Eine einfache Methode zur Glucosinolate Extraktion und Analyse mit Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC)

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, eine einfache und unkomplizierte Analyse von Glucosinolaten in Pflanzen und anderen biologischen Proben durchzuführen. Diese Methode zur Extraktion und Analyse von Glucosinolaten kann zur Beantwortung zentraler Fragen in der Pflanzen-Insekten-Ökologie, Pflanzenpathologie, Pflanzenzüchtung und Lebensmittelwissenschaft verwendet werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie gut validiert und auf eine Vielzahl biologischer Proben anwendbar ist.

Obwohl diese Methode hauptsächlich zur Quantifizierung von Glucosinolaten in pflanzlichen Materialien verwendet wird, kann sie auch auf Böden oder zubereitete Lebensmittel angewendet werden. Dieses Extraktionsverfahren kann in fast jedem Labor durchgeführt werden, da Sie meist Standard-Laborgeräte verwenden. Im Allgemeinen führen Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, die Analysen und Inspektionen besser durch, wenn sie den Film mindestens einmal lesen und beobachten.

Mischen Sie zu Beginn des Eingriffs 10 Gramm G-25 vernetztes Dextrin-Gel mit 125 Millilitern Reinstwasser. Lagern Sie die Mischung in einer verschlossenen Flasche bei 4 Grad Celsius. Lösen Sie dann 10.000 Einheiten der Arylsulfatase vom Typ H-1 in 30 Millilitern Reinstwasser auf.

Füge dazu 30 Milliliter absolutes Ethanol hinzu und rühre die Mischung gut um. Die Mischung bei 2.650 mal G für 20 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. Den Überstand mit 90 Millilitern absolutem Ethanol in einem Becherglas vermengen.

Mischen und in neue Zentrifugenröhrchen gießen. Die Mischung wird bei 1.030 mal G 15 Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Entsorgen Sie den Überstand.

Lösen und verbinden Sie die Pellets in insgesamt 25 Millilitern Reinstwasser. Die Mischung gut einreiben und dann in 1-Milliliter-Röhrchen umfüllen. Lagern Sie die Sulfatatproben bis zu einem Jahr bei 20 Grad Celsius.

Wiegen Sie als Nächstes etwa 90 Milligramm Sinogramm und notieren Sie das Gewicht mit einer Genauigkeit von 1 Mikrogramm. Lösen Sie dann das Sinogramm-Monohydrat in 10 Millilitern Reinstwasser auf. Aus dieser Sinogramm-Stammlösung werden fünf Referenzlösungen mit Konzentrationen von 50 bis 750 Mikromolar hergestellt.

Lagern Sie die Referenzlösungen in 1,5-Milliliter-Röhrchen bei 20 Grad Celsius. Beschriften Sie anschließend für jede Probe und Referenz ein 2-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen in einer Säulengestellposition. Durchstechen Sie jede Kappe des Mikrozentrifugenröhrchens mit einer Präpariernadel für die spätere Gefriertrocknung.

Platzieren Sie die beschrifteten Röhren in einem Block in der gleichen Konfiguration und im gleichen Abstand wie die beschrifteten Spalten. Um die Pipettensäulen aus Glas vorzubereiten, drücken Sie mit einem Holz- oder Glasstab vorsichtig ein 1 Zentimeter mal 1 Zentimeter großes Stück Glaswolle in die Pipette. Packen Sie die Glaswolle am Übergang vom Pipettenzylinder zum Stiel.

Platzieren Sie eine Pipettensäule an jeder beschrifteten Position auf dem Rack. Positionieren Sie den Korb über einer Abfallschale. Schneiden Sie das Ende einer 1-Milliliter-Pipettenspitze aus Kunststoff ab.

Schütteln Sie das vorbereitete Dextrin-Gel gut. Und dann verwenden Sie die verbreiterte Pipettenspitze, um 0,5 Milliliter des vorbereiteten Dextringels in jede Säule zu laden. Überprüfen Sie die Säulen auf auslaufendes Dextringel und ersetzen Sie alle undichten Säulen.

Sobald alle Säulen mit Dextringel beladen sind, waschen Sie jede Säule mit 1 Milliliter Reinstwasser. Wiegen Sie zwischen 50 und 100 Milligramm Freigang, fein gemahlenes Pflanzenmaterial in einem 2-Milliliter-Reaktionsröhrchen mit Sicherheitskappe und erfassen Sie das Gewicht mit einer Genauigkeit von 0,1 Milligramm. Legen Sie zwei Metallkugeln mit einem Durchmesser von 3 Millimetern in jedes Rohr.

In jedes Röhrchen 1 Milliliter 70%iges Methanol in Reinstwasser geben und jede Mischung kurz vortexen. Verschließen Sie die Röhrchen mit zusätzlichen Sicherheitskappen und legen Sie sie sofort in ein 90 bis 92 Grad Celsius heißes Wasserbad. Die Rohre erhitzen, bis der Sägesatz zu kochen beginnt.

Übertragen Sie die Röhrchen in ein Ultraschallbad und erhitzen Sie die Proben 15 Minuten lang. Beginnen Sie während der Beschallung mit dem Auftauen der Sulfatatprobe und der Sinogrammreferenzen. Nach der Beschallung werden die Proben bei 2.700 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert.

Legen Sie die Überstände und die aufgetauten Sinogrammreferenzen auf die entsprechenden Spalten und achten Sie darauf, dass kein Pflanzenmaterial in die Pipette gezogen wird. Geben Sie 1 Milliliter 70%Methanol in jedes Röhrchen. Die Mischungen vernetzen.

Und Ultraschall erhitzen Sie die Mischungen 15 Minuten lang. Zentrifugieren Sie die Röhrchen erneut unter den gleichen Bedingungen wie zuvor. Laden Sie die Überstände auf die entsprechenden Spalten.

Geben Sie zwei 1-Milliliter-Portionen 70%Methanol in jede Säule, so dass die Säulen zwischen den einzelnen Portionen trocken laufen können. Waschen Sie das restliche Methanol aus jeder Säule mit 1 Milliliter Reinstwasser. Waschen Sie dann jede Säule mit zwei 1-Milliliter-Portionen 20 Millimolar Natriumacetat-Puffer, pH 5,5.

Sobald die letzten Portionen Natriumacetatpuffer in den Abfallkorb abgelaufen sind, nehmen Sie den Korb aus dem Abfallbehälter und trocknen Sie die Füße des Korbs mit einem Taschentuch ab. Positionieren Sie das Gestell über dem Block mit den beschrifteten Mikrozentrifugenröhrchen, so dass sich die Säulenspitzen in den entsprechenden Röhrchen befinden. Laden Sie 20 Mikroliter Sulfatatlösung auf jede Säule und stellen Sie sicher, dass die Lösung die Oberfläche des Säulenmaterials erreicht.

Spülen Sie die Sulfatatlösung mit 50 Mikrolitern Natriumacetatpuffer in das Säulenmaterial. Es ist sehr wichtig, dass das Sulfatat in die Säule gespült wird. Das Enzym muss sich auf der Säule befinden, um mit den intakten Glucosinolaten zu reagieren, die an der Säule gebunden sind.

Nachdem die Sulfatatlösung auf jede Säule gewaschen wurde, decken Sie die Säulen mit Aluminiumfolie ab. Lassen Sie die Säulen über Nacht stehen. Als nächstes spielen Sie die De-Sulfo-Glucosinolate aus jeder Säule mit zwei 0,75-Milliliter-Portionen Reinstwasser an.

Sobald die Säulen trocken gelaufen sind, entfernen Sie das Säulengestell und verschließen Sie jedes Rohr. Frieren Sie die Röhrchen in flüssigem Stickstoff oder bei 80 Grad Celsius für mindestens 30 Minuten ein. Trocknen Sie die Proben 12 bis 24 Stunden lang.

Löse jeden Rückstand in 1 Milliliter Reinstwasser auf. Übertragen Sie dann jede Probe und Referenz in markierte HPLC-Probenfläschchen. Trennen Sie die Extrakte auf einer CAT-Säule mit umgekehrter Phase.

Verwenden Sie eine Detektionswellenlänge von 229 Nanometern. Nach der Trennung durch HPLC können die Glucosinolate durch Vergleich von Retentionszeiten und UV-Spektren mit bekannten Glucosinolatstandards identifiziert werden. Die Glucosinolat-Konzentrationen in der Probe werden aus einer Sinogramm-Kalibrierungskurve und Literaturwerten für Ansprechfaktoren berechnet.

Daraus können die Glucosinolat-Konzentrationen in der ursprünglichen Pflanzenprobe bestimmt werden. Unter den verwendeten HPLC-Bedingungen spielt das kranke Progoitrin recht früh an und wird vom biologisch nützlichen Glucoraphanin getrennt. Die Endo-Glucosinolate sind ebenfalls gut voneinander getrennt.

Lyotrope Reihen werden mit zunehmenden Seitenkettengliedern für Alconol, Methylfol-Alconol und längerkettige Methyl-Solfinol-Glucosinolate beobachtet. Unbekannte Glucosinolate können somit anhand dieser lyotropen Reihen in Kombination mit UV-Spektren vorläufig klassifiziert werden. Bei richtiger Vorbereitung können 150 bis 200 Proben von einer Person an einem Arbeitstag entnommen werden.

Es wird einen weiteren Tag dauern, bis die Säulen die Proben gefriergetrocknet und für die HPLC vorbereitet sind. Nach diesem Verfahren können andere Methoden, wie z. B. LCMS, angewendet werden, um unbekannte Desulfo-Glucosinolate in Ihrem Chromatogramm zu identifizieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Glucosinolate aus Ihren biologischen Proben extrahieren und per HPLC analysieren können.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Methanol äußerst gefährlich sein kann und immer unter dem Abzug erfolgen sollte.