Eine bequeme Methode für die Extraktion und Analyse mit Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie Katecholamin Neurotransmitter und deren Metabolite

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, drei Monoamin-Neurotransmitter und zwei ihrer Metaboliten im Urin von Säuglingen gleichzeitig über eine komfortable Festphasenextraktion zu bestimmen, die mit einer Hochdruckflüssigkeitschromatographie mit elektrochemischer Detektion gekoppelt ist. Mit dieser Methode können instabile Zielverbindungen in einer vollständigen Probe mit einfacher Bedienung in kurzer Zeit vorhergesagt und bestimmt werden. Ihre Proben können einfach mit einem schmalen fasergepackten Solid-Face-Quorum vorgereinigt werden, und die Analyten in der Probe können leicht angereichert, aufgelöst und auf einem elektrochemischen Detektionssystem detektiert werden.

Die Idee zu dieser Methode kam uns, als wir erkannten, dass die Extraktion und Analyse von Katecholamin-Neurotransmittern in biologischen Flüssigkeiten entscheidend für die Beurteilung der Resistenzfunktion und der damit verbundenen Krankheiten ist. Personen, die neu in dieser Methode sind, werden Schwierigkeiten haben, da Lichteinwirkung vermieden werden muss und die Vorbehandlungszeit so kurz wie möglich sein sollte. Um das Verfahren zu demonstrieren, haben wir Lanlan Wei und Qing Han, zwei Doktoranden aus unserem Labor.

Bereiten Sie zunächst zwei Milligramm pro Milliliter Stammlösung DPBA-Lösung vor, indem Sie zwei Milligramm der Verbindung in einem Milliliter destilliertem Wasser auflösen. Lagern Sie die Lösung im Dunkeln bei vier Grad Celsius. Bei der Herstellung der Analyt-Extender ist zu berücksichtigen, dass die chemische Struktur und die Eigenschaften der Katecholamine instabil sind, und da sie sich leicht zersetzen, muss der Herstellungsprozess der Extender sehr schnell sein und die Exposition gegenüber dünnem Sonnenlicht muss vermieden werden.

Wiegen Sie 1,0 Milligramm Noradrenalin, Adrenalin, Dopamin, MHPG, DOPAC und internes Standard-DHBA in separaten 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie 1,0 Milliliter destilliertes Wasser hinzu, um jede der Verbindungen aufzulösen, mit Ausnahme von Adrenalin, das in 0,01 Mol pro Liter Salzsäurelösung gelöst werden sollte. Oszillieren Sie die vorbereiteten Standards im Dunkeln mit hoher Geschwindigkeit, bis sich die Analyten vollständig auflösen.

Dies sind die Primärvorräte, die bis zu mehreren Wochen bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden können. Zur Herstellung der sekundären Analytstämme von Noradrenalin, Adrenalin, Dopamin, DOPAC und MHPG werden fünf Mikroliter jedes primären Analytstocks in 4.975 Mikroliter destilliertes Wasser in separaten Fünf-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt. Bereiten Sie diese Lösungen täglich frisch zu und lagern Sie die Lösungen bis zur Verwendung im Dunkeln bei vier Grad Celsius.

Für DHBA werden fünf Mikroliter Primärmaterial in ein Fünf-Milliliter-Zentrifugenröhrchen in 4.995 Mikroliter destilliertes Wasser umgefüllt und separat im Dunkeln bei vier Grad Celsius gelagert. Nehmen Sie weitere Verdünnungen mit dem Sekundäranalytstock vor, um eine Standardkurve zu erstellen. Lagern Sie die Lösungen im Dunkeln bei vier Grad Celsius und bereiten Sie sie täglich frisch zu.

Testen Sie anschließend die optimale Spannung des ECD-Detektors mit dem Standardmaterial mit der richtigen Konzentration. Variieren Sie die Spannung, um einen Wert zu finden, bei dem die Analyten das beste Peak-Erscheinungsbild aufweisen. Um 10 Milliliter Eluentenlösungsmittel herzustellen, verwenden Sie 5,5 Milliliter destilliertes Wasser und geben Sie dann Tropfen für Tropfen 1,5 Milliliter Acetonitril und drei Milliliter Phosphorsäure in das Wasser.

Zur Vorbereitung der mobilen Phase messen Sie die im Textprotokoll aufgeführten Komponenten in eine saubere Ein-Liter-Flasche ab. Fügen Sie 40 Milliliter Acetonitril und destilliertes Wasser zu 1.000 Millilitern hinzu. Rühren und vibrieren Sie 15 Minuten lang mit Ultraschall, bis sich die Materie in der Lösung vollständig aufgelöst hat.

Stellen Sie mit einem pH-Messgerät mit einer Glaselektrode den pH-Wert der mobilen Phase mit einer gesättigten Natriumhydroxidlösung auf 4,21 ein. Filtern Sie die mobile Phase mit einer mikroporösen Membran aus 0,45-Mikron-Polyvinylidenfluorid und einer Vakuumsaugvorrichtung, um Verunreinigungen zu entfernen. Verwenden Sie Ultraschallvibrationen für jeweils 15 Minuten, um die mobile Phase vor der Verwendung zu entgasen.

Anschließend werden die Harnproben 10 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 1.510 mal G vortexen und zentrifugiert, um die meisten Partikelinterferenzen zu entfernen. Sammeln Sie die Überstände und entsorgen Sie das Sediment für weitere Experimente. Um Analyten effektiv zu extrahieren, fahren Sie unmittelbar nach dem Zentrifugieren mit der Festfaser-Festphasenextraktion (PFSPE-Vorbehandlung) fort.

Um die Nanofasern zu aktivieren, pressen Sie nacheinander 100 Mikroliter Methanol und 100 Mikroliter Wasser mit einer Fünf-Milliliter-Spritze langsam tropfenweise durch die PFSPE-Säule. Die Urinprobe muss mit DPPA-Lösung gemischt werden, um ihre Hydrophobie zu verbessern und die Katecholamine und Metaboliten bei der Aufnahme in die Fasern zu unterstützen. Die DHBA-Lösung muss ebenfalls als interner Standard hinzugefügt werden.

Mischen Sie 100 Mikroliter Urinprobe mit 100 Mikrolitern zwei Milligramm pro Milliliter DPBA-Lösung und 30 Mikrolitern 100 Nanogramm pro Milliliter DHBA-Lösung nach internem Standard in einem 0,5-Milliliter-Eppendorf-Röhrchen. Drücken Sie dann die gemischte Probenlösung mit einer Fünf-Milliliter-Gasspritze aus Kunststoff unter Verwendung der Kraft des Luftdrucks durch die PFSPE-Säule. Laugen Sie die Säule dreimal, indem Sie mit einer Fünf-Milliliter-Gasspritze 100 Mikroliter der DPBA-Lösung in die SPE-Säule laden und die Lösung langsam mit Luftdruck durch die Kartusche drücken.

Dieser Spülschritt ist notwendig, da die DPBA-Lösung die Verunreinigungen entfernen kann, während die Analyten zurückgehalten werden, wodurch die Empfindlichkeit und Selektivität der Analyten verbessert wird. Laden Sie als Nächstes 50 Mikroliter des Eluenten auf die PFSPE-Säule und drücken Sie es durch die Säule, wobei Sie das Eluat mit einem 0,5-Milliliter-Eppendorf-Röhrchen auffangen. Schalten Sie den HPLC-Entgaser ein, um die Luft im System zu entgasen.

Vor der Probenanalyse sollte das System mit der mobilen Phase mehr als 0,5 Stunden laufen, um das Ausgangsrauschen auszugleichen und zu reduzieren. Probenahme von 20 Mikrolitern des Eluats mit einem automatischen Probenehmer und anschließende Injektion in das HPLC-ECD-System. Wenn die Läufe abgeschlossen sind, schalten Sie die Detektorzelle über die Detektorschnittstelle aus.

Schalten Sie die Zelle nicht mit dem Schalter auf der Rückseite des Detektors aus, da dies das Gerät beschädigen könnte. Ändern Sie die Zusammensetzung der mobilen Phase manuell auf 10 % Methanol und 90 % Wasser. Nachdem Sie die mobile Phase mindestens 30 Minuten lang laufen ließen, stellen Sie sie manuell auf Methanol in HPLC-Qualität um.

Lassen Sie das System etwa 15 Minuten lang laufen, um es vor Methanol zu schützen. Wenn dieser Schritt nicht innerhalb der empfohlenen Laufzeit ausgeführt wird, kann dies zu Schäden an der Säule und dem Detektor führen. Schalten Sie den Durchfluss aus und dann den Entgaser aus.

Fahren Sie mit der Katecholaminanalyse fort, wie im Textprotokoll beschrieben. Das Chromatogramm einer Spike-Wasserprobe mit den Targets und dem internen Standard wird ohne Extraktion dargestellt. Unter der HPLC-Bedingung im Protokoll sind die fünf Zielpeaks der PFSPE-Methode gut voneinander entfernt und deutlich höher als bei denen, die mit einer kommerziellen Phenylboronsäure-Kartusche extrahiert werden.

Außerdem erschien der DOPAC-Peak nicht im Extraktionsergebnis der PBA-Kartusche, was darauf hindeutet, dass die PBA-Säule nicht in der Lage war, DOPAC zu extrahieren. Bei der Entnahme der Urinprobe konnte die PFSPE-Methode nicht nur die Ziele mit guter Peak-Identifizierung extrahieren, sondern auch den größten Teil der Interferenzen im Urin beseitigen. Für jede Verbindung wurden Kalibrierungskurven erstellt, indem das Verhältnis der Peakfläche aufgetragen wurde, was eine gute Linearität bei geringer Konzentration zeigte.

Zur Validierung mit echten Urinproben wurden die Urinproben von 28 Hochrisiko-Säuglingen und 22 gesunden Säuglingen untersucht. Während sich einige Katecholamine zwischen der Hochrisiko- und der gesunden Gruppe nicht signifikant unterschieden, wiesen die Hochrisiko-Säuglinge höhere Mengen des MHPG-Metaboliten auf als die Kontrollgruppe. Daher kann der MHPG-Spiegel im Urin ein potenzieller Marker für die Früherkennung von Säuglingen mit hohem Risiko sein.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in wenigen Minuten durchgeführt werden. Beim Versuch des Eingriffs ist es wichtig, daran zu denken, die Asche frisch zuzubereiten, schnell zu arbeiten und direkte Sonneneinstrahlung zu vermeiden. Kritisch ist auch die Zugabe von Diphenylborat-Säure-Lösung in den Absorptions- und Spülschritten.

Nach diesem Verfahren misst as die fehlende Terminierung von Katecholaminen und Metaboliten im Plasma oder in der Zerebrospinalflüssigkeit. Alsliver kann durchgeführt werden, um die Universalität dieses Protokolls bei der Prüfung der anderen biologischen Flüssigkeiten zu bestimmen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher, den Zusammenhang zwischen neurologischen Entwicklungsdefiziten und dem Gehalt an Katecholaminen im Urin in Kinderproben zu untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Festphasenextraktionsmethode mit Nair-Zahlen und einem einfachen Gerät durchführen können, dem PCE PS Luftfibules Corporate-Waste DPBA, kann helfen, die Katecholamin-Neurotransmitter in den Urinproben zu reinigen. Diese Technik erstreckt sich auf die frühzeitige Diagnose von Cassis mit Risiko für Hirnschäden bei Säuglingen. Denn die vergleichende Analyse ergab auffällige Unterschiede im unären MHPG von autistischen Kindern, was darauf hindeutet, dass die Katecholamin-Metaboliten ein wichtiger Marker sein könnten.