Automatisierte Probenvorbereitung für die multiplexierte Analyse einzelzelliger Histon-Posttranslationalen Modifikationen (sc-hPTM2)
December 19th, 2025
Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Automatisierung der posttranslationalen Analyse einzelzelliger Histon-Modifikationen unter Verwendung einer isotopischen Zweiplex-Markierungsstrategie und der ArgC-Verdauung. Dieser Workflow ermöglicht quantitative, reproduzierbare und hochsensible Profilierung der Chromatinheterogenität und epigenetischen Antworten bei Einzelzellauflösung.
Wir treiben die Einzelzell-Proteomik mit einer automatisierten Multiplexmethode voran, um die globale Chromatinheterogenität für posttranslationale Modifikationen zu untersuchen. Was dieses Protokoll herausfordernd macht, ist die proteomische Präparation im Pikogrammmaßstab, die Multiplex-Markierung sowie die Auflösung komplexer kombinatorischer modifizierter Histonpeptide. Zunächst rekonstituiert man Hep G2/C3A hepatozelluläre Karzinomzellen mit einer Endkonzentration von 200 bis 500 Zellen pro Mikroliter in eiskalten PBS.
Stellen Sie die Pulsbreite und die Antriebsspannung jeder Düse auf die vom Hersteller angegebenen Werte ein. Für maximale Aufnahmeeffizienz sollten Sie darauf achten, dass der Z-Versatz zwischen den beiden Düsen weniger als 50 Mikrometer variiert. Identifizieren Sie die optimale Kontaktposition für jede Düse und vergleichen Sie die Z-Höhenanzeigen im Düsen-Setup-Tab.
Für das Tuplex-Multiplexing-Schema wird ein einzelner Schlitten auf den Schlittenhalter in der Haube geladen und dann auf das Instrument übertragen. Mit einer Pipette werden 150 Mikroliter LCMS-Qualitäts-DMSO in ein neues PCR-Rohr eingelassen. Stelle ihn an Position zwei der Waschstation mit dem Röhrendeckel zur Instrumententür hin.
Starte den DMSO-Durchlauf. Erhalten Sie einen stabilen Tropfen, nachdem das DMSO aspiriert wurde. Beachten Sie die Änderung der PDC-Transparenz.
Es kann erforderlich sein, die Spannung zu erhöhen. Überprüfen Sie die Stabilität durch eine Kontrolle des Abfallvolumens. Führe die Einstellung des Head-Camera-Assistenten durch, um die Kamera auszurichten.
Geben Sie DMSO ab und lassen Sie das Instrument die Düsen automatisch spülen und Bilder über alle Folien zur Qualitätskontrolle aufnehmen. Überprüfen Sie diese Bilder, um einen einheitlichen DMSO-Tropfen auf jeder Folie zu überprüfen und um fehlende oder unbestimmte Tropfen zu überprüfen. Nach dem Aspiratieren der Zellsuspension öffnen Sie die Zelle in einem Modul, führen Sie eine Hintergrundaufnahme durch und führen dann die Mapping-Routine aus, um die Auswurfzone zu definieren.
Führen Sie die Analyse durch und sperren Sie dann die Partikel an, um Zellen basierend auf Größe und Verlängerung auszuwählen. Bereiten Sie nun eine frische Verdauungsmischung in LCMS-Wasser vor. Entgasen Sie die Lösung mit einer Vakuumpumpe für 10 Minuten auf Eis.
Nachdem die Verdauungsmischung auf die Objektträger gegeben wurde, lassen Sie das Instrument die Düsen automatisch spülen und fotografieren Sie jeden Objektträger. Überprüfen Sie die Bilder, um sicherzustellen, dass jeder Tropfen die Verdauungsmischung gleichmäßig aufnimmt. Inkubieren Sie die Objektträger über Nacht bei Raumtemperatur, um die Verdauung zu ermöglichen.
Nach Beginn des Verdampfungslaufs und der nächtlichen Verdauung inspizieren Sie die Bilder. Wenn die Tröpfchen ausreichend trocken sind, stoppen Sie den Lauf. Wenn nicht, klicken Sie auf Weitermachen und weitere fünf Minuten trocken trocknen.
Für die Beschriftung bereiten Sie zunächst Lagerlösungen für die multiplexierte Histon-Derivitisierung vor. Nach dem Abgeben lassen Sie das Instrument die Düsen automatisch durchspülen und fotografieren Sie jeden Verschluss. Überprüfen Sie die Bilder, um eine gleichmäßige Verteilung und die korrekte Platzierung der Tröpfchen auf allen Objektträgern zu bestätigen.
Nach Abschluss der Inkubation wird eine Hydroxylaminlösung zum Abschrecken dosiert. Um das Beispiel zu öffnen, wähle im Haupttab den Run aus und starte den Run dann im Run-Tab. Nachdem die Abholung abgeschlossen ist, überprüfen Sie die Bilder, um auf Fehler zu achten.
Nach dem Abnehmen entferne ich die Abdeckung von der Tonabnehmerplatte. Dann trocknen Sie die Proben bei niedriger Hitze in einem Vakuumkonzentrator. Für die Datenerfassung programmieren Sie die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-Methode.
Stellen Sie das MS-zwei-Experiment so ein, dass es Isolationsfenster von 50 Massen Überladung, hochenergetische Kollisionsdissoziation von 27 % und automatisches Gewinnkontrollziel von 1000 % enthält. Decken Sie die Platte mit einer Gummiversiegelungsmatte ab und legen Sie sie in den Autosampler. Nachdem Sie die Rohdateien erhalten haben, überprüfen Sie kurz das Chromatogramm und führen Sie dann die Rohdaten in EpiProfile Version 2.1 aus. Überprüfen Sie die Ausgabetabelle der normalisierten Histon-PTM-Häufigkeiten und verwenden Sie sie für nachgelagerte Analysen.
Die ersten 20 Histon-H3-Peptidoformen wurden quantifiziert und zeigten ihre relative Häufigkeit in Kontroll- und natriumbutyratbehandelten Bedingungen. Sowohl die H3-K9-Acetylierung als auch die H3-K-14-Acetylierung zeigten eine höhere relative Häufigkeit bei der Behandlung mit Natriumbutyrat. Während die H3-K9-Acetylierung von K14 in behandelten Zellen noch stärker angereichert war.
Die Gesamtacetylierungswerte stiegen nach der Behandlung mit Natriumbutyrat, wobei behandelte Zellen eine breitere Fehlerverteilung im Vergleich zu Kontrollen zeigten, was die höhere Heterogenität auf Einzelzellebene widerspiegelt. Die Quantifizierung einzelner und gleichzeitig vorkommender Histonmodifikationen zeigte, dass kombinatorische Acetylierungszustände am stärksten von Natriumbutyrat beeinflusst wurden. Die größere Verbreitung der mit Natriumbutyrat behandelten Zellen deutete auf eine erhöhte biologische Heterogenität zwischen einzelnen Zellen innerhalb der Sphäroide hin.
Dieses Protokoll schließt die Lücke in der epigenetischen Forschung, indem es Wissenschaftlern ermöglicht, Chromatinzustände in Einzelzelllösung zu untersuchen. Dieser Workflow ermöglicht die Hochdurchsatzprobenvorbereitung, das Multiplexing der Proben und unvoreingenommene Massenspektrometrie, um sowohl sensible als auch quantitative epigenetische Daten aus Einzelzellen zu erzeugen. Zukünftige Forschungen werden untersuchen, wie die Regulation des Chromatins Krankheitszustände wie Krebs, Stoffwechselerkrankungen und Alterung verändert.
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Überblick
Dieser Artikel stellt ein Protokoll für die Automatisierung der Analyse der posttranslationalen Modifikation von Histonen auf Einzelzellebene vor, das eine isotopische Two-Plex-Markierungsstrategie verwendet. Der Workflow ermöglicht quantitative und hochempfindliche Profilerstellung der Chromatin-Heterogenität mit Einzelzellauflösung.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Einzelzell-Proteomik
- Posttranslationale Modifikationen von Histonen
- Chromatin-Analyse
Hintergrund
- Einzelzellanalyse ist entscheidend für das Verständnis der zellulären Heterogenität.
- Posttranslationale Modifikationen spielen eine Schlüsselrolle bei der Regulierung der Chromatinstruktur und -funktion.
- Automatisierte Methoden können die Reproduzierbarkeit und Empfindlichkeit in proteomischen Studien verbessern.
- Herausforderungen umfassen die Handhabung kleiner Probenmengen und komplexer Peptidmischungen.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines robusten Protokolls zur Analyse von Histonmodifikationen mit Einzelzellauflösung.
- Verbesserung der Effizienz der Multiplex-Markierung in proteomischen Workflows.
- Bewältigung der Herausforderungen von Histonpeptiden mit geringer Häufigkeit.
Verwendete Methoden
- Rekonstitution von Hep G2/C3A-Zellen in PBS bei einer bestimmten Konzentration.
- Anpassung der Düsenparameter für optimale Probenaufnahme.
- Implementierung der isotopischen Two-Plex-Markierung zur Quantifizierung.
- Verwendung von ArgC-Verdauung zur Peptidvorbereitung.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Automatisierung der Analyse der Histonmodifikationen auf Einzelzellebene.
- Hohe Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit in der Profilerstellung demonstriert.
- Effektive Auflösung komplex kombiniert modifizierter Histonpeptide.
- Einblicke in die Chromatin-Heterogenität und epigenetische Reaktionen.
Schlussfolgerungen
- Das entwickelte Protokoll verbessert die Untersuchung der Chromatindynamik mit Einzelzellauflösung.
- Automatisierung verbessert signifikant die Effizienz der Histonmodifikationsanalyse.
- Diese Methode kann auf verschiedene biologische Fragen bezüglich Epigenetik angewendet werden.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Automated single-cell histone PTM analysis addresses the critical challenge of resolving chromatin heterogeneity and epigenetic regulation at cellular resolution. This workflow enhances predictive confidence in early discovery by enabling quantitative, multiplexed profiling of histone modifications across individual cells. The approach supports risk-adjusted portfolio decisions by providing high-content, reproducible data on epigenetic states relevant to disease and therapeutic modulation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of chromatin regulatory mechanisms at the single-cell level.
- Supports functional target validation by quantifying histone PTM changes in response to perturbations.
- Facilitates mechanistic de-risking through direct measurement of epigenetic heterogeneity.
- Improves predictive confidence for target selection and triage in epigenetic drug discovery.
Screening & Assay Development
- Prepares validated single-cell systems for downstream screening of epigenetic modulators.
- Delivers standardized, reproducible, and quantitative histone PTM readouts for assay development.
- Enables multiplexed comparison of treatment conditions using isotopic labeling strategies.
- Supports scalable, high-throughput workflows for compound evaluation in chromatin biology.
Translational & Preclinical Research
- Aligns single-cell epigenetic profiling with disease-relevant models such as tumor spheroids.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by capturing cellular heterogeneity in response to therapeutic agents.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative chromatin state data.
- Supports translational biomarker identification for epigenetic drug development.
Pipeline & Workflow Integration
This automated protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling high-content, quantitative analysis of histone PTMs at single-cell resolution.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving cell-to-cell chromatin variability.
- Screening: Provides assay-ready, multiplexed outputs for robust compound screening and comparison.
- Analytics: Delivers quantitative, normalized histone PTM abundance tables for statistical analysis and condition comparison.
- Translational Research: Connects single-cell epigenetic data to disease models and therapeutic response evaluation.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, automated capability for ongoing epigenetic profiling across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in chromatin-targeted discovery.
- Operational Value: Standardizes and automates sample preparation for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by providing high-content, quantitative data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of epigenetic targets and compounds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-cell proteomics and mass spectrometry data analysis.
- Needs access to automated nano liquid handling and high-resolution LC-MS instrumentation.
- Demands cross-team standardization for sample preparation and data processing workflows.
- Adaptation may be needed for different cell types or disease models.
- Throughput and sensitivity are limited by instrument capacity and sample handling precision.
