Name: Zwei Algorithmen für den Hochdurchsatz und Multi-parametrischer Quantifizierung Drosophila Neuromuskuläre Junction Morphology (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Lernen Sie zwei Bildanalysealgorithmen zur automatischen Quantifizierung von Drosophila-Neuromuskulären Junctions. Diese Methode ermöglicht hochdurchsatzfähige, objektive Morphologieanalysen für Neurobiologie-Forschung.

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Wir erkennen die Vienna Drosophila Resource Center und Bloomington Drosophila Stock Center (NIH P40OD018537) für Drosophila - Stämmen bereitzustellen. Wir danken Jack Fransen vom Mikroskopische Imaging Center für kompetente Unterstützung bei der Bildgebung. Diese Studie wurde von VIDI und TOP Zuschüssen unterstützt (917-96-346, 912-12-109) von der niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO), die von zwei DCN / Radboud University Medical Center PhD Stipendien vom Deutschen Netzwerk Mentale Retardierung finanziert durch das NGFN + Programm des Bundesministeriums für Bildung und Forschung (BMBF) und durch die FP7 der Europäischen Union integrierter Großnetzwerke Gencodys (HEALTH-241995) zu AS. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerhebung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zu veröffentlichen.

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offen zu legen.

&quot;Drosophila NMJ Morphometrics&quot; und &quot;Drosophila NMJ bouton Morphometrics&quot; sind leistungsfähige Werkzeuge für die Forscher interessiert in Synapse Morphologie beurteilen. Manuelle Bewertung der NMJ Parameter ist mühsam; es wird geschätzt, dass die Makros einen erfahrenen Forscher bis zu 15 min sparen würde / NMJ verbrachte auf manuelle Bildsegmentierung. Mit 1.59 Dutzende von ausgewerteten Synapsen pro Zustand oder Genotyp, das summiert sich schnell auf erhebliche Mengen an Zeit gespart, auch in kleinen Studien. Bei großen Bildschirmen durchgeführt wird, die Verstärkung Hochdurchsatzanalyse der Verwendung im Vergleich zur manuellen Bewertung und Quantifizierung kann immens sein. Zusätzlich zu der erhöhten Durchsatz bieten die Makros leicht objektive Analyse; sie schließen persönliche Vorurteile, die sonst geblendet Experimente sowie zwischenmenschliche Unterschiede erfordern, die auftreten, wenn mehrere Forscher bei der Analyse beteiligt sind. Schließlich bieten die Makros eine empfindliche und genaue einalysis von NMJ Funktionen, die Identifizierung von synaptischen Regler ermöglicht, die eher subtil verursachen als dramatische NMJ Defekte und bisher nicht gewürdigt blieb durch das Auge des Forschers. Detaillierte Informationen über Validierungsverfahren und die in den Makros verwendet Algorithmen sind in der Veröffentlichung Nijhof et al. 17. Die Funktionalität der Makros validiert wurde entsprechend 4. morphologische Merkmale von Drosophila melanogaster NMJs Anschließend an Muskel zu messen, wurde gezeigt , dass die Makros auch geeignet waren Synapsen in anderen Muskeln in diesem Organismus zu analysieren. Es ist wahrscheinlich , dass die Makros können auch mit ähnlicher Struktur in anderer Spezies, einschließlich anderen Drosophila - Spezies und weitere Insekten zu messen morphologische Parameter der NMJ verwendet werden. Auch NMJs sehr weit entfernt in der Evolution, zum Beispiel NMJs von Mäusen, zeigt eine ganz ähnliche strukturelle Konformation 29. Die Makros sind nicht auf NMJ Präparate von anderen Spezies getestet worden, aber potenzielle Nutzer werden die Makros für solche Zwecke zu testen gefördert. Es ist sehr wichtig, dass der Benutzer den verschiedenen Auto-Schwellenwerte und Algorithmen untersucht, die am besten geeigneten Makroeinstellungen für die Bilder zu definieren / wählen. Mit diesen Einstellungen wird eine Genauigkeit von etwa 95% erreicht, wenn Makro Beurteilung zur manuellen Auswertung verglichen. die Makro-Einstellungen anpassen, um richtig Segment 100% der Bilder kann ein sehr mühsam oder gar unmöglich Verfahren. Daher Ausschluß von Bildern nicht richtig segmentiert wird empfohlen, wenn ihre Zahl unter 5% liegen. Offensichtlich, wenn die Qualität der Bilder niedrig ist, werden die Makros höhere Verhältnisse unbefriedigender Segmentierung erzeugen. Bilder von niedriger Qualität werden in ähnliche Weise manuelle Auswertung beeinflussen und können daher nicht auf die Leistung des Makros verknüpft werden. Dennoch sind die Makros eher robust, wie sie für Bild entworfen wurdenS auf einen hohen Gehalt Mikroskops (ein automatisiertes Fluoreszenz - Mikroskop , das Abbilden von einer großen Anzahl von Proben ermöglicht) 17 erzeugt. Ein kritischer Punkt ist, dass der Benutzer visuell alle Ergebnisse Bilder von dem Makros erzeugt inspiziert. Dies ermöglicht Bilder mit unbefriedigender Segmentierung zu erkennen und auszuschließen. In Abschnitt 6 dieses Protokolls wird der Benutzer geführt, wie die Einstellungen für eine korrekte Bildsegmentierung einzustellen, wenn der Sub-Makro „Analyze“ ausgeführt wird. Um schnell mit den Anforderungen des Makros vertraut machen und wie die Makro-Einstellungen anpassen ein Ordner namens „Examples_adjusting Makro-Einstellungen“ im Makro-Repository https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a enthalten. Dreizehn Unterordner, die jeweils mit den Beispielen Bildern auf verschiedenen Plattformen Mikroskop (high content / konfokalen / Fluoreszenzmikroskope) und verschiedenen Immunfärbungen erhalten, vorgesehen sind. Ein PDF-Titel „Beispiele guide“ ist in den gleichen enthaltenOrdner, in dem die Einstellungen für jedes Beispiel erforderlich sind, zur Verfügung gestellt, zusammen mit einem Textdokument der erwarteten Ergebnisse und die Ergebnisse Bilder bereitstellt. Die Makros wurden entwickelt, um Bilder gespeichert zu verarbeiten, als TIFF-Dateien getrennt, dennoch einige Nutzer könnten ihre Bilder in einem anderen Format gespeichert haben. Die folgende Website https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a 21 enthält einen Ordner mit dem Namen „Drosophila NMJ“ , wo drei Beispieldateien (Beispiel 1 - 3) und das Dokument „Beispiele Guide“ mit detaillierten Anweisungen , wie Sie Bilder in den Makro importieren wenn nicht als .TIFF separierten Dateien gespeichert sind, können auch im gleichen Ordner. Gemeinsam &quot;Drosophila NMJ Morphometrics&quot; und &quot;Drosophila NMJ bouton Morphometrics&quot; Makros quantifizieren zehn verschiedene NMJ Funktionen: NMJ Bereich, NMJ Umfang, Anzahl der boutons, NMJ bouton Bereich, NMJ Länge, NMJ längste Zweiglänge, Anzahl der islands, die Anzahl der Zweige, die Anzahl der Verzweigungspunkte und die Anzahl der aktiven Zonen. Dies stellt einen großen Vorteil gegenüber bisher verfügbaren Werkzeuge , die 30, 31 nur eine oder wenige synaptischen Funktionen beurteilen können. Multiparametrischer quantitative Analyse trägt ein großes Potenzial für neue Entdeckungen, zum Beispiel neue Regulierer zu identifizieren , die eine Steuerung von bis zu zahlreichen Aspekten der Synapse Biologie. Es bietet auch die erforderliche Auflösung Gene zu bestimmen, die genau die gleichen oder überlappenden Merkmale NMJ coregulate und sind somit wahrscheinlich in gemeinsamen molekularen Wegen zu arbeiten. Schließlich eröffnet sie die Möglichkeit , wie die verschiedenen synaptischen Parameter miteinander in Abwesenheit störender Einflüsse 17 korrelieren zu untersuchen und die Gene dieser koordinierten morphometrische Korrelationen gewährleisten. Zusammengenommen dieses Protokoll zeigt , wie die beiden Makros „Drosophila NMJ Morphometrics“ verwenden , und„Drosophila NMJ Bouton Morphometrie“, die in einer Hochdurchsatz - Weise objektiv und empfindliche Quantifizierung von zehn morphologischen Merkmalen NMJ zuführen.

Kognitive Störungen wie geistige Behinderung, Autismus - Spektrum - Störung und Schizophrenie sind oft durch abnormale synaptische Funktion 1 charakterisiert, 2, 3. Synapse Morphologie und Funktion sind eng miteinander verflochten; morphologische Defekte können synaptischen Störungen und in umgekehrter Richtung, aberrant synaptischen Übertragung 4 synaptischen Reifung und Morphologie wird Auswirkungen verursachen, 5, 6. Eine Reihe von Modellorganismen wurde , um besser zu verstehen , Synapse Biologie und Aufschluss darüber , wie synaptische Veränderungen beeinflussen die Gehirnfunktion in Gesundheit und Krankheit 7, 8, 9 eingesetzt. Das Drosophila NMJ wird ein umfangreich untersucht und gut etabliertes in vivo - Modell für glutamaterge synapse biology 10, 11. In den vergangenen Jahrzehnten hat sich dieses Modell für physiologische und Gen-Studien konzentrierten sich sowie für große genetische Screens, mit dem Ziel eingesetzt morphologischen Unterschiede zwischen NMJs zu erkennen. Insbesondere haben vorwärts genetischen Screens viele wichtige Regulatoren und Mechanismen , die Synapse Entwicklung identifiziert und Funktion 12, 13, 14, 15, 16. die meisten dieser Bildschirme jedoch verließ sich auf die visuelle Beurteilung von NMJ Terminal Morphologie und qualitativen Nachweis der synaptischen Abnormalitäten oder semi-quantitative scoring von wenigen morphologischen Eigenschaften. Als Konsequenz eher subtile synaptischen morphologische Anomalien, die nicht offensichtlich für das menschliche Auge sind, sind leicht zu übersehen. Um umfassend zu können quantitative Unterschiede erkennen, dieNMJ hat genau durch systematische Quantifizierung der morphologischen Parameter von Interesse zu bewerten. NMJ Merkmale Messung manuell ist umständlich, insbesondere, wenn es mehr NMJ Merkmale von Interesse und / oder bei großen genetischen Screenings durchgeführt wird. Um multiparametrischer, Hochdurchsatz - morphologische Analyse zu unterstützen und objektive Quantifizierung zu erreichen, zwei Makros „Drosophila NMJ Morphometrics“ und „Drosophila NMJ Bouton Morphometrics“ wurden 17 entwickelt. Beiden Makros ausführen , in der Open - Source - Bildanalyse - Software Fiji 18 und können sowohl konfokale und nichtkonfokalen Bilder quantifizieren. „Drosophila NMJ Morphometrie“ misst NMJ Terminals mit der postsynaptischen Spuranreißerscheibe immunhistochemisch groß-1 (HLG-1) oder der präsynaptischen Meerrettich - Peroxidase (HRP), mit dem aktiven Zonen - Markierungs - Bruchpiloten (BRP) co-markiert. Sie quantifiziert neun morphologische parameters (weiter unten beschrieben): NMJ Bereich, NMJ Umfang, Anzahl boutons, NMJ Länge NMJ längste Zweiglänge, Anzahl der Inseln, die Anzahl der Zweige, die Anzahl der Verzweigungspunkte und die Anzahl der aktiven Zonen in dem synaptischen Terminal (Abbildung 1) . Obwohl ein Algorithmus die Anzahl der boutons zur Bestimmung in diesem Makro vorhanden ist, es entsprach nicht die Kriterien für die Richtigkeit 17. Um richtig die Anzahl der boutons beurteilen zu können , ist es notwendig , die „Drosophila NMJ Bouton Morphometrics“ Makro zu verwenden, die speziell entwickelt wurde , Boutons mit NMJ Präparate immunhistochemisch durch anti-Synaptotagmin (Syt) oder anti-Cystein - String - Protein (CSP) zu quantifizieren, und Co-immunomarkiert mit Brp. Die „Drosophila NMJ Bouton Morphometrie“ Makro quantifiziert die folgenden Parameter: Anzahl der boutons, NMJ bouton Bereich, NMJ Länge NMJ längste Zweiglänge, Anzahl der Inseln, die Anzahl der Zweige, die Anzahl der Verzweigungspunkte und die Anzahl der aktiven zones (Abbildung 2). Das Makros besteht aus 3 Unter Makros: (I) identifiziert alle Dateien Bild „zu stapeln Convert“ und erzeugt Z-hyperstacks und Maximumintensitätsprojektion der beiden Kanäle. Als Ausgabe wird dieser Makro zwei neue Dateien pro Synapse erzeugen „stack_image_name“ und „flatstack_image_name“ genannt. II) „Define ROI“ öffnet alle maximalen Projektionsbilder „flatstack_image_name“ nacheinander und präsentieren sie mit der Anforderung , um manuell den interessierenden Bereich (ROI zu definieren) , in dem der spezifischen synaptischen Terminal von Interesse vorhanden ist. Dies wurde Ausschluß von Synapsen Verbinden mit benachbarten Muskeln und / oder anderen Arten von synaptischen Terminals (wie 1 s) zu ermöglichen , implementiert , die in den Bildern 11 vorhanden sein können. (III) „Analyse“ trifft völlig automatisierte Analyse auf alle Regionen der Bilder innerhalb der Grenzen der ROI. Wieein Ergebnis dieses Schrittes wird der Benutzer zwei neue Dateien erhalten: „results.txt“, wo die alles numerische Messung kommentiert werden wird und ein „res_image_name.tif“, wo das darunter liegende Bild Segmentierungen durch das Makro erzeugt wird erläutert. Während der Bildanalyse werden drei Strukturen von jedem synaptischen Terminal abgeleitet: der NMJ Umrisses, der NMJ Skeletts, und die Anzahl der BRP-positiven aktiven Zonen. Die NMJ outline wird verwendet, um den NMJ Bereich und seinen Umfang und eine anschließende Wende Trennung stellt die Anzahl der boutons zu bestimmen. Aus dem Skelett, fünf NMJ Merkmale abgeleitet werden: die Gesamt NMJ Länge, wobei die Summe der Länge der längsten kontinuierlichen Pfad alle zwei Endpunkte (längste Astlänge), die Anzahl der nicht verbundenen Kammern pro NMJ Verbindungs ​​(bezeichnet als „Inseln“ die Anzahl der Verzweigungen und die Anzahl der Verzweigungspunkte), (ein Verzweigungspunkt verbindet, drei oder mehr Verzweigungen). Die Anzahl der aktiven Zonen in der BRP-Kanals bestimmt durch ZählenBRP-positive Flecken. Die kommentierte NMJ outline (gelbe Linie), die NMJ Skeletts (blaue Linie), und die Anzahl der BRP-positiven aktiven Zonen (durch weiße Foci angegeben) werden in einem Ergebnisbild angezeigt, und die Messungen der Parameter werden einem verarbeitet (. txt) Ausgabedatei (Abbildung 3). Drosophila NMJ Morphometrie“und‚Drosophila NMJ Bouton Morphometrie‘wurden zuerst von Nijhof et al beschrieben und ausführlich validiert. 17. Diese Handschrift konzentriert sich auf die Methodik NMJ Morphologie mit den Makros zu analysieren‚Drosophila NMJ Morphometrie‘und‚Drosophila NMJ Bouton Morphometrie‘. Trotzdem vor der Makro-assisted Analysen müssen NMJ Dissektionen und Immunfärbungen durchgeführt werden. Diese entscheidenden Schritte sind, und die Kombination von Markern für die Immunhistochemie verwendet wird, muss geeignet für Makroanalysen werden. Diese Schritte werden kurz erwähnt in section 1 dieses Protokolls und leiten den Benutzer auf Referenzen im Detail beschreibt die Protokolle, diese Verfahren auszuführen.

<table><tbody><tr><td><stark>Immunfärbung</stark></td><td></td><td></td><td><stark>Verdünnung</stark></td></tr><tr><td>Maus-Anti-Disks groß 1</td><td>Entwicklungsstudien Hybridoma Bank</td><td>AFFN-DLG1-4D6</td><td>1/25 (konjungiert mit dem Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit)</td></tr><tr><td>Kaninchen-Anti-Meerrettich-Peroxidase</td><td>Jackson IR</td><td>323-005-021</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Kaninchen-Anti-Synaptotagmin</td><td>Geschenk von Hugo Bellen</td><td></td><td>Jan-00</td></tr><tr><td>Maus Anti-Cystein-String-Protein</td><td>Entwicklungsstudien Hybridoma Bank</td><td>DCSP-1(ab49)</td><td>1/10 (konjungiert mit dem Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit)&nbsp;</td></tr><tr><td>Maus Anti-Bruchpilot</td><td>Entwicklungsstudien Hybridoma Bank</td><td>nc82</td><td>Jan-50</td></tr><tr><td>Ziege Anti-Maus Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A11029</td><td>1/200</td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen Alexa Fluor 568</td><td>Life Technologies</td><td>A11011</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Zenon Alexa Fluor 568 Maus IgG1 Beschriftungskit</td><td>ThermoFisher</td><td>Z25006</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifading-Eindeckmittel</td><td>ThermoFisher</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Material</td><td>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</strong</td></tr><tr><td>>Ausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop oder Fluoreszenzmikroskop</td><td>Leica SP5</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio Imager</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Computer</td><td>, Mac oder PC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Material</td><td>Unternehmen</td><td><>Katalognummer<</td><td>strong>Kommentare</strong</td></tr><tr><td>>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

zwei algorithmen für den hochdurchsatz und multi-parametrischer quantifizierung<em&gt; drosophila</em&gt; neuromuskuläre junction morphology

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Synaptische Morphologie ist eng verbunden mit der synaptischen Wirksamkeit, und in vielen Fällen morphologische Synapse Mängel letztlich zu synaptischen Fehlfunktion führen. Die Drosophila Larven neuromuskulären Synapse (NMJ), ein gut etabliertes Modell für glutamatergen Synapsen, wird seit Jahrzehnten intensiv untersucht. Identifizierung von Mutationen NMJ morphologische Defekte verursachen ergab ein Repertoire von Genen, die Synapse Entwicklung und Funktion reguliert. Viele von ihnen wurden in groß angelegten Studien identifiziert , die auf qualitativen Ansätzen konzentrierten morphologische Anomalien der Drosophila NMJ zu erkennen. Ein Nachteil von qualitativen Analysen ist, dass viele subtilen Spieler NMJ Morphologie unbemerkt bleiben wahrscheinlich bei. Während quantitative Analysen der subtileren morphologischen Unterschiede zu erkennen sind erforderlich, sind solche Analysen noch nicht allgemein durchgeführt, da sie umständlich sind. Dieses Protokoll beschreibt im Detail zwei Bildanalysealgorithmen &quot;Drosophila </em&gt; NMJ Morphometrics“und‚Drosophila NMJ Bouton Morphometrics‘, erhältlich als Fidschi-kompatible Makros für quantitative, genaue und objektive morphometrische Analyse des Drosophila NMJ. Diese Methodik NMJ Terminals entwickelt immunomarkiert mit dem üblicherweise verwendeten Marker Dlg-1 zu analysieren und . Brp Zusätzlich seine breitere Anwendung auf andere Marker wie Hrp, Csp und Syt in diesem Protokoll vorgestellt Die Makros können neun morphologische NMJ Merkmale beurteilen. NMJ Bereich, NMJ Umfang, Anzahl der boutons, NMJ Länge, NMJ längste Zweig Länge, Anzahl von Inseln, die Anzahl der Zweige, die Anzahl der Punkte und die Anzahl der aktiven Zonen in der NMJ Terminal Verzweigung.

Zwei Bildanalysealgorithmen, „Drosophila NMJ Morphometrie“ und „Drosophila NMJ Bouton Morphometrie“ wurden geschaffen, um automatisch neun morphologischen Merkmale der neuromuskulären Synapse Drosophila zu quantifizieren (NMJ).

Zwei Algorithmen für den Hochdurchsatz und Multi-parametrischer Quantifizierung<em&gt; Drosophila</em&gt; Neuromuskuläre Junction Morphology

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die morphologischen Merkmale der neuromuskulären Verbindung von Drosophila mit Hilfe morphometrischer Software-Makros automatisch zu quantifizieren. Diese Methode kann helfen, Regulatoren der Synapsenentwicklung zu identifizieren, eine Schlüsselfrage der Neurobiologie. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die automatische Quantifizierung mehrerer NMJ-Merkmale.Dies ermöglicht eine objektive Analyse der NMJ-Morphologie im Hochdurchsatz. Wir haben uns entschieden, diese Methodik zu entwickeln, um die NMJ-Morphologie in einer großen Anzahl von Krankheitsmodellen untersuchen zu können. Wir haben uns überlegt, wie wir persönliche Differenzen verhindern und den Quantifizierungsprozess erheblich beschleunigen können.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist sehr hilfreich. Geeignete Makroeinstellungen sind von entscheidender Bedeutung, und einige Schritte können für neue Benutzer schwierig sein, insbesondere wenn sie mit VT-Software nicht vertraut sind. Generieren Sie für dieses Protokoll Bildstapel von NMJs und speichern Sie sie als einzelne TIFF-Dateien, wobei Kanal eins die DLG1-Färbung oder einen ähnlichen Marker und Kanal zwei die BRP-Färbung zeigt.Erstellen Sie zunächst C-Projektionen und Hyperstapel der NMJ-Bilddateien. Öffnen Sie die Plugin-Optionen und wählen Sie Drosophila NMJ Morphometrics. Identifizieren Sie nun die eindeutige Dateizeichenfolge, die das Mikroskop den Bildserien zugewiesen hat, wenn sie als TIFF gespeichert werden.Dies befindet sich am Ende des Bildnamens. Kopieren Sie die Zeichenfolge, die der untersten Ebene und der Kanalnummer zugewiesen wurde, und fügen Sie sie in das eindeutige Fenster zur Einstellung der Dateizeichenfolge ein. Wählen Sie dann das Untermakro convert to stack (In Stack konvertieren) und wählen Sie das Verzeichnis oder den Ordner aus, in dem sich die Bilder befinden.Für jede Image-Datei werden zwei neue Dateien mit den Standardnamen Stack und Flat Stack erstellt, gefolgt vom ursprünglichen Image-Namen. Die Originaldateien können dann gelöscht werden, um Speicherplatz zu sparen. Wählen Sie als Nächstes in der Drosophila NMJ Morphometrics-Schnittstelle das Untermakro "ROI definieren" aus und wählen Sie das Bilddateiverzeichnis aus.Wenn die erste Projektion geöffnet wird, wählen Sie das Freihandauswahlwerkzeug aus. Definieren Sie dann mit der Maus einen Bereich, der ein vollständiges NMJ-Terminal von Interesse enthält. Klicken Sie nach der Auswahl im Fenster "Terminal definieren" auf OK.Fahren Sie damit fort, bis die NMJ-Anschlusspunkte in allen Projektionen definiert sind. Das Makro führt den Prozess automatisch fort. Für jede Bilddatei wird eine neue Datei mit den Standardnamen ROI erstellt, gefolgt vom ursprünglichen Bildnamen.Um die NMJ-Merkmale zu quantifizieren, gehen Sie zunächst zur Drosophila NMJ Morphometrics-Schnittstelle und stellen Sie die Skala ein. Wenn ein Pixel im Bild z. B. 0,72 Mikrometern entspricht, legen Sie die Skalierungspixel auf eins und den Skalierungsabstand auf 0,072 fest. Wählen Sie dann das Untermakro analyze aus und wenn es zwei Kanalbilder gibt, schalten Sie auch die Gewichtung um.Drücken Sie OK und wählen Sie bei Aufforderung das Verzeichnis der Bilddatei aus. Die Verarbeitungszeit kann mehrere Minuten pro Synapse betragen. Nach der Analyse werden neue Bilddateien für jede analysierte Synapse im Elternordner gespeichert und die quantitativen Messungen sind die Ergebnisse.txt-Datei. Überprüfen Sie alle Bilder und schließen Sie Bilder mit Segmentierungsfehlern aus. Zum Beispiel könnten Teile des synaptischen Terminals nicht in der gelben Umrandung enthalten sein.Teile des Hintergrunds können im synaptischen Terminal enthalten sein. Eine blaue Skelettlinie kann sich über das synaptische Terminal hinaus erstrecken. Möglicherweise gibt es zu viele aktive Zonen, oder einige aktive Zonen bleiben unerkannt.Wenn mehr als 5% der Bilder Segmentierungsfehler aufweisen, sollten Sie verschiedene Analysealgorithmen ausprobieren, um die Bildverarbeitung zu verbessern. In den folgenden Videoabschnitten wird beschrieben, wie Sie viele dieser Makroanalyseeinstellungen definieren. Um den Wert für den Rollradius der Kugel für das Makro anzupassen, wählen Sie drei NMJ Z-Projektionen aus, die für den Bilddatensatz repräsentativ sind.Löschen Sie den Namen des Bildes mit der Ergebnisauflösung und den Namen des Stapelbilds für zwei aktive Zonen, die zuvor vom Untermakro analyze erstellt wurden. Öffnen Sie die Stapelbild-Namensdateien für jedes ausgewählte Bild, und wählen Sie dann in der Symbolleiste geteilte Kanäle aus, um ein Bild von Kanal eins und ein Bild von Kanal zwei zu erstellen und diese Dateien zu speichern. Öffnen Sie das Bild des Kanals eins, das in diesem Fall der Immunmarkierung von DLG one entspricht.Führen Sie nun den Filter subtract background aus, der sich auf der Registerkarte process befindet. Legen Sie den Radius der rollenden Kugel auf einen Wert fest, der den Kontrast zwischen Synapse und Hintergrund erhöht. Erstellen Sie eine Z-Projektion mit dem Projektionstyp "Maximale Intensität" und speichern Sie das Bild.Führen Sie dann den Algorithmus zum Subtrahieren des Hintergrunds mit dem neuen Radius der rollenden Kugel für alle Z-Projektionen aus, und speichern Sie die Ergebnisse. Um die besten automatischen Schwellenwerte für das Makro zu ermitteln, öffnen Sie die gespeicherten C-Projektionen, und führen Sie den automatischen Schwellenwert mit der Option Alle ausprobieren aus. Suchen Sie aus den resultierenden Bildern den am besten geeigneten Algorithmus für die Bilder und fahren Sie mit dieser Schwellenwerteinstellung fort, wenn Sie das Makro für weitere Bilder ausführen.Die Definition der verschiedenen automatischen Schwellenwerte ist entscheidend für die korrekte Bildsegmentierung durch das Makro. Aus diesem Grund ist es wichtig, acht der Signage-Parameter richtig zu quantifizieren, daher ist es wichtig, mit den 16 von der Software angebotenen Optionen für den automatischen Schwellenwert vertraut zu sein. Drücken Sie die Plus-Taste, um in das Ergebnisbild des automatischen Schwellenwerts zu zoomen.Die Algorithmusnamen befinden sich unter jedem Ergebnisbild. In diesem Beispiel ist Huang der beste Algorithmus für den automatischen Schwellenwert zum Festlegen des NMJ-Gliederungsschwellenwerts. Für den Skelettschwellenwert ist die beste Einstellung Li, und die beste Einstellung für den Schwellenwert der aktiven Zone ist Huang.Um die feinen Maxima Rauschtoleranz für das Makro zu definieren, kehren Sie zu den ursprünglichen repräsentativen NMJ-Bildern zurück. Öffnen Sie den BRP-Kanal. Gehen Sie im Popup-Menü auf die Registerkarte Plugins und wählen Sie maximales 3D.Nach kurzer Zeit erscheint ein neues Bild, dann schließen Sie das Originalbild. Verwenden Sie als Nächstes den minimalen 3D-Befehl. Schließen Sie dann das Maximum von C2-Stacks, synapse ein Image, und wählen Sie das neu erstellte Image-Minimum von maximal C2 Stack synapse one aus.Verwenden Sie nun den Befehl find maxima. Wählen Sie im neuen Fenster die Auswahl des Vorschaupunkts und stellen Sie die Rauschtoleranz auf 50 ein. Die Maxima-Punkte werden dann mit kleinen Kreuzen angegeben, die nur die aktiven Synapsenzonen abdecken sollten.Wenn zu viele Kreuze gemacht werden, erhöhen Sie den Wert für die Geräuschtoleranz. Wenn einige der aktiven Zonen nicht mit Anmerkungen versehen sind, verringern Sie den Wert für die Rauschtoleranz. Verwenden Sie den abgeleiteten Schwellenwert für das Feld "Maximale Rauschtoleranz suchen" des Makros.Bei der Auswahl des maximalen Rauschtoleranzwerts ist es wichtig, die Anzahl der aktiven Zonen richtig zu quantifizieren. Manchmal ist es notwendig, verschiedene Werte auszuprobieren, um den richtigen zu definieren. Passen Sie nun alle abgeleiteten Werte in den Schwellenwertalgorithmen in der Makroschnittstelle an und führen Sie die Untermakroanalyse für die repräsentativen Bilder aus, die ursprünglich zur Definition der Makroeinstellungen verwendet wurden.Es wird eine neue Datei mit den aktiven Zonen erstellt, die durch weiße Punkte gekennzeichnet sind. Öffnen Sie diese Datei, indem Sie sie per Drag & Drop in die Symbolleiste ziehen und Z-Projekt mit einem Projektionstyp als einige Slices auswählen. Somit wird eine Projektionsdatei erstellt.Der nächste Schritt besteht darin, den Schwellenwert anzupassen. Schieben Sie im neuen Schwellenwertfenster die obere Leiste, um einen Schwellenwert auszuwählen, bei dem alle gewünschten Brennpunkte gelesen werden. Dies sind die positiven Punkte von BRP.Verwenden Sie diesen Wert als unterer Schwellenwert für BRP-Puncta. Führen Sie nun die Analyse für die ursprünglichen repräsentativen NMJ-Bilder mit den zuvor definierten Werten, Algorithmen und dem neuen unteren Schwellenwert für BRP-Puncta erneut aus. Die resultierenden Bilder sollten die Kriterien für eine kritische Analyse erfüllen.Verwenden Sie nun die definierten Einstellungen, um das Makro auf alle NMJ-Bilder auszuführen, die unter den gleichen Bedingungen erhalten wurden. Das Drosophila NMJ Morphometrie-Makro wurde verwendet, um verschiedene bekannte synaptische Defekte in drei mutierten Genotypen zu validieren. Es ist bekannt, dass zwei Mutanten von Ankyrin fusionierte Boutons und kleinere NMJs haben.Mit Hilfe des Makros wurden die Fläche und der Umfang von Panuronil und Quirin zwei RNAI-Knock-down-NMJs gemessen und es wurde festgestellt, dass sie signifikant kleiner sind als bei Kontrollen. Die GTPase Rab3 wird für die korrekte Verteilung der Bruckpila benötigt. Wenn es gestört wird, gibt es weniger aktive Zonen.Mit dem Makro Panuronil Rab 3 hatten Knock-Down-Fliegen durchschnittlich 138 aktive Zonen pro NMJ-Terminal, verglichen mit 290 bei Kontrollen. Hochdraht ist ein wichtiger Regulator des NMJ-Wachstums und wenn sie mutiert sind, haben NMJs ausgedehnte Verzweigungen an ihren Enden. Unter Verwendung des Makro-Panuronil-Hochdraht-RNAI-Knock-Down-Lines zeigten signifikante Erhöhungen mehrerer vom Skelett abgeleiteter Parameter an ihren NMJs, einschließlich der Gesamtlänge, der längsten Astlänge, der Anzahl der Äste und der Anzahl der Verzweigungspunkte.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das Morphometrie-Makro Drosophila NMJ bedienen und die Einstellungen anpassen. Einmal gemeistert, kann die Analyse von 50 Synapsen innerhalb einer Stunde durchgeführt werden. Dies spart etwa 15 Minuten Quantifizierungszeit pro Synapse.Es ist wichtig, Bilder von guter Qualität des NMJ zu erhalten. Je besser die Bilder, desto besser ist die Leistung des Makros. Diese Technik wird Forschern auf dem Gebiet der Neurobiologie helfen, morphologische Parameter des Drosophila NMJ effizient zu quantifizieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Dissection und Imaging von aktiven Zonen in der Drosophila Neuromuskulären Synapse

Die Drosophila Neuromuscular Junction (NMJ) wird als Modell verwendet, um die Morphologie und Funktion von Synapsen zu untersuchen. Dieses Video beschreibt wichtige Merkmale, die Forscher quantifizieren, um das NMJ zu charakterisieren. Das Beispielprotokoll demonstriert eine Software, die in der Lage ist, die Quantifizierung automatisch durchzuführen.

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Optimierung des Probenvorbereitungsprozesses für die Transmissionselektronenmikroskopie von neuromuskulären Verbindungen in Drosophila-Larven

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Visualisierung der Mikrotubuli-Netzwerke in neuromuskulären Verbindungen und Muskelzellen vor. In Kombination mit den leistungsstarken genetischen Werkzeugen von Drosophila melanogaster erleichtert dieses Protokoll das genetische Screening und die Analyse der Mikrotubuli-Dynamik für die Rolle von Mikrotubuli-Netzwerk-regulatorischen Proteinen im Nervensystem erheblich.

Verwendung von neuromuskulären Verbindungen und Muskelzellen von Drosophila-Larven zur Visualisierung des Mikrotubuli-Netzwerks

Lernen Sie zwei Bildanalysealgorithmen zur automatischen Quantifizierung von Drosophila-Neuromuskulären Junctions. Diese Methode ermöglicht hochdurchsatzfähige, objektive Morphologieanalysen für Neurobiologie-Forschung.

Zwei Algorithmen für den Hochdurchsatz und Multi-parametrischer Quantifizierung

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