Name: Eine einfache Methode zur Glucosinolate Extraktion und Analyse mit Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Lernen Sie eine einfache Methode zur Extraktion und HPLC-Analyse von Glucosinolaten aus Pflanzenmaterial. Dieses validierte Protokoll ermöglicht Forschern die Quantifizierung dieser sekundären Pflanzenstoffe in verschiedenen biologischen Proben.

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NMvD dankt Dr. Michael Reichelt (Max-Planck-Institut für chemische Ökologie, Jena, Deutschland) für die Bereitstellung der ersten Referenzproben, als sie vor 16 Jahren begann, diese Methode anzuwenden. Ciska Raaijmakers (NIOO-KNAW, Wageningen, Niederlande), Sebastian Krosse (B-Ware, Nijmegen, Niederlande) und Christian Ristok (iDiv, Leipzig) werden für die Verbesserung des Protokolls im Laufe der Jahre gewürdigt. Mirka Macel und Martine Huberty (Universität Tübingen, Deutschland) werden für ihre Erlaubnis zur Verwendung des Rorippa-Chromatogramms gedankt. Die Autoren danken dem Deutschen Zentrum für integrative Biodiversitätsforschung (iDiv) Halle-Jena-Leipzig, gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (FZT 118).

1. Herstellung von Lösungen für die Glucosinolate Extraktion benötigt <ol><li> Bereiten Sie 500 ml 70% Methanol (MeOH) in Wasser (Reinst-) in einer Glasflasche. Für 100 Proben und 5-Norm, 420 ml 70% MeOH benötigt. </li><li> Es werden 20 mM Natriumacetat (NaOAc) (pH = 5,5) durch Zugabe von 0,82 g NaOAc oder 1,36 g NaOAc · 3 H 2 O in 500 ml Wasser; der pH-Wert mit Chlorwasserstoff (HCl). Bewahren Sie die NaOAc in den Kühlschrank stellen. Für 100 Proben und 5-Norm, 370 ml 20 mM NaOAc (pH = 5,5) in Wasser benötigt wird. </li><li> Um das Säulenmaterial vorbereiten, mischen 10 g vernetztes Dextran-Gel (Typ G-25) mit 125 ml Reinstwasser. Speichern das erhaltene Gemisch in einem Kühlschrank (4 ° C). </li><li> Herstellung der Sulfatase-Lösung <ol><li> Löse 10.000 Einheiten Arylsulfatase (Typ H-1 von Helix pomatia) in 30 ml Reinstwasser und 30 ml absolutem Ethanol (EtOH). Mischen Sie die Lösung gut und überträgt es auf ein 250-ml-centrifuge Rohr oder mehrere kleinere Rohre, je nach Verfügbarkeit. </li><li> Zentrifugieren der Mischung bei 2650 × g für 20 Minuten bei Raumtemperatur (RT). Den Überstand (s) in einen Becher; 90 ml EtOH und es mischen. Zentrifugieren der Mischung in einer oder mehreren Zentrifugenröhrchen bei 1.030 xg für 15 min bei RT. </li><li> Die Überstände verwerfen. Auflösen und die Pellets in insgesamt 25 ml Reinstwasser kombinieren. Vortex gut, verzichtet werden in 1-ml-Röhrchen und lagern in einem Gefrierschrank bei -20 ° C; sie werden für mindestens ein Jahr halten. </li></ol></li><li> Vorbereitung der sinigrin Referenzlösung <ol><li> Wiegen in etwa 9 mg sinigrin Monohydrat mit 1 ug - Genauigkeit (zB 8,769 mg). Bringen Sie es in einen 10-mL-Messkolben und löst den sinigrin Monohydrat in 10,0 ml Reinstwasser. </li><li> Berechnen Sie die Molarität der Stammlösung und bereiten fünf sinigrin Referenzen zwischen 50-750 &amp; mgr; M von der Stammlösung verdünnt wird. Ein ausführliches Beispiel finden<html> <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55425/20160918GrosservanDamJoVEGlucosinolates_S1.docx" target="_blank">Ergänzende Datei</a> - <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55425/20160918GrosservanDamJoVEGlucosinolates_S1.docx" target="_blank">S1</a> . </li><li> Dispense die verschiedenen sinigrin Referenzen in 1,5 ml-Reaktionsgefäße und frieren sie bei 20 ° C. Umfassen eine Reihe von fünf sinigrin Referenzen in jedem Extraktions Charge. Verwenden Sie immer die richtigen Molarität Werte für die aktuell sinigrin Referenzen verwendet, wenn die Konzentrationen zu berechnen. </li></ol></li></ol> 2. Herstellung des Extraktionseinrichtungs <ol><li> Bereiten Sie eine Spalte Gestell für die Pipette Säulen Pasteur (zur Herstellung von Säulen, siehe Schritt 3.1). Beschriften Sie die Rack oder die Spalten Spur der Probennummern zu halten (siehe Abbildung 1). </li><li> Bereiten Sie einen Block hält die gleiche Anzahl von markierten 2-ml - Mikrozentrifugenröhrchen (siehe Schritt 3.3 und Abbildung 1) </li></ol>5 / 55425fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1: Rack für Glucosinolat Extraktion. Frontansicht (links) und Draufsicht (rechts) einer selbstgemachten Spalte Rack und Block für die Glucosinolat Extraktion. Höhe: 100 mm, Abstand zwischen den verschobenen Bohrungen (die Pasteurpipette Spalten zu halten): 30 mm (x-Achse) x 15 mm (y-Achse). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55425/55425fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55425/55425fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 3. Vorbereitung der Säulen und Reaktionsgefäße <ol><li> Bereiten Sie eine Spalte pro Probe und fünf zusätzliche Spalten für die fünf sinigrin Referenzproben. <ol><li> In jedem Glaspipette, legen Sie ein Stück Glaswolle ca. 1 cm x 1 cm. Verwenden Sie einen Holz- oder Glasstab die Glaswolle bis zu dem Punkt zu schieben, wo die Pipette verengt. Die Glaswolle sollte das Säulenmaterial vor knapp, verhindern aber auch nicht viel nutzen, da sie die Elution der Säulen verlangsamen wird. Handschuhe tragen when mit der Glaswolle arbeiten. </li></ol></li><li> Legen Sie die Spalten auf der Säule Rack (siehe Abbildung 1). Die Säule Rack in einem Laborschale (Abfallbehälter) Eluenten für die aufeinanderfolgenden Spalte Waschungen verwendet zu fangen. </li><li> Schneiden Sie die ersten 5 mm von der Spitze eines Kunststoff-1-ml-Pipettenspitze und Pipette 0,5 ml der vorbereiteten Säulenmaterial (G-25-Gel in Wasser, siehe Schritt 1.3) in jeder Spalte. Schütteln Sie die Flasche mit dem Säulenmaterial gut vor dem Pipettieren enthält. Entsorgen Sie undichte Spalten (G-25 Material durch die Glaswollschicht läuft aus) und durch neue ersetzen. <ol><li> Nach dem Pipettieren der Säulenmaterial in die Spalten, 1 mL Reinstwasser, um das Material hinunterspülen. </li></ol></li><li> Bereiten Sie eine 2-ml-Reaktionsröhrchen pro Probe und fünf Röhrchen für die fünf sinigrin Proben; beschriften. Verwenden, um eine Dissektion Nadellöcher in den Kappen für die spätere Gefriertrocknung zu machen und die vorbereiteten Rohre in den Rohrblock in der exakt gleichen Muster wie der OrtSpalten (Schritt 2.2, siehe Abbildung 1). </li></ol> 4. Extraktion von Glucosinolaten <ol><li> Wiegen gefriergetrocknet und fein gemahlenes Pflanzenmaterial (in der Regel 50,0 bis 100,0 mg Trockengewicht, die endgültigen Glucosinolat Konzentrationen im Extrakt im Bereich der Referenzkurve sein sollte) auf die nächsten 0,1 mg in 2 ml, etikettiert, rund -bottom Reaktionsrohre. Fügen zwei kleine Metallkugeln (3 mm Durchmesser) als Schutzmittel zu jedem Röhrchen Sieden. HINWEIS: Das Protokoll kann auch an die frische, schockgefroren Materialien angewendet werden, die unter flüssigem Stickstoff gemahlen wurde und gehalten bis zur Extraktion eingefroren. Erhöhen , um die Menge an Material für die Extraktion und den Prozentsatz an MeOH in der Extraktionsflüssigkeit auf 85% abgewogen zur Verdünnung durch das Wasser in den Materialien 19 zu kompensieren. </li><li> Pipette 1 ml 70% MeOH in jedes Röhrchen und Wirbel kurz. Schließen Sie die Rohre und versiegeln sie mit Schutzkappen, bevor sie so schnell wie möglich in eine heiße Platzierung water Bad (90-92 ° C) für ein paar Minuten (~ 5 min), bis 70% MeOH kocht einfach. Achtung: Schutzbrille tragen bei diesem Schritt! </li><li> Platzieren Sie die Probenröhrchen in einem Ultraschallbad für 15 min. Unterdessen nehmen die Sulfatasen und die fünf sinigrin Referenzproben aus dem Gefrierfach sie bei RT auftauen. </li><li> Zentrifugieren Sie die Probenröhrchen bei 2700 × g in einer Tischzentrifuge Nach Ultraschallbehandlung, 10 min bei RT; ein Pellet sollte in jedem Rohr zu bilden. Fügen Sie die Überstände an die markierten Spalten und Pipette die fünf Referenzproben auf separaten Spalten. <ol><li> Während der Überstände Pipettieren, halten Sie die Spitze weit über dem Pellet Pipettieren Pflanzenmaterialien zu vermeiden. Beachten Sie, dass bei getrockneten Proben verwendet werden, wird der Überstand Volumen weniger als 1,0 ml betragen. </li></ol></li><li> 1 ml 70% MeOH auf die verbleibenden Pellets in den Probenröhrchen und die Röhrchen verwirbeln, bevor sie in einem Ultraschallbad für 15 min platziert. Zentrifugieren Sie die Röhrchen wieder, wie in Schritt 4.4, und fügen Sie den supernanern zu den entsprechenden Spalten; aufgrund der Eigenschaften des Säulenmaterials, wird der negativ geladene Sulfatgruppe der Glucosinolate spezifisch auf der Säule zurückgehalten werden. </li><li> Waschen der Säulen mit den Extrakten in drei aufeinanderfolgenden Schritten. <ol><li> Pipette 2 x 1 ml 70% MeOH auf jede Säule. Warten Sie auf die Spalte trocken laufen, bevor die nächsten 1 ml Zugabe; Dies wird mehr unpolare Verbindungen , die aus den Extrakten (zB Chlorophyll) entfernen. </li><li> Spülen Sie die MeOH durch Zugabe von 1 ml Reinstwasser auf jede Säule. </li><li> Pipette 2 x 1 ml 20 mM NaOAc-Puffer zu jeder Spalte, die optimalen Bedingungen für die Reaktions Sulfatase zu schaffen. </li></ol></li><li> Nehmen Sie das Rack mit den Säulen aus dem Abfallbehälter und trocknen Sie die Füße des Gestells mit einem Gewebe. Legen Sie das Rack über den Block mit Fläschchen und markierten Röhrchen. Stellen Sie sicher , dass jede Spalte Spitze in der entsprechenden, beschriftet, 2-ml - Röhrchen (siehe Abbildung 1). </li><li> In 20 ul Sulfatsulfatase solutiauf den Säulen. Sicherzustellen, dass das Sulfatase die Oberfläche des Säulenmaterials erreicht. Je 50 ul NaOAc auf jede Säule puffern die Sulfatase zu spülen nach unten. Decken Sie die Spalten mit Aluminiumfolie und über Nacht stehen gelassen. Hinweis: Durch die Tätigkeit der Sulfatase, wird die Sulfatgruppe entfernt werden, die Freigabe der desulfoglucosinolates aus der Säule, so dass sie mit dem Wasser zu eluieren kann. Eine ausführliche Beschreibung finden Sie Crocoll et al. 19. </li><li> Am nächsten Tag eluieren desulfoglucosinolates durch Pipettieren von 2 x 0,75 ml Reinstwasser auf jede Säule. Wenn alle Spalten trocken laufen haben, heben Sie den Säulengestell und entfernen Sie sie aus den Reaktionsrohren. <ol><li> Verschließen Sie die Rohre (stellen Sie sicher, dass es Löcher in den Kappen) und frieren sie in flüssigem Stickstoff oder in einem -80 ° C Gefrierschrank für 30 min. Gefriertrocknungs die Proben für 12-24 h (in Abhängigkeit von der Anzahl der Proben und die Kapazität des Gefriertrockners) das gesamte Wasser zu entfernen. </li></ol></li> &lt;li&gt; Nach dem Gefriertrocknen wieder löse den Rückstand in einem exakten Volumen (in der Regel 1,0 ml) von Reinstwasser. Übertragen Sie die Proben und die fünf sinigrin Verweise auf markierten HPLC-Ampullen. Halten Sie die Proben in einem Kühlschrank (4 ° C) für bis zu zwei Wochen oder einen Gefrierschrank (-20 ° C) für bis zu einem Jahr vor ihnen mit HPLC zu analysieren. </li><li> Lassen Sie die Glassäulen unter der Haube über Nacht trocknen und entsorgen sie trocken, wenn. Recover die Metallkugeln aus den Probenröhrchen, die in Schritt 4.5 für die Wiederverwendung und setzen die Rohre in der Entsorgungsbehälter. </li></ol> 5. HPLC-Messungen von Proben Heraus <ol><li> Trenne die Glucosinolate auf einer Umkehrphasen - C 18 -Säule (4,6 x 150 mm, 3 &amp; mgr; m, 300 Å) mit einem Acetonitril-Wasser - Gradienten (siehe Tabelle 1) und einen Fluß von 0,75 ml / min und einer Säulentemperatur von 40 ° C . Führen Nachweis und die Quantifizierung bei 229 nm. </li><li> Messen Sie die Sinigrin Verweise auf derselben Spalte, jedoch mit einem angepaßten GradientenVerfahren der Verwendung von Lösungsmitteln zu reduzieren (siehe Tabelle 2). Starten Sie die fünf sinigrin Referenzen mit Injektion, mit der niedrigsten Konzentration mit dem Referenz beginnen. Dann injizieren die Proben, einschließlich einer Methanolinjektion (leer) nach jeder zehnten Probe die Säule zu reinigen und die Verschleppung von Spitzen zu verhindern. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Zeit [min] </td><td> Durchfluss [ml / min] </td><td> % Ein Wasser </td><td> % B ACN </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 0,750 </td><td> 98 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> 35 </td><td> 0,750 </td><td> 65 </td><td> 35 </td></tr><tr><td> 40 </td><td> 0,750 </td><td> 98 </td><td> 2 </td></tr><tr><td colspan="4"> Säulentemperatur 40 ° C. </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Acetonitril-Wasser - Gradienten für Glukosinolat Trennung und analysis auf Umkehrphasen-HPLC. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Zeit [min] </td><td> Durchfluss [ml / min] </td><td> % Ein Wasser </td><td> % B ACN </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 0,750 </td><td> 98 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> 10 </td><td> 0,750 </td><td> 89.3 </td><td> 10.7 </td></tr><tr><td> 11 </td><td> 0,750 </td><td> 98 </td><td> 2 </td></tr><tr><td colspan="4"> Säulentemperatur 40 ° C. </td></tr></tbody></table> Tabelle 2: Verkürzte Acetonitril-Wasser - Gradienten zur Quantifizierung der fünf sinigrin Referenzen für die Quantifizierung von Glucosinolaten verwendet. 6. Glucosinolate Identifizierung und Quantifizierung <ol><li> Identifizierung <ol><li> Vergleichen Sie die UV-Spektren und Retentionszeiten der Peaks in den Proben mit handels availder Lage, reine Glukosinolat Referenzen. Siehe Abbildung 2 für Beispiele von UV - Spektren von den verschiedenen Glukosinolat Klassen. </li><li> Identifizieren Sie unbekannte Glucosinolate mit Referenzstandards oder auf LC-MS 18, 19, wenn möglich. </li><li> Identifizieren Sie unbekannte Glucosinolate mit Kernspinresonanz (NMR), wenn möglich. </li><li> Vergleichen Sie die UV - Spektren und Retentionszeiten der Peaks mit denen in Figur 2 und Tabelle 3, Datenbanken oder Literaturverweise. </li></ol></li></ol><img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55425/55425fig2.jpg" /> Abbildung 2. UV - Spektren der häufigsten Glukosinolat Klassen. UV-Absorptionsspektren (200-350 nm) von sechs desulfoglucosinolates (GSL), bezogen auf Lösungen von handelsüblichen Referenzverbindungen hergestellt extrahiert, wie hier beschrieben, die die häufigste Strukturklassen. Der gemeinsame Name, structural Namen (in Klammern) und Strukturklasse gegeben. (A) Sinigrin (2-propenyl GSL) -Alkenyl; (B) glucoerucin (4-methylthiobutyl GSL), thioalkenyl; (C) glucoraphanin (4-methylsulfinlybutyl GSL) sulfinyl; (D) Glucobrassicin (indol-3-ylmethyl GSL) indol; (E) Gluconasturtiin (2-phenylethyl GSL), aromatisch; (F) Sinalbin (4-hydroxybenzyl GSL), aromatisch. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55425/55425fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55425/55425fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol start="2"><li> Quantifizierung <ol><li> Integrieren Sie die Fläche unter den Spitzen der fünf sinigrin Referenzen und den Proben. </li><li> Berechnen einer Eichkurve der fünf gemessenen sinigrin Referenzen auf der Basis der integrierten Fläche. Verwenden Sie die Gleichung der Regressionsgeraden (siehe Gleichung 1), um die interpoliert Menge an Glucosinolaten zu berechnen (siehe Gleichung 2).</li><li> Um die Konzentration der verschiedenen Glucosinolate berechnen, multiplizieren die interpolierte Menge (x) von der Reaktionsfaktor (M) für die Detektion bei 229 nm von EC (1990) 16, Buchner (1987) 15 oder Brown et al. (1993) 17; die Konsensus - Responsefaktoren der am häufigsten festgestellt desulphoglucosinolates sind in Tabelle 3 angegeben. HINWEIS: Die Responsefaktoren durch verschiedene Referenzen bei unterschiedlichen Werten zwischen system dies mag der Grund sein, dass es (siehe Referenzen 15-17) variieren. Dennoch sind die Werte meist ganz in der Nähe und in einem ähnlichen Bereich mit Strukturklassen. Im Anschluss an die Konvention, stellen Sie den Responsefaktor von nicht identifizierten Glucosinolate zu 1, obwohl für unbekannte Indolglucosinolaten mit einem UV - Spektrum ähnlich dem von Glucobrassicin und andere Indolglucosinolaten (Abbildung 2), wäre es ratsam, 0,25 als Responsefaktor zu verwenden , zu erhalteneine realistische Schätzung der Konzentration (Tabelle 3). </li><li> Um die endgültige Menge an Glucosinolaten (x t) in der Probe, nehmen Sie den Verdünnungsfaktor (D) und die Masse der Probe (w) berechnet für die Analyse berücksichtigt (siehe Gleichung 3). <img alt="Gleichung" src="/files/ftp_upload/55425/55425eq1.jpg" /> (1) <img alt="Gleichung" src="/files/ftp_upload/55425/55425eq2.jpg" /> (2) <img alt="Gleichung" src="/files/ftp_upload/55425/55425eq3.jpg" /> (3) y = Peakfläche m = Steigung der Referenz 5-Punkt-Regressionskurve c = der Schnittpunkt der Regressionsgeraden mit der y-Achse x = Menge an Glucosinolaten im Extrakt x t = Konzentration an Glucosinolaten in der Pflanzenprobe D = Verdünnungsfaktor M = Responsefaktor für die Detektion bei 229 nm von Buchner (1987) oder Brown et al. (1993) w = Masse der Probe für die Extraktion verwendet </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die größten Vorteile dieser etablierten und am häufigsten verwendeten Verfahren sind, dass sie robust ist, ziemlich einfach und relativ niedriger Kosten pro Probe. Der größte Teil der Ausrüstung für die Extraktion und Analyse erforderlich sind, sollte in einem Standard-Labor zur Verfügung oder können mit Ausnahme der HPLC-PDA selbst gebauten, sein. Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass desulfoglucosinolates in Wasser gelöst sind chemisch recht stabil, wenn sie kühl und luftdicht (HPLC) Fläschchen gehalten, so dass die Extrakte könnten leicht an anderer Stelle für die HPLC-Analyse versendet werden. Im Gegensatz zu LC-MS-Plattformen, die die Software für die Verwaltung und Analyse der Trainingsdaten und umfangreiche praktische Erfahrung erfordern spezielle, HPLC-UV / PDAs können problemlos nach einer kurzen Einarbeitungszeit ausgeführt werden. Dies reduziert nicht nur die Kosten des Verfahrens, sondern macht auch dieses Verfahren für ein breites Spektrum von Wissenschaftlern, darunter Studenten. Im Allgemeinen, wenn die vorstehend geschilderten Verfahren befolgt werden beschrieben carefully, sollten einige Probleme auftreten. In der Regel werden die Glucosinolat Spitzen sehr gut in dem Chromatogramm getrennt. Ist dies nicht der Fall ist, könnte das Gradientenprogramm durch Verringern der Steigerungsrate von Acetonitril in dem Eluenten angepasst werden. Alternativ kann das Problem lösen Gebäude in einem neuen Vorsäule (200-500 Injektionen) oder Spalte (1500 -2000 Injektionen). Gelegentlich Chromatogramme einzelner Proben in einer Charge zeigen können sehr kleine oder keine Spitzen. Dies ist in der Regel aufgrund Pipettierfehler wenn die Sulfatasen Zugabe (zB eine Spalte übersprungen wurde oder der Sulfatase nicht richtig nach unten in die Säule gewaschen). Alternativ kann der Glucosinolat-Konzentration in den experimentellen Materialien niedriger als erwartet und zu wenig Material wurde für die Extraktion verwendet. Wenn letzteres der Fall ist, kann das Injektionsvolumen auf 100 &amp; mgr; l erhöht werden, oder eine genaue Aliquot (beispielsweise 800 &amp; mgr; l) der Extrakt konzentriert werden konnte. Letzteres könnte durch Gefriertrocknungs erreicht werdening des Extrakts, der Rückstand in einem kleineren Volumen (beispielsweise 100 &amp; mgr; l) Wasser löst und Reinjezierung die gleichen Bezugskurve. In den Berechnungen für die ursprüngliche Konzentration des Extrakts, sollten die Zahlen mit dem Verdünnungsfaktor multipliziert. Wenn dies das Problem nicht lösen, sollten die Materialien wieder mehr Ausgangsmaterial verwendet werden, extrahiert. Wenn diese mehr als 100 mg ist, sollte das Volumen der Extraktionslösungsmittel und die Größe der Röhren proportional die Extraktionseffizienz aufrechtzuerhalten eingestellt werden. Ein zusätzlicher Vorteil ist, dass diese Methode gut validiert wurde. Dies ist , weil es als Standardverfahren zur Quantifizierung von Glucosinolaten in Raps beschrieben worden ist , bei denen die Verfahren und Genauigkeit wurden 16 in mehreren Labors bestätigt. Darüber hinaus sind die genetischen Hintergrund, Biosynthese und biologischen Funktionen von Glucosinolaten Gegenstand intensiver Forschungsanstrengungen, die in model Pflanze Arabidopsis thaliana unter anderem 4, 6, 12. Daher sind viele Reaktionsfaktoren für die genaue Quantifizierung von desulfoglucosinolates in Bezug auf sinigrin gut definiert und öffentlich verfügbar 15,17. Auch wenn LS-MS-basierte Protokolle mehr mit hohem Durchsatz sind, empfindlicher, und sind in der Lage (vorläufig) identifizieren Glucosinolate , für die keine Standards verfügbar sind 18, 19, 20, das Fehlen von Universal-Response - Faktoren für die LC-MS begrenzt die exakte Quantifizierung von Glucosinolat Konzentrationen 18. Hinzu kommt, dass diese Verfahren in der Regel kein Gefriertrocknungsschritt umfassen, und die Wassermenge in dem Frischpflanzenmaterial nachgewiesenes in den Berechnungen exakte Quantifizierung schwierig macht. Schließlich, weil unser Extraktionsverfahren eine spaltenbasierte beinhaltetReinigungs- und Konzentrationsschritt kann es auch 21 mit geringen Konzentrationen an Glucosinolaten, wie Böden zu &quot;schmutzigen&quot; Proben angewendet werden. Im Vergleich zu LC-MS-basierte Methoden , die in der Regel frisch gefrorene Materialien zu extrahieren, verwenden 96-Well - Platten für die Extraktion, und beinhalten keine Sulfatsulfatase Schritt 18, 19, ist unser Verfahren relativ zeitaufwendig und arbeits intensiv. Mit den Säulengestelle in diesem Papier beschrieben, kann eine einzelne Person etwa 100-150 Proben an einem Tag zu extrahieren. Elution (am nächsten Tag), Gefriertrocknen (über Nacht), und wieder Auflösen kann innerhalb der nächsten zwei Tage stattfinden. Mit einem automatisierten HPLC-Injektor, einem Lauf und Ausgleichszeit von 40-45 min pro Injektion und keine unvorhergesehenen Ereignisse, würde es 3-4 Tage, um die Daten für dieses Beispiel Set zu erwerben. Wenn die HPLC-Software ermöglicht die automatische Quantifizierung basierend auf der sinigrin Kurve, eine manuelle Überprüfung der Chromatogramme und peak-Zuweisungen für 100 Proben können nur eine weitere 1 oder 2 h, bevor die Daten für statistische Analysen verwendet werden können. Trotz der zunehmenden Verfügbarkeit von Glucosinolat Standards, nur ein kleiner Bruchteil der mehr als 130 Kandidaten derzeit im Handel gekauft werden können. Doch mit ein paar Referenzen für jede der Biosynthese Klassen; Zugang zu Literatur - Datenbanken gefunden , die die Verbindungen vorher in den Pflanzenarten spezifiziert (zB Fahey et al . 22); Grundkenntnisse der chromatographischen Prinzipien wie die Logik der Elutrope Reihe (beispielsweise für Zahlen von Cs an der Seitenkette in aliphatischen Verbindungen zunimmt, 3 und 4); und die Validierung einzelner Proben auf LC-MS 19 oder isoliert Glucosinolaten auf NMR 23, kann man leicht diese Einschränkung zu überwinden. Die meisten Protokolle für Glukosinolat analysiert interne Referenzkurven verwenden(Dh eine bestimmte Konzentration für die Gewinnung von Sinigrin oder Sinalbin zu dem Extraktionslösungsmittel 16, 17, 19). Grundsätzlich sind interne Referenzkurven besser geeignet für einzelne Probenverarbeitungsfehler zu korrigieren und damit theoretisch eine höhere Genauigkeit erzielen. Trotz dieses Vorteils bevorzugen wir einen Fünf-Punkte externe Referenzkurve zu verwenden, wie oft wir verschiedene Wildarten zu analysieren, von denen einige ein hohes Maß an sinigrin enthalten (zB Brassica nigra 24) oder Sinalbin (zB Sinapis alba 25), die zwei Glukosinolat Referenzen für die Responsefaktoren zur Verfügung stehen. Außerdem jeder Probe interne Standards Zugabe erhöht die Kosten der Analysen, als hochwertige Standards Glucosinolat Referenz sind in der Regel ziemlich teuer. Abschließend trotz der zeitraubenden Schritte, dieses Protokollbietet eine einfache und zugängliche Methode Glucosinolate in Pflanzenproben zu extrahieren und zu quantifizieren. Jedoch ist es wichtig zu berücksichtigen , dass die Glucosinolatgehalte selbst sind nur einen Hinweis auf die mögliche biologische Aktivität, wie die Notwendigkeit mit Myrosinase zu reagieren zu sehen ist , und die Variation in den Reaktionsprodukten aus einem einzigen Glucosinolat 11 entstehen können. Validierungstests müssen durchgeführt werden, um die biologische Relevanz zu bestätigen.

Es wird geschätzt , dass die Pflanzen mehr als 200.000 verschiedene Arten von chemischen Verbindungen 1 erzeugen. Nur die Minderheit dieser Verbindung scheint eine Rolle in der Pflanzen primären Stoffwechsel, die Brennstoffe Wachstum und Reproduktion zu spielen; die meisten sind so genannte Sekundärmetaboliten. Trotz ihres Namens sind sekundäre Stoffwechsel oft entscheidend für das Überleben der Pflanze und Reproduktion, wie sie dienen Bestäuber anzulocken oder die Pflanze gegen Krankheitserreger und Pflanzenfressern 1 zu verteidigen. Glucosinolate sind eine sehr heterogene Gruppe von sekundären Metaboliten, die 2 für mehr als 150 Jahren untersucht worden. Bis heute wurden mehr als 130 strukturell verschiedenen Glucosinolate wurden 3 identifiziert. Im Großen und Ganzen können Glucosinolate in verschiedene Klassen auf der Aminosäurebasis unterteilt werden, aus denen sie synthetisiert werden. Indolglucosinolaten, sind beispielsweise aus der Aminosäure synthetisiertTryptophan, Phenylalanin während liefert das Grundgerüst für die Synthese von aromatischen Glucosinolaten 4. Innerhalb von Klassen, gibt es eine hohe strukturelle Vielfalt, die um etwa sequentielle Kettenverlängerungsschritte in den Biosynthesewegen, wie in der Klasse der aliphatischen Glucosinolaten, oder durch Seitenkettenmodifikationen (zB Hydroxylierung) 4, 5 gebracht wird. Eine Glukosinolat Pflanzenarten können bis zu 37 verschiedene Glucosinolate aus unterschiedlichen Strukturklassen 6. Auch wenn Pflanzenarten typisch Glucosinolatprofile haben, wird innerartliche Variation für die Typen von Glucosinolaten häufig zwischen den Individuen und Populationen 6 gefunden, 7. Intact Glucosinolate sind in den Vakuolen von Pflanzenzellen gespeichert und kann in jeder der oberirdischen oder unterirdischen organ 7, finden &lt;sup class = &quot;xref&quot;&gt; 8, 9. Bei der Zellbruch (zB durch Herbivorie) werden Glucosinolate freigesetzt und mit dem Enzym Myrosinase gemischt, das Setzen einer Senfölbombe 10 ab. Aufgrund der Aktivität von Myrosinase, und auf der Struktur der Glucosinolat abhängig, den Reaktionsbedingungen und der Anwesenheit von modifizierenden Enzymen, verschiedenen scharf, giftig oder gesundheitsschädliche Verbindungen gebildet werden , wie Nitrile und (iso) Thiocyanate 11. Die Reaktionsprodukte haben eine hohe biologische Aktivitäten; beispielsweise dienen sie als Abschreckungsmittel von Generalisten Insektenpflanzenfressern 12. Die Erblichkeit und Biosynthesewege von Glucosinolaten sind gut untersucht, vor allem wegen ihrer Bedeutung für die Pflanzenfresser und Pathogen - Resistenz, ihren Wert als Aromakomponenten in mustards und Kohl, und ihre negativen (Progoitrin) und positive (glucoraphanin) Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit 5, </sup&gt; 13, 14. Wegen des großen Interesses an Glucosinolaten als biologisch aktive Verbindungen, Extraktion und Detektionsverfahren basierend auf Umkehrphasen - Hochdruck - Flüssigkeitschromatographie (HPLC) , ausgerüstet mit ultraviolettem (UV) oder Photodiodenarray (PDA) Detektoren sind seit den 1980er Jahren 15 allgemein verwendet worden . Auf der Grundlage dieser Methode, erteilt die Europäischen Gemeinschaften ein Standardprotokoll , das für die Analyse von Glucosinolaten in Ölsaaten (Brassica napus, Raps, Canola 16) in mehreren Labors getestet und validiert wurde. Andere aufgenommen zu dieser Methode (zB durch zusätzliche Responsefaktoren für Glucosinolate Bestimmung , die nicht in Raps sind) 17. Trotz der zunehmenden Verfügbarkeit von Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) Plattformen und Hochdurchsatz - Protokolle für Glucosinolatanalyse 18 <sup&gt;, 19, die ursprüngliche HPLC-UV / PDA - Methode ist immer noch weit von den Wissenschaftlern verwendet. Die Hauptgründe dafür sind, dass diese Methode einfach ist, kostengünstig, und relativ leicht zugänglich zu den Labors ohne eine umfangreiche chemisch-analytischen Wissensinfrastruktur. Um zu dienen, diese Gemeinschaft, die wir hier ausführlich das Protokoll für die Extraktion von Glucosinolaten aus Pflanzenmaterialien und die Analyse ihrer Desulfo-Formen mit HPLC-PDA.

<table><tbody><tr><td>Methanol HiPerSolv CHROMANORM&reg; Gradientenqualität für HPLC-Qualität</td><td>VWR</td><td>20864.320</td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetat (NaOAc)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W302406-1KG-K</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>VWR</td><td>1.09057.1000</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A25120-10G</td><td></td></tr><tr><td>(&minus;)-Sinigrin hydrate aus Meerrettich&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1647-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Arylsulfatase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9626-10KU</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>20816.298</td><td></td></tr><tr><td>Pasteurpipette</td><td>Carl Roth</td><td>4518.1</td><td></td></tr><tr><td>Glaswolle</td><td>Carl Roth</td><td>7377.1</td><td></td></tr><tr><td>Glas-/Holzstäbchen</td><td>VWR</td><td>HERE1080766</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Reaktionsgefäße</td><td>VWR</td><td>211-2120</td><td></td></tr><tr><td>Präpariernadel</td><td>Carl Roth</td><td>KX93.1</td><td></td></tr><tr><td>Rotilabo-Laborschalen</td><td>Carl Roth</td><td>0772.1</td><td>Abfallwanne</td></tr><tr><td>Rotilabo-Dichtungsclips</td><td>Carl Roth</td><td>N217.1</td><td></td></tr><tr><td>Gefriertrockner Freezone 12 L</td><td>Labconco</td><td>7960030</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril Supergradientenqualität</td><td>VWR</td><td>83639.320</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>VWR</td><td>462-5112</td><td></td></tr><tr><td>Ultraschallbad</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB 15061</td><td></td></tr><tr><td>PH Elektrode</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>STARA2115</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge Heraeus Multifuge X1</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific 75004210</td><td></td></tr><tr><td>Vorsäule</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>69697</td><td>C18 Säule (4,6 x 10 mm, 5 & Mikro; m, 300 &Aring;)&nbsp;</td></tr><tr><td>Säule Acclaim 300</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>60266</td><td>C18 Säule (4,6 x 150 mm, 3 & Mikro; m, 300 &Aring;)&nbsp;</td></tr><tr><td>HPLC Ultimate 3000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>mit Säulenofen und UV- oder PDA-Detektor</td></tr><tr><td>Kolben 1.000 mL</td><td>VWR</td><td>215-1595</td><td></td></tr><tr><td>Glucosinolat-Referenzverbindungen</td><td>Phytoplan</td><td>diverse</td><td>http://www.phytoplan.de/</td></tr></tbody></table>

eine einfache methode zur glucosinolate extraktion und analyse mit hochdruck-flüssigkeitschromatographie (hplc)

A Straightforward Method for Glucosinolate Extraction and Analysis with High-pressure Liquid Chromatography (HPLC)

Glucosinolate sind eine gut untersuchte und sehr vielfältige Klasse natürlicher Pflanzenstoffe. Sie spielen eine wichtige Rolle für die Widerstandsfähigkeit von Pflanzen, die Qualität von Rapsöl, das Aroma von Lebensmitteln und die menschliche Gesundheit. Die biologische Aktivität der Glucosinolate wird bei einer Gewebeschädigung freigesetzt, wenn sie mit dem Enzym Myrosinase gemischt werden. Dies führt zur Bildung von stechenden und toxischen Abbauprodukten wie Isothiocyanaten und Nitrilen. Derzeit sind mehr als 130 strukturell unterschiedliche Glucosinolate identifiziert. Die chemische Struktur des Glucosinolats ist eine wichtige Determinante des gebildeten Produkts, die wiederum seine biologische Aktivität bestimmt. Letzteres kann von schädlich (z. B. Progoitrin) bis nützlich (z. B. Glucoraphanin) reichen. Jede Glucosinolat-haltige Pflanzenart hat ihr eigenes spezifisches Glucosinolat-Profil. Aus diesem Grund ist es wichtig, die verschiedenen Glucosinolate, die in kohlhaltigen Blättern, Samen und Hackfrüchten oder für ökologische Studien in ihren wilden Verwandten vorkommen, korrekt zu identifizieren und zuverlässig zu quantifizieren. Hier stellen wir eine gut validierte, zielgerichtete und robuste Methode zur Analyse von Glucosinolatprofilen in einer Vielzahl von Pflanzenarten und Pflanzenorganen vor. Intakte Glucosinolate werden aus gemahlenem Pflanzenmaterial mit einem Methanol-Wasser-Gemisch bei hohen Temperaturen extrahiert, um die Myrosinase-Aktivität zu deaktivieren. Danach wird der resultierende Extrakt zur Reinigung auf eine Ionenaustauschersäule gebracht. Nach der Sulfatase-Behandlung werden die Desulfoglucosonolate mit Wasser eluiert und das Eluat gefriergetrocknet. Der Rückstand wird in einem exakten Volumen Wasser aufgenommen, das mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) mit einem Photodiodenarray (PDA) oder Ultraviolettdetektor (UV) analysiert wird. Die Detektion und Quantifizierung erfolgt durch Vergleiche der Retentionszeiten und UV-Spektren kommerzieller Referenzstandards. Die Konzentrationen werden auf der Grundlage einer Sinigrin-Referenzkurve und gut etablierter Ansprechfaktoren berechnet. Die Vor- und Nachteile dieser einfachen Methode im Vergleich zu schnelleren und technologisch fortschrittlicheren Methoden werden hier diskutiert.

Dieses Verfahren ermöglicht die Detektion und Trennung von allgemein gefunden desulfoglucosinolates in allen Strukturklassen (Abbildung 3). Die schädlichen 2-hydroxyglucosinolate Progoitrin kommt relativ früh im Chromatogramm und ist deutlich von dem nützlichen Glukosinolat glucoraphanin, die einzige methylsulfinylglucosinolate in dieser Probe getrennt. Sinigrin, gluconapin und Glucobrassicanapin mit zunehmender Seitenkettenlängen (C3, C4 und C5, bzw.) eine eluotropische Reihe von alkenyl Glucosinolate bilden. Eine ähnliche logische Serie sichtbar ist für die beiden methylthioalkenyl Glucosinolaten, glucoiberverin (C3) und glucoerucin (C4). Die Spitzen der drei Indolglucosinolaten, Glucobrassicin und seine Derivate 4-Hydroxy- und 1-methoxyglucobrassicin (neoglucobrassicin) werden auch klar getrennt. Es sollte beachtet werden, dass die Spitzen der neoglucobrassicin und glucoerucin sowie Gluconasturtiin, die nur aromatische glucosinolate in diesem Beispiel besonders hoch in diesem Brassica Extrakt durch Zusatz von Wurzelextrakte der Mischung 9. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/55425/55425fig3.jpg" /> Abbildung 3: Chromatogramm eines Glucosinolat - Extrakt. Detail (1-32 min) eines HPLC - Chromatogramm aus der Analyse der kombinierten Wurzel- und Sprossproben aus Brassica nigra führt, B. rapa und B. oleracea. Die Peak-Etiketten zeigen die Retentionszeit und die Abkürzungen für identifizierte desulfoglucosinolates (GSL). PRO = Progoitrin (2-OH-3-butenyl GSL); RAPH = glucoraphanin (4-methylsulfinlybutyl GSL); SIN = sinigrin (2-propenyl GSL), GNA = gluconapin (3-butenyl GSL); 4OH = 4-hydroxyglucobrassicin; IBV = glucoiberverin (3-Methylthiopropyl GSL); GBN = Glucobrassicanapin (4-Pentenyl GSL); ERU = glucoerucin (4-methylthiobutyl GSL); GBC = Glucobrassicin (Indol-3-ylmethyl GSL); NAS = Gluconasturtiin (2-phenylethyl GSL); NEO = neoglucobrassicin (1-MeOH-Glucobrassicin). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55425/55425fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55425/55425fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Längere Kette Methylsulfinyl Glucosinolate, die in der Modellpflanze Arabidopsis zu finden sind, zeigen auch eine Elutrope Reihe, wie in einem Wurzelextrakt von Rorippa austriaca gesehen. Glucohesperalin (C6), glucosiberin (C7), glucohirsutin (C8) und glucoarabin (C9) erscheinen in regelmäßigen Abständen auf dem Chromatogramm (Figur 4). Zusammen mit der UV-Spektren der Peaks, wie eluotropische logische Reihe kann zur Klassifizierung verwendet werden, und vorläufig zu identifizieren, unbekannt Glucosinolaten. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/55425/55425fig4.jpg" /> Abbildung 4: Chromatogramm (Rahmen 9-30 min) Der desulfoglucosinolates in einem austriaca Wurzelextrakt Rorippa. Die Peak-Etiketten zeigen die Retentionszeit und die Abkürzungen für identifizierte desulfoglucosinolates (GSL). HES = glucohesperin (6-methylsulfinylhexyl GSL); SBE = glucosiberin (7-methylsulfinylheptyl GSL); GBC = Glucobrassicin (Indol-3-ylmethyl GSL); HIR = glucohirsutin (8-methylsulfinlyoctyl GSL); ARA = glucoarabin (9-methylsulfinylnonylglucosinolate); NEO = neoglucobrassicin (1-MeOH-Glucobrassicin). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55425/55425fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55425/55425fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Gemeinsamen Namen </td><td> Side - Chain - Struktur </td><td> Rt (min) * </td><td> 229 nm </td><td> Referenz# </td></tr><tr><td> aliphatic Glucosinolate </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glucocapparin </td><td> Methyl </td><td> 3.5 </td><td> 1 </td><td> Braun </td></tr><tr><td> Sinigrin </td><td> 2-propenyl </td><td> 5.5 </td><td> 1 </td><td> Brown, EG </td></tr><tr><td> Gluconapin </td><td> 3-butenyl </td><td> 9.5 </td><td> 1.11 </td><td> EG </td></tr><tr><td> Glucobrassicanapin </td><td> 4-Pentenyl </td><td> 13.5 </td><td> 1.15 </td><td> EG </td></tr><tr><td> Glucoiberverin </td><td> 3-Methylthiopropyl </td><td> 10.9 </td><td> 0,8 </td><td> Braun </td></tr><tr><td> Glucoerucin </td><td> 4-methylthiobutyl </td><td> 14.0 </td><td> 0,9 </td><td> Braun </td></tr><tr><td> Glucoiberin </td><td> 3-Methylsulfinylpropylglucosinolaten </td><td> 3.7 </td><td> 1.2 </td><td> Braun </td></tr><tr><td> Glucoraphanin </td><td> 4-Methylsulfinylbutyl </td><td> 4.9 </td><td> 0,9 </td><td> Braun </td></tr><tr><td> Glucoalyssin </td><td> 5-methylsulfinylpentyl </td><td> 7.6 </td><td> 0,9 </td><td> Braun </td></tr><tr><td> Glucohesperin </td><td> 6-methylsulfinylhexyl </td><td> 10.5 </td><td> 1 </td><td> Braun </td></tr><tr><td> Glucosiberin </td><td> 7-methylsulfinylheptyl </td><td> 13.5 </td><td> 1 </td><td> Braun </td></tr><tr><td> Glucohirsutin </td><td> 8-methylsulfinyloctyl </td><td> 16.8 </td><td> 1.1 </td><td> Braun </td></tr><tr><td> Glucoarabin </td><td> 9-methylsulfinylnonyl </td><td> 20.5 </td><td> 1 </td><td></td></tr><tr><td> Glucocheirolin </td><td> 3-methylsulfonylpropyl </td><td> 4.2 </td><td> 0,9 </td><td> Braun </td></tr><tr><td> Progoitrin </td><td> 2 (R) -OH-3-butenyl </td><td> 4.5 </td><td> 1,09 </td><td> Buchner, EG </td></tr><tr><td> Gluconapoleiferin </td><td> 2-OH-5-pentenyl </td><td> 8.3 </td><td> 1 </td><td> EG </td&gt; </tr><tr><td> Indolglucosinolaten </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4-hydroxyglucobrassicin </td><td> 4-Hydroxyindol-3-ylmethyl </td><td> 11.2 </td><td> 0,28 </td><td> Buchner, EG </td></tr><tr><td> Glucobrassicin </td><td> indol-3-ylmethyl </td><td> 15.3 </td><td> 0,29 </td><td> Buchner, EG </td></tr><tr><td> 4-Methoxyglucobrassicin </td><td> 4-Methoxy-indol-3-ylmethyl </td><td> 18.2 </td><td> 0,25 </td><td> Buchner, EG </td></tr><tr><td> Neoglucobrassicin </td><td> 1-Methoxy-indol-3-ylmethyl </td><td> 22.5 </td><td> 0,2 </td><td> Buchner, EG </td></tr><tr><td> aromatischen Glucosinolate </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sinalbin </td><td> 4-hydroxybenzyl </td><td> 8.1 </td><td> 0,5 </td><td> Buchner </td></tr><tr><td> Glucosibarin </td><td> 2 (R) -OH-2-phenylethyl </td><td> 12.1 </td><td&gt; 0,95 </td><td> siehe nächste </td></tr><tr><td> Glucobarbarin </td><td> 2 (S) -OH-2-phenylethyl </td><td> 12.7 </td><td> 0,95 </td><td> Buchner </td></tr><tr><td> Glucotropaeolin </td><td> Benzyl </td><td> 13.8 </td><td> 0,95 </td><td> Buchner, EG </td></tr><tr><td> Gluconasturtiin </td><td> 2-phenylethyl </td><td> 18.0 </td><td> 0,95 </td><td> Buchner, EG </td></tr><tr><td> unbekannt - aliphatische / aromatische wie UV - Spektrum </td><td></td><td></td><td> 1 </td><td> EG </td></tr><tr><td> unbekannt - Indol wie Spektrum </td><td></td><td></td><td> 0,25 </td><td> EG </td></tr><tr><td colspan="5"> * Ungefähre Retentionszeit (Rt) gerundet auf die nächste 0,1 min (± 0,3 min in Abhängigkeit von der Säule, Eluent Qualität). Die Retentionszeiten sind auf Thermofischer / Dionex ultimative HPLC - Plattformen ausgestattet mit einer C 18 - Säule bestimmt (150 x 4,6 mm, 3 Mikrometer Teilchengröße) plus 18 C </sub&gt; Vorsäule (10 x 4,6 mm, 5 Mikrometer Partikelgröße) mit einem Gradienten - Programm , wie in Tabelle 1. </td></tr><tr><td colspan="5"> # Referenzen für Responsefaktoren: Buchner, R. in Glucosinolate in Raps (ed JP Wathelet) 50-58 (Martinus Nijhoff Publishers, 1987); Brown, PD, Tokuhisa, JG, Reichelt, M. &amp; Gerschenson, J. Variation von Glucosinolat Akkumulation zwischen den verschiedenen Organen und Entwicklungsstadien von Arabidopsis thaliana. Phytochemie. 62 (3), 471-481, doi: 10.1016 / S0031-9422 (02) 00549-6, (2003); EG. Ölsamen - Bestimmung von Glucosinolaten High Performance Liquid Chromatography. Amtsblatt der Europäischen Gemeinschaften. L 170/28. Anhang VIII 03.07.27-34 (1990). </td></tr></tbody></table> Tabelle 3: Die Responsefaktoren der am häufigsten Desulfo-Glucosinolate in Pflanzenextrakten und ihre ungefähren Retentionszeiten auf C 18 Spalten gefunden. Eluenten, gradient, Säulentemperatur und Durchflussmenge , wie in Tabelle 1.

Hier beschreiben wir sehr detailliert ein etabliertes und robustes Protokoll für die Extraktion von Glucosinolaten aus gemahlenem Pflanzenmaterial. Nach einer Sulfatase-Behandlung der Extrakte auf der Säule werden die Desulfoglucosonalate eluiert und mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie analysiert.

Eine einfache Methode zur Glucosinolate Extraktion und Analyse mit Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC)

Glucosinolates are a well-studied and highly diverse class of natural plant compounds. They play important roles in plant resistance, rapeseed oil ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, eine einfache und unkomplizierte Analyse von Glucosinolaten in Pflanzen und anderen biologischen Proben durchzuführen. Diese Methode zur Extraktion und Analyse von Glucosinolaten kann verwendet werden, um zentrale Fragen in der Pflanzen-Insekten-Ökologie, Pflanzenpathologie, Pflanzenzüchtung und Lebensmittelwissenschaften zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie gut validiert ist und auf eine breite Palette biologischer Proben anwendbar ist.Obwohl diese Methode hauptsächlich zur Quantifizierung von Glucosinolaten in Pflanzenmaterialien verwendet wird, kann sie auch auf Böden oder verarbeitete Lebensmittel angewendet werden. Dieses Extraktionsverfahren kann in nahezu jedem Labor durchgeführt werden, da überwiegend Standardlaborgeräte verwendet werden. Im Allgemeinen führen Personen, die neu in dieser Methode sind, die Analysen und Untersuchungen besser durch, wenn sie den Film mindestens einmal gelesen und beobachtet haben.Um das Verfahren zu beginnen, mischen Sie 10 Gramm G-25 vernetztes Dextrin-Gel mit 125 Milliliter ultrareinem Wasser. Lagern Sie die Mischung in einer verschlossenen Flasche bei 4 Grad Celsius. Lösen Sie anschließend 10.000 Einheiten der Typ H-1-Arylsulfatase in 30 Milliliter ultrareinem Wasser auf.Geben Sie 30 Milliliter absolutes Ethanol hinzu und rühren Sie die Mischung gut um. Zentrifugieren Sie die Mischung 20 Minuten bei Raumtemperatur mit 2.650 × g. Kombinieren Sie das Überstand mit 90 Milliliter absolutem Ethanol in einem Becher.Mischen und in neue Zentrifugenröhrchen umfüllen. Die Mischung bei Raumtemperatur 15 Minuten lang mit 1.030 × g zentrifugieren. Den Überstand verwerfen.Lösen Sie die Pellets in insgesamt 25 Milliliter ultrareinem Wasser auf und vereinigen Sie sie. Wirbeln Sie die Mischung gründlich und überführen Sie sie anschließend in 1-Milliliter-Röhrchen. Lagern Sie die Sulfatproben bis zu einem Jahr bei 20 Grad Celsius.Als Nächstes etwa 90 Milligramm Sinogram wiegen und das Gewicht mit einer Genauigkeit von 1 Mikrogramm erfassen. Anschließend das Sinogram-Monohydrat in 10 Milliliter ultrareinem Wasser lösen. Aus dieser Sinogram-Stammlösung fünf Referenzlösungen mit Konzentrationen im Bereich von 50 bis 750 µM herstellen.Die Referenzlösungen in 1,5-Milliliter-Röhrchen bei 20 Grad Celsius lagern. Danach für jede Probe und jede Referenz ein 2-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen an einer Position im Säulengestell beschriften. Jeden Mikrozentrifugenröhrchenverschluss mit einer Präpariernadel zum späteren Gefriertrocknen anstechen.Stellen Sie die beschrifteten Röhrchen in einem Block in der gleichen Anordnung und mit dem gleichen Abstand wie die beschrifteten Säulen auf. Um die Glaspipettensäulen vorzubereiten, drücken Sie mit einem Holz- oder Glasstab vorsichtig ein 1 cm × 1 cm großes Stück Glaswolle in die Pipette. Befestigen Sie die Glaswolle am Übergang zwischen Pipettenkörper und Pipettenschaft.Platzieren Sie eine Pipettensäule in jeder beschrifteten Position auf dem Rack. Stellen Sie das Rack über ein Abfallbehältnis. Schneiden Sie das Ende einer plastischen 1-Milliliter-Pipettenspitze ab.Schütteln Sie das hergestellte Dextrin-Gel gründlich. Anschließend geben Sie mit einer aufgeweiteten Pipettenspitze 0,5 Milliliter des hergestellten Dextrin-Gels in jede Säule. Überprüfen Sie die Säulen auf auslaufendes Dextrin-Gel und ersetzen Sie gegebenenfalls undichte Säulen.Nachdem alle Säulen mit Dextrin-Gel beladen wurden, spülen Sie jede Säule mit 1 Milliliter ultrareinem Wasser aus. Wiegen Sie zwischen 50 und 100 Milligramm fein gemahlenes, freies Pflanzenmaterial in einem 2-Milliliter-Reaktionsröhrchen mit Sicherheitsverschluss ab und notieren Sie das Gewicht mit einer Genauigkeit von 0,1 Milligramm. Geben Sie zwei Metallkugeln mit einem Durchmesser von jeweils 3 Millimetern in jedes Röhrchen.Fügen Sie jedem Reagenzglas 1 Milliliter 70 % Methanol in ultrareinem Wasser hinzu und wirbeln Sie jedes Gemisch kurz vortexartig durch. Verschließen Sie die Röhrchen mit zusätzlichen Sicherheitskappen und stellen Sie sie unverzüglich in ein Wasserbad mit einer Temperatur zwischen 90 und 92 Grad Celsius. Erhitzen Sie die Röhrchen, bis die Probe zu sieden beginnt.Überführen Sie die Röhrchen in ein Ultraschallbad und behandeln Sie die Proben 15 Minuten lang mit Ultraschall unter Erwärmung. Während der Beschallung beginnen Sie, die Sulfatat-Probe sowie die Sinogramm-Referenzen aufzutauen. Nach der Beschallung zentrifugieren Sie die Proben 10 Minuten bei Raumtemperatur mit 2.700 × g.Geben Sie die Überstände und aufgetauten Sinogramm-Referenzen auf die entsprechenden Säulen, wobei darauf geachtet werden sollte, dass keine Pflanzenbestandteile in die Pipette gelangen. Fügen Sie 1 Milliliter 70 % Methanol zu jedem Reaktionsgefäß hinzu. Vortexen Sie die Gemische.Und erwärmen Sie die Gemische 15 Minuten lang ultraschallunterstützt. Zentrifugieren Sie die Röhrchen erneut unter denselben Bedingungen wie zuvor. Geben Sie die Überstände auf die entsprechenden Säulen.Geben Sie zwei Portionen je 1 Milliliter 70 % Methanol auf jede Säule und lassen Sie die Säulen zwischen den Portionen austrocknen. Spülen Sie restliches Methanol von jeder Säule mit 1 Milliliter ultrareinem Wasser ab. Anschließend waschen Sie jede Säule mit zwei Portionen je 1 Milliliter 20 Millimolar Natriumacetat-Puffer, pH 5,5. Nachdem die letzten Anteile des Pufferlösungs-Pufffers in das Abfallgestell abgelaufen sind, entfernen Sie das Gestell aus der Abfallschale und trocknen Sie die Füße des Gestells mit einem Tuch ab. Stellen Sie das Gestell über den Block mit beschrifteten Mikrozentrifugenröhrchen, sodass die Säulentips in den entsprechenden Röhrchen stehen. Geben Sie 20 Mikroliter Sulfatatlösung auf jede Säule, wobei sichergestellt werden muss, dass die Lösung die Oberfläche des Säulenmaterials erreicht.Spülen Sie die Sulfatase-Lösung mit 50 Mikrolitern Natriumacetat-Puffer in das Säulenmaterial. Es ist sehr wichtig, dass die Sulfatase in die Säule hineingewaschen wird. Das Enzym muss sich auf der Säule befinden, um mit den intakten, an der Säule gebundenen Glucosinolaten reagieren zu können.Nachdem die Sulfatat-Lösung in jede Säule gespült wurde, bedecken Sie die Säulen mit Aluminiumfolie. Lassen Sie die Säulen über Nacht stehen. Spülen Sie anschließend die Desulfo-Glucosinolate aus jeder Säule mit zwei Portionen von jeweils 0,75 Milliliter ultrareinem Wasser ab.Nachdem die Säulen ausgelaufen sind, entfernen Sie den Säulenständer und verschließen Sie jedes Röhrchen. Gefrieren Sie die Röhrchen in flüssigem Stickstoff oder bei minus 80 Grad Celsius für mindestens 30 Minuten. Trocknen Sie die Proben 12 bis 24 Stunden im Gefriertrockner.Lösen Sie jeden Rückstand in 1 Milliliter ultrareinem Wasser auf. Überführen Sie anschließend jede Probe und Referenz in beschriftete HPLC-Probenfläschchen. Trennen Sie die Extrakte an einer umgekehrten Phase CAT-Säule.Verwenden Sie eine Detektionswellenlänge von 229 Nanometern. Nach der Trennung mittels HPLC können die Glucosinolate durch Vergleich der Retentionszeiten und UV-Spektren mit bekannten Glucosinolat-Standards identifiziert werden. Die Glucosinolat-Konzentrationen in der Probe werden anhand einer Sinogramm-Kalibrierungskurve und Literaturwerte für die Empfindlichkeitsfaktoren berechnet.Daraus können die Glucosinolat-Konzentrationen in der ursprünglichen Pflanzenprobe bestimmt werden. Unter den verwendeten HPLC-Bedingungen eluiert das gesundheitsschädliche Progoitrin relativ früh und trennt sich vom biologisch vorteilhaften Glucoraphanin. Auch die Endo-Glucosinolate werden gut getrennt.Lyotrope Reihen werden bei zunehmender Seitenkettenlänge für Alconol, Methylfol-Alconol und längerkettige Methyl-Solfinol-Glucosinolate beobachtet. Unbekannte Glucosinolate können daher vorläufig anhand dieser lyotropen Reihen in Kombination mit UV-Spektren klassifiziert werden. Bei sachgemäßer Vorbereitung können eine Person pro Arbeitstag 150 bis 200 Proben extrahieren.Es dauert noch einen weiteren Tag, um auf die Säulen zu verweisen, die Proben gefriertrocknen und für die HPLC vorbereiten. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie LC-MS angewendet werden, um unbekannte Desulfo-Glucosinolate in Ihrem Chromatogramm zu identifizieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Glucosinolate aus Ihren biologischen Proben extrahiert und mittels HPLC analysiert werden können.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Methanol äußerst gefährlich sein kann und stets unter dem Abzug durchgeführt werden sollte.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Chemistry

Chemie

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