zur Standardisierung von Assays zur Bestimmung von CSF-Aβ42 beitragen, das ein Biomarker für zentrale amyloide Pathologie und ein neuropathologisches Kennzeichen der Alzheimer-Krankheit ist. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie gründlich validiert ist und keine Antikörper zur Quantifizierung von Aβ42 verwendet.Die Auswirkungen dieser Technik reichen bis hin zur Therapie der Alzheimer-Krankheit, da sie zur Harmonisierung von Assays und zur Einführung allgemeiner Grenzwerte in klinischen Studien eingesetzt werden könnte. Während diese Methode Einblicke in die Amyloid-Pathologie beim Menschen ermöglichen kann, lässt sie sich auch auf andere sterbliche Organismen wie transgene Mäuse und nichtmenschliche Primaten anwenden, um neue Wirkstoffe zu entwickeln. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da AVR 142 sehr hydrophob ist und leicht an Oberflächen wie Pipettenspitzen und Röhrchen haften kann.Fügen Sie zunächst 40 µL des N15-markierten Beta-Amyloid-Peptids in einem 0,5-mL-Mikrozentrifugenröhrchen zu 0,46 mL 20 %iger Acetonitril-Lösung mit 4 % konzentrierter Ammoniaklösung hinzu. Mischen Sie die Peptidlösung eine Minute lang in einem Vortex-Mischer. Geben Sie anschließend 50 µL der Peptidlösung zu 1,95 mL 20 %iger Acetonitril-Lösung mit 4 % konzentrierter Ammoniaklösung in ein 2-mL-Mikrozentrifugenröhrchen hinzu.Mischen Sie die Peptidlösung eine Minute lang auf einem Vortex-Mischer. Bereiten Sie anschließend sechs Kalibratorlösungen vor, indem Sie die entsprechenden Volumina jeder Lösung in Mikrozentrifugenröhrchen mischen. Nach dem Mischen der Kalibratorlösungen bereiten Sie die endgültigen Kalibratoren im Duplikat vor, indem Sie die entsprechenden Volumina der jeweiligen Kalibratorlösungen und menschlichen CSF in 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mischen.Jede Lösung eine Minute lang im Vortex-Mischer vermischen. Zum Herstellen des internen Standards zunächst 32 Mikroliter 13C a beta Peptid zu 1,968 Millilitern 20%igen Acetonitrils und 4%iger konzentrierter Ammoniaklösung in einem zwei Milliliter fassenden Mikrozentrifugenröhrchen hinzufügen. Die Peptidlösung eine Minute lang im Vortex-Mischer vermischen.Fügen Sie als Nächstes 0,1 Milliliter der Peptidlösung in einem 5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen zu 4,9 Milliliter 20 %iger Acetonitril- und 4 %iger konzentrierter Ammoniaklösung hinzu. Mischen Sie die Peptidlösung eine Minute lang auf einem Vortex-Mischer. Zum Herstellen der Probe für den Ansprechfaktor geben Sie 40 Mikroliter natives A-Beta-Peptid in einem 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen zu 0,46 Milliliter 20 %iger Acetonitril- und 4 %iger konzentrierter Ammoniaklösung hinzu.Nach dem Mischen 20 Mikroliter der Peptidlösung und 20 Mikroliter von vier Mikrogramm pro Milliliter 15N-a-Beta-Peptid zu 1,96 Milliliter 20 %iger Acetonitril- und 4 %iger konzentrierter Ammoniaklösung in einem 2-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen hinzufügen. Die Peptidlösung eine Minute lang auf einem Vortex-Mischer mischen. Danach 20 Mikroliter der Peptidlösung zu 0,38 Milliliter künstlichem Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) in einem 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen hinzufügen.Nach der Herstellung von Verdopplungen jede Lösung eine Minute lang mit einem Vortex-Mischer vermischen. Nach dem Auftauen der Proben auf einem Rollapparat je 0,18 Milliliter der einzelnen Kalibratoren, Reaktionsfaktoren und unbekannten Proben in eine 96-Loch-Tiefenmikrotiterplatte mit einer Fassung von einem Milliliter geben und sicherstellen, dass die Proben in oder nahe dem Boden der Vertiefungen hinzugefügt werden. Danach 20 Mikroliter der internen Standards in jede Vertiefung geben, indem ein Tropfen des Standards an der Wand der Vertiefung nahe der Probenoberfläche abgegeben wird, ohne die Pipettenspitze einzutauchen.Dann fügen Sie 0,2 Milliliter fünf molarer Guanidinhydrochlorid-Lösung zu jedem Brunnen hinzu. Stellen Sie die Probenplatte auf einen Mikroplatten-Shaker und mischen Sie die Proben 45 Minuten lang bei 1100 U/min. Nach dem Mischen geben Sie 0,2 Milliliter 4 %iger Phosphorsäure zu jedem Brunnen hinzu.Danach die Probenplatte auf den Mikroplatten-Shaker stellen und kurz bei 1000 U/min mischen. Ein Reservoir-Tablett für Abfall unter einer gemischt-modigen Kationenaustausch-96-Loch-Festphasenextraktionsplatte (SPE-Platte) in der Extraktionsplatten-Manifold-Kammer platzieren. Anschließend das SPE-Sorbens durch Zugabe von 0,2 Milliliter Methanol zu jedem Loch konditionieren.Anschließend wird das Sorbens durch Zugabe von 0,2 Milliliter 4 %iger Phosphorsäure zu jedem Brunnen equilibriert. Unter Verwendung einer Acht-Kanal-Pipette werden alle Proben von der Tiefbrunnenplatte auf die SPE-Platte übertragen. Danach wird das Sorbens zweimal gewaschen, nachdem die Proben durchgelaufen sind, indem jeweils 0,2 Milliliter 4 %iger Phosphorsäure zu jedem Brunnen gegeben werden.Nachdem das Waschmittel vom Sorptionsmittel eluiert ist, ersetzen Sie die Sammelschale durch Reagenzröhrchen. Eluieren Sie nun die Probe vom Sorptionsmittel, indem Sie zwei Portionen à 50&nbsp;Mikroliter einer 75&nbsp;%igen Acetonitril-Lösung mit 10&nbsp;% konzentrierter Ammoniak zugeben. Beachten Sie, dass diese Lösung einen sehr geringen Unterdruck benötigt, um durch das Sorptionsmittel zu fließen. Trocknen Sie die Eluate durch Vakuumzentrifugation, ohne Wärmezufuhr.Schließlich verschließen Sie die Röhrchen und frieren Sie diese bis zur Analyse bei 80 Grad Celsius ein. Die Kalibratoren liegen nahe an der Regressionsgeraden mit geringen Standardabweichungen. Falls die Kalibrierung nichtlinear ist, sollte der Durchlauf verworfen werden; die Abweichung ist höchstwahrscheinlich auf falsche Pipettiermethoden und/oder Verdünnungsfehler der Kalibratoren zurückzuführen.Der Variationskoeffizient von Replikaten sollte vorzugsweise unter 10 % liegen. Das native 15N und 13C eines Beta eluiert gleichzeitig aus der LC-Säule mit nahezu symmetrischen Peaks und ohne signifikante Ausläufer. Für jeden Peak sollten mindestens 10 Messungen durchgeführt werden, die durch eine maximale Injektionszeit in der Methode angepasst werden können. Die Peptide können während der MS-Analyse gleichzeitig gemessen werden, es sei denn, die Empfindlichkeit der Methode ist suboptimal; in diesem Fall sollten für jede Injektion nur die Peptide von Interesse gemessen werden.Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung innerhalb von vier Stunden durchgeführt werden. Während des Verfahrens ist es wichtig, stets die Pipettenspitzen mit der Peptidlösung zu sättigen, bevor diese übertragen wird. Außerdem ist es wichtig, Röhrchen mit möglichst geringem Totvolumen zu verwenden.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg dafür, dass Forscher im Bereich der Alzheimer-Krankheit die Übereinstimmung mit anderen Methoden, wie der Amyloid-PET-Bildgebung, untersuchen konnten. Sie wurde außerdem verwendet, um Beta-142-Konzentrationen Referenzmaterialien auf Basis von Liquor zuzuordnen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Kalibratoren in menschlichem Liquor hergestellt werden und wie die Festphasenextraktion vor der LC-MS-Analyse genutzt wird, um die absolute Konzentration von Beta-142 in Proben zu bestimmen.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichem Zerebrospinalflüssigkeit äußerst gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie Handschuhe, Schutzbrille und andere Sicherheitsvorkehrungen stets getroffen werden sollten, während dieser Vorgang durchgeführt wird.

absolute-quantification-a1-42-csf-using-mass-spectrometric-reference

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Absolute Quantifizierung von Aß

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