Dual-modale molekulare Kartographie: Integration der Multiplex-mRNA-Detektion mit der Protein-Imaging-Massenzytometrie

Wir konzentrieren uns auf die Spezialbiologie, um die molekularen Mechanismen von Eierstockkrebs besser zu verstehen, in der Hoffnung, neue therapeutische Ziele und Biomarker zur Vorhersage des Überlebens von Patienten zu finden. Eine der aktuellen IMC-Herausforderungen umfasst die Dissektion von Proteinen mit geringerer Häufigkeit, die Arbeit der Antikörpervalidierung und -titration sowie die komplexe und zeitaufwändige Pixelklassifikation während der Analyse. Beginnen Sie damit, überschüssige Flüssigkeit aus den vorbereiteten FFPE-Objektträgern zu entfernen.

Nimm das Feuchtigkeitskontrollblech aus dem Ofen und setze den Schlittenhalter in das Blech. Dann wirbelt man RNA-ISH-Verstärker 3 gründlich und fügt genug Reagenz hinzu, um jeden Gewebeschnitt auf den Objektträgern vollständig zu bedecken. Schließe das Blech und setze es für 30 Minuten bei 40 Grad Celsius in den Hybridisierungsofen.

Während der Inkubation wird die Metalloligonukleotidmischung durch Verdünnung jedes Oligos im Verhältnis eins zu 15 vorbereitet. Wirbeln Sie das Metall-Oligo-Misch gründlich und lassen Sie es bis zur weiteren Verwendung bei Zimmertemperatur stehen. Jetzt entferne das Feuchtigkeitskontrollblech aus dem Ofen.

Nimm den Schlittenhalter aus dem Blech und setze das Blech zurück in den Ofen. Dann werden die Objektträger in einen klaren Objektträger gelegt, der mit nukleasefreiem Wasser vorgewaschen wurde. Waschen Sie die Objektträger zwei Minuten lang im Waschpuffer unter leichtem Rühren.

Nachdem Sie überschüssige Flüssigkeit aus den Objektträgern entfernt haben, nehmen Sie das Feuchtigkeitskontrollblech aus dem Ofen und setzen Sie den Schlittenhalter in das Blech. Fügen Sie die zuvor hergestellten Metalloligonukleotide hinzu, um jeden Gewebeschnitt vollständig zu bedecken. Schließen Sie nun das Blech vollständig und setzen Sie es für 45 Minuten bei 40 Grad Celsius in den Hybridisierungsofen.

Entferne das Feuchtigkeitskontrollblech aus dem Hybridisierungsofen, nimm den Folienhalter heraus und bring das leere Blech zurück in den Ofen. Um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren, fügen Sie ein ausreichendes Volumen Blockpuffer hinzu, um jeden Gewebeabschnitt auf dem Objektträger vollständig abzudecken, und inkubieren Sie die Objektträger bei Zimmertemperatur für 30 Minuten. Während die Objektträger inkubieren, bereiten Sie die Antikörpermischung vor, indem Sie die Antikörper mit dem Antikörper-Verdünnungspuffer verdünnen.

Nach Abschluss der Inkubation entsorge den Puffer aus den Gewebeobjektträgern und gib genug von der zuvor vorbereiteten Antikörpermischung ab, um die Gewebeabschnitte vollständig abzudecken. Dann werden die Objektträger in eine Feuchtigkeitskammer gelegt und über Nacht bei vier Grad Celsius inkubiert. Um eine frische Iridium-Interkalator-Lösung herzustellen, wird eine 1-bis-2.000-Verdünnung aus einer 500-Mikromolar-Stocklösung mit RNase-freiem TBS hergestellt.

Legen Sie die Objektträger in einen durchsichtigen Halter, der mit nukleasefreiem Wasser vorgewaschen wurde, und waschen Sie die Objektträger fünf Minuten lang in einem TBS-T-Puffer mit leichtem Rühren. Um die Objektträger zu färben, geben Sie dann die vorbereitete Iridium-Arbeitslösung hinzu und befruchten Sie sie fünf Minuten bei Zimmertemperatur. Danach werden die Objektträger in einen durchsichtigen Objektträger gelegt, der mit nukleasefreiem Wasser vorgewaschen wurde.

Waschen Sie die Objektträger zweimal in einem TBS-T-Puffer mit leichtem Rühren für fünf Minuten. Tauchen Sie die Objektträger dann schnell in doppelt destilliertes Wasser, um eine Salzkristallisation durch TBS auf dem Gewebe zu verhindern. Trocknen Sie die Objektträger 10 Minuten unter einer chemischen Haube und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius bis zur Bildaufnahme.

Laden Sie den vorbereiteten Objektträger in die Ablationskammer des bildgebenden Massenzytometriesystems. Machen Sie ein Panoramabild der Folie, um das interessante Gebiet zu identifizieren. Mit der Bildaufnahmesoftware markieren Sie die gewünschten Interessensgebiete auf dem Panoramabild.

Wenden Sie die Erfassungsvorlage in der Bildaufnahmesoftware an. Und die Laserleistung entsprechend dem Probentyp anpassen. Beginnen Sie jetzt mit dem Laserablationsprozess.

Messen Sie die Menge jedes Isotops mit dem Detektor, der die Daten zur Analyse in digitale Form umwandelt. Der Aktivierungsstatus der CD8-T-Zellen wurde mittels Kodetektion von Granzym B sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinniveau sowie auf Interferon-Gamma-Positivität bewertet. Ein krebsassoziierter Fibroblast wurde gezeigt, dass er MFAP5-Protein und POSTN-mRNA exprimiert, beides Marker für die Aggressivität krebsassoziierter Fibroblasten.

Es wurde gezeigt, dass eine CD4-T-Zelle IL17A- und IL6-mRNA ko-exprimiert, was mit der TH17-Zellidentität übereinstimmt. CD4-T-Zellen wurden beobachtet, die IL13-mRNA exprimierten. Keratin-positive CD47-positive Tumorzellen wurden in der Nähe einer CD8-T-Zelle gezeigt.

Es wurde gezeigt, dass eine aktivierte CD8-T-Zelle das CD25-Protein exprimiert. Eine vergleichbare mRNA-Färbung von THBS2 und CD47 wurde zwischen metallkonjugierten und fluoreszierend markierten Protokollen beobachtet.