Name: Automatisierte Probenvorbereitung für die multiplexierte Analyse einzelzelliger Histon-Posttranslationalen Modifikationen (sc-hPTM2) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-19T13:25:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Erfahren Sie die automatisierte Probenvorbereitung für die multiplexierte Analyse einzelzelliger Histon-Posttranslationalen Modifikationen. Diese Methode ermöglicht hochsensitive und reproduzierbare Chromatin-Profiling-Studien.

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<ol><li>Bannister, A. J., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+chromatin+by+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of chromatin by histone modifications.</a> Cell Res. 21 (3), 381-395 (2011).</li>
<li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).</li>
<li>Sidoli, S., Bhanu, N. V., Karch, K. R., Wang, X., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+workflow+for+analysis+of+histone+post-translational+modifications+using+bottom-up+mass+spectrometry%3A+from+histone+extraction+to+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Complete workflow for analysis of histone post-translational modifications using bottom-up mass spectrometry: from histone extraction to data analysis.</a> J Vis Exp. (111), e54112(2016).</li>
<li>Budnik, B., Levy, E., Harmange, G., Slavov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCoPE-MS%3A+mass+spectrometry+of+single+mammalian+cells+quantifies+proteome+heterogeneity+during+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">SCoPE-MS: mass spectrometry of single mammalian cells quantifies proteome heterogeneity during cell differentiation.</a> Genome Biol. 19 (1), 161(2018).</li>
<li>Slavov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+protein+analysis+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-cell protein analysis by mass spectrometry.</a> Curr Opin Chem Biol. 60 (1), 1-9 (2021).</li>
<li>Leduc, A., Khoury, L., Cantlon, J., Khan, S., Slavov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+sample+preparation+for+multiplexed+single-cell+proteomics+using+nPOP%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Massively parallel sample preparation for multiplexed single-cell proteomics using nPOP.</a> Nat Protoc. 19 (12), 3750-3776 (2024).</li>
<li>Lund, P. J., Kori, Y., Zhao, X., Sidoli, S., Yuan, Z. F., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotopic+labeling+and+quantitative+proteomics+of+acetylation+on+histones+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isotopic labeling and quantitative proteomics of acetylation on histones and beyond.</a> Methods Mol Biol. 1977 (1), 43-70 (2019).</li>
<li>Cutler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+profiling+of+single-cell+histone+post-translational+modifications+to+dissect+chromatin+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based profiling of single-cell histone post-translational modifications to dissect chromatin heterogeneity.</a> Nature Communications. , (2025).</li>
<li>Davie, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+histone+deacetylase+activity+by+butyrate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Inhibition of histone deacetylase activity by butyrate.</a> J Nutr. 133 (7 Suppl), 2485S-2493S (2003).</li>
<li>Stransky, S., Cutler, R., Aguilan, J., Nieves, E., Sidoli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+reversible+histone+acetylation+and+dynamics+in+gene+expression+regulation+using+3D+liver+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Investigation of reversible histone acetylation and dynamics in gene expression regulation using 3D liver spheroid model.</a> Epigenetics Chromatin. 15 (1), 35-35 (2022).</li>
<li>Stransky, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-automated+phenotypic+analysis+of+functional+3D+spheroid+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Semi-automated phenotypic analysis of functional 3D spheroid cell cultures.</a> J Vis Exp. (1), e65086(2023).</li>
<li>Yuan, Z. F., Sidoli, S., Marchione, D. M., Simithy, J., Janssen, K. A., Szurgot, M. R., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EpiProfile+2.0%3A+a+computational+platform+for+processing+epi-proteomics+mass+spectrometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">EpiProfile 2.0: a computational platform for processing epi-proteomics mass spectrometry data.</a> J Proteome Res. 17 (7), 2533-2541 (2018).</li>
<li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1,5-mL Mikrozentrifugenröhren</td><td>Bio-Rad</td><td>2239480</td><td></td></tr><tr><td>1000 & Mikro; L-breite Pipetspitzen</td><td>Fisher Scientific</td><td>14222703</td><td></td></tr><tr><td>200 & Mikro; L-breite Pipetspitzen</td><td>Fisher Scientific</td><td>14222730</td><td></td></tr><tr><td>384 Brunnen PCR-Platte Lo Bind&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>30129547</td><td></td></tr><tr><td>96-Bohrloch-Vakuumkrümmer</td><td>Millipore</td><td>MAVM0960R</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril, Optima LC-MS/MS-Qualität.</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955-1</td><td></td></tr><tr><td>Klebeweise PCR-Plattenfolien</td><td>Thermo Fisher</td><td>AB0626</td><td></td></tr><tr><td>Wasserfreies Acetonitril</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA42311AK</td><td>Etiketten-Lösung für Großpackungen lagert</td></tr><tr><td>Arg-C Ultra, Mass-Spec-Qualität</td><td>Promega</td><td>VA1831</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturqualitätswasser</td><td>Corning</td><td>25-055-CV</td><td></td></tr><tr><td>CellenVIALs</td><td>SCIENION</td><td>/</td><td>Die Katalognummer enthält ein Zitat</td></tr><tr><td>DMSO, Wasserfrei</td><td>Thermo Fisher</td><td>D12345</td><td>Etikettenlagerlösung</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>D0632-5G</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeccos Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT17205CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetales Rinderserum</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT35010CV</td><td></td></tr><tr><td>Ameisensäure</td><td>Thermo</td><td>28905</td><td></td></tr><tr><td>Ameisensäure 98 %; 100 % für LC-MS LiChropur</td><td>Sigma</td><td>5330020050</td><td></td></tr><tr><td>Hanks ausgewogene Salzlösung (HBSS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT21022CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (Ultra Rein)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11344041</td><td></td></tr><tr><td>HPLC-Qualitätsacetonitril</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>HPLC-Qualitätswasser</td><td>Fisher Scientific</td><td>W5-4</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxylaminlösung 50 Wt. % in H2O</td><td>Sigma</td><td>438227-50ML</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25015CI</td><td></td></tr><tr><td>n-Dodecyl-beta-Maltosid (DDM) Waschmittel</td><td>Fisher Scientific</td><td>BN2005</td><td></td></tr><tr><td>Nicht-essentielle Aminosäuren</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25025CI</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Exploris 480 Massenspektrometer</td><td>Thermo Fisher</td><td>BRE725539</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd 16% wässrige Lösung EM-Grade</td><td>Elektronenmikroskopiewissenschaften</td><td>15710-S</td><td></td></tr><tr><td>PDC-CM (Typ-2-Beschichtung)</td><td>SCIENION</td><td>/</td><td>Die Katalognummer enthält ein Zitat</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT3002CI</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), 10x, pH 7,4, RNase-frei</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>Pierce-Dimethylsulfoxid (DMSO), LC-MS-Qualität.</td><td>Thermo Fisher</td><td>85190</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenpistole</td><td>Eppendorf</td><td>Z666467 (Milipore Sigma)</td><td></td></tr><tr><td>Propionanhydrid &ge; 99%</td><td>Sigma</td><td>240311-50G</td><td></td></tr><tr><td>Propionanhydrid-d10 &ge; 98 Atom % D, &ge; 99 % (CP)</td><td>Sigma</td><td>615692-1G</td><td></td></tr><tr><td>Gekühlte Zentrifuge</td><td>Thermo</td><td>75-217-420</td><td></td></tr><tr><td>SciCHIP H1-beschichtete Glasverkleidungen</td><td>SCIENION</td><td>/</td><td>Die Katalognummer enthält ein Zitat</td></tr><tr><td>SpeedVac-Vakuumkonzentrator (96-Well-Platten)</td><td>Thermo</td><td>15308325</td><td>Savant SPD1010</td></tr><tr><td>Sterile Haube</td><td>Thermo</td><td>1375</td><td></td></tr><tr><td>Sterile serologische Pipetten</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367549</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Green Dead Cell Stain, für die Durchflusszytometrie</td><td>Thermo Fisher</td><td>S34860</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzym (1X), kein rotes Phenol</td><td>Thermo Fisher</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Sigma</td><td>Z258415</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>Fisher Scientific</td><td>FSGPD10</td><td></td></tr></tbody></table>

automatisierte probenvorbereitung für die multiplexierte analyse einzelzelliger histon-posttranslationalen modifikationen (sc-hptm2)

Automated Sample Preparation for the Multiplexed Analysis of Single-Cell Histone Post-Translational Modifications (sc-hPTM2)

Um die Anwendung unseres Single-Cell-Histon-Proteomik-Workflows mit unserem System zu demonstrieren, analysierten wir Sphäroide von HepG2/C3A-Zellen, die mit 5 mM Natriumbutyrat behandelt wurden, für 24 Stunden. Nach der LC-MS/MS-Erfassung wurden die Rohdaten mit EpiProfile sowohl für leichte (propionische Anhydrid) als auch für schwere (propionisches Anhydrid-d10) Labeling verarbeitet, wodurch normalisierte Daten erhalten wurden, die die Häufigkeit der Peptide und Histonmarkierungen darstellen. Das QuantQC R-Paket wurde...

Automatisierte Probenvorbereitung für die multiplexierte Analyse einzelzelliger Histon-Posttranslationalen Modifikationen (sc-hPTM2)

Histone post-translational modifications (hPTMs) are central regulators of chromatin organization and gene expression. Their dysregulation is implicated ...

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Dieses Protokoll beschreibt einen voll integrierten Workflow für die Charakterisierung von Histon-post-translationale Modifikationen mittels Massenspektrometrie (MS). Der Workflow umfasst Histon-Reinigung aus Zellkulturen oder Geweben, Histon-Derivatisierung und Verdauung, MS-Analyse unter Verwendung von Nano-Flow-Flüssigkeitschromatographie und Anweisungen für die Datenanalyse. 3 Tage - Das Protokoll wird innerhalb von 2 für die Fertigstellung konzipiert.

Komplette Workflow zur Analyse von Histon-post-translationale Modifikationen Mit Bottom-up-Massenspektrometrie: Von Histone Extraktion in Datenanalyse

Dieses Manuskript beschreibt Methoden zur Anwendung der Peptid-Microarray-Technologie auf die Spezifitätsprofilierung von Antikörpern, die Histone und ihre posttranslationalen Modifikationen erkennen.

Analyse der Histon-Antikörper-Spezifität mit Peptid-Microarrays

Der Zweck dieses Artikels ist es, eine umfassende, systematische Leitfaden für die effiziente Reinigung der Histone H3 und H4 und die Quantifizierung von Schimmelpilzschäden Histon-Rückständen.

Reinigung des H3 und H4-Histon-Proteine und die Quantifizierung der acetylierte Histone Noten in Zellen und Hirngewebe

Dieser Workflow beschreibt die Gleichzeitige der zeit- und kosteneffizienten Anreicherung mehrerer Protein-Post-Translational-Modifikationen (PTMs) für die quantitative globale proteomische Analyse. Das Protokoll nutzt ptM-Anreicherung auf Peptidebene mit mehreren konjugierten Antikörpern, gefolgt von einer datenunabhängigen Erfassungsmassenspektrometrieanalyse, um biologische Einblicke in PTM-Übersprechen zu gewinnen.

Gleichzeitige Affinitätsanreicherung von zwei posttranslationalen Modifikationen für Quantifizierung und Standortlokalisierung

Hier zeigen die Autoren den Nutzen von MULTI-seq für die Phänotypisierung und nachfolgende gepaarte scRNA-seq und scATAC-seq bei der Charakterisierung der transkriptomischen und chromatinischen Zugänglichkeitsprofile in der Netzhaut.

Multiplexe Analyse der retinalen Genexpression und der Chromatinzugänglichkeit mittels scRNA-seq und scATAC-seq

Dieses Protokoll beschreibt, wie ein dreidimensionales Zellkultursystem verwendet werden kann, um Chromatinmodifikationen in einem nahezu physiologischen Zustand zu modellieren, zu behandeln und zu analysieren.

Globale Quantifizierung von posttranslationalen Histonmodifikationen in einem 3D-Zellkulturmodell von Lebergewebe

Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll zur Quantifizierung globaler Histonmodifikationen mittels intranukleärer Durchflusszytometrie in isolierten Hirnmikroglia. Die Arbeit enthält auch das Mikroglia-Isolationsprotokoll, das für die Datenerhebung verwendet wurde.

Quantifizierung globaler posttranslationaler Histonmodifikationen mittels intranukleärer Durchflusszytometrie in isolierten Mikroglia des Mausgehirns

Ein analytischer Arbeitsablauf, der auf Flüssigkeitschromatographie, Mobilitätsspektrometrie mit gefangenen Ionen und Flugzeit-Massenspektrometrie (LC-TIMS-ToF MS/MS) basiert, für eine hochzuverlässige und hochgradig reproduzierbare "Bottom-up"-Analyse von Histonmodifikationen und -identifizierung basierend auf Hauptparametern (Retentionszeit [RT], Kollisionsquerschnitt [CCS] und genaues Masse-zu-Ladungs-Verhältnis [m/z]).

Histonmodifikations-Screening mittels Flüssigkeitschromatographie, Ionenmobilitätsspektrometrie und Flugzeit-Massenspektrometrie

Dieses Protokoll ermöglicht eine effiziente Histonextraktion aus verschiedenen klinischen Proben für eine anschließende posttranslationale Modifikationsanalyse mittels LC-MS/MS. Durch die robuste Erkennung wichtiger Histonmodifikationen dient sie als wertvolles Werkzeug für umfassende epigenetische Profilierung in großen klinischen Kohorten.

Extraktion von Histonen aus klinischen Proben für epigenetische Profilierung mittels Massenspektrometrie

Genetische Varianten im menschlichen Spindlin-Familienmitglied 4 (SPIN4) wurden kürzlich bei Patienten mit Knochenüberwucherung identifiziert, einer neuartigen Entwicklungsstörung. Ein Protokoll und neue Ergebnisse zur Beschreibung der biochemischen Identifikation modifizierter Histone im Kontext von Nukleosomen als SPIN4-bindende Substrate werden präsentiert.

Identifikation modifizierter Histone als bindende Substrate des menschlichen Spindlin-Familienmitglieds 4 (SPIN4) mittels Peptidarrays und natives Nukleosomen-Pulldowns

Diese Studie präsentiert ein räumliches Trekker–CUT&amp;Tag-Multiom-Protokoll, das direkte räumliche Barcodierung eines Gewebeschnitts mit einer Einzelzell-Multiomanalyse kombiniert. Dieser Ansatz ermöglicht räumlich aufgelöste Einzelzellprofilierung der Genexpression und der Histon-H3K27ac-Modifikation gleichzeitig und bietet mechanistische Einblicke in die Genregulation im Kontext der Gewebemikroanatomie.

räumlich aufgelöste, integrierte einzelzellige multiomische Profilierung des Transkriptoms und epigenomischen Zielen in gefrorenen Gewebeschnitten

Erfahren Sie die automatisierte Probenvorbereitung für die multiplexierte Analyse einzelzelliger Histon-Posttranslationalen Modifikationen. Diese Methode ermöglicht hochsensitive und reproduzierbare Chromatin-Profiling-Studien.

Automatisierte Probenvorbereitung für die multiplexierte Analyse einzelzelliger Histon-Posttranslationalen Modifikationen (sc-hPTM2) (Video) | JoVE Journal

Automatisierte Probenvorbereitung für die multiplexierte Analyse einzelzelliger Histon-Posttranslationalen Modifikationen (sc-hPTM2)

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