Festphasen-Mikroextraktionsprobenahme: Eine sondenbasierte Technik zur Probenextraktion aus Transplantatgewebe

Die langfristige Lagerung eines Organtransplantats beeinflusst sein Stoffwechselprofil, das ein Indikator für die Organfunktion und die Organabstoßung im Frühstadium ist.

Um diese Metaboliten zu isolieren, beginnen Sie mit einer dünnen Festphasen-Mikroextraktions- oder SPME-Sonde, die mit einem biokompatiblen Sorptionsmittel beschichtet ist. Tauchen Sie die Sonde in eine hydroalkoholische Reinigungslösung, um das beschichtete Sorptionsmittel zu hydratisieren und gebundene Verunreinigungen zu lösen.

Bewegen Sie die Sonde, um die Verunreinigungen zu entfernen. Legen Sie anschließend die Sonde in eine Aktivierungslösung und rühren Sie erneut. Chemikalien in der Aktivierungslösung modifizieren die Sondenoberfläche und erhöhen ihr Adsorptionspotenzial. Spülen Sie die Sonde mit Wasser ab und sterilisieren Sie sie, um mikrobielle Verunreinigungen zu entfernen.

Führen Sie nun die sterile und aktivierte Sonde so in das Organtransplantat ein, dass die Gewebematrix die gesamte Sorptionsmitteloberfläche bedeckt. Das Sorptionsmaterial zieht freie und unpolare Metaboliten aus dem Transplantat an und ermöglicht so die Adsorption an dessen Oberfläche. Ziehen Sie die Sonde zurück und spülen Sie sie mit Wasser ab, um Restgewebe zu entfernen.

Legen Sie dann die Sonde in eine Desorptionslösung, die mit den adsorbierten Metaboliten interagiert. Bewegen Sie die Sonde, um die eingefangenen Metaboliten zu trennen und in die Desorptionslösung zu lösen. Entfernen Sie abschließend die Sonde und verarbeiten Sie das resultierende Metabolitengemisch für die anschließende Analyse.

Beginnen Sie mit der Vorbereitung einer Vorkonditionierungsmischung aus 1 bis 1 Methanol und Wasser. Pipettieren Sie 1 Milliliter der Lösung in jedes 2-Milliliter-Glasfläschchen und legen Sie eine Sonde in jedes Fläschchen. Rühren Sie die Fläschchen auf einem Wirbelrührwerk bei 1.200 U/min für 1 Stunde. Spülen Sie dann die Sonden mit Wasser in LC-MS-Qualität und sterilisieren Sie sie gemäß dem standardmäßigen chirurgischen Sterilisationsprotokoll oder in der sterilen Verarbeitungsabteilung.

Wenn Sie bereit sind, die Probe zu entnehmen, öffnen Sie die sterile Verpackung und führen Sie zwei Sonden pro Zeitpunkt 10 Minuten lang direkt in die Nierenrinde ein, wobei Sie sicherstellen, dass die gesamte Länge der Beschichtung von der Gewebematrix bedeckt ist. Stellen Sie sicher, dass Sie den Zeitpunkt der Probenahme für jede Sonde im Auge behalten. Ziehen Sie die Sonde zurück, indem Sie sie aus dem Gewebe herausziehen, und spülen Sie die Beschichtung sofort mit LC-MS-Wasser ab, um restliches Blut zu entfernen, und stellen Sie sicher, dass sie von der Operationsstelle weggespült wird.

Um die Sonden zu transportieren, legen Sie sie in separate Fläschchen und verschließen Sie sie. Stellen Sie dann die Fläschchen in eine mit Trockeneis oder flüssigem Stickstoff gefüllte Box. Lagern Sie die Proben bei minus 80 Grad Celsius oder fahren Sie sofort mit der Desorption fort.

Bereiten Sie eine Desorptionslösung aus Acetonitril und Wasser für die metabolomische Analyse und eine weitere aus Isopropanol und Methanol für die lipidomische Analyse vor. Geben Sie 100 Mikroliter der Lösung in die Einsätze in den mit 2 Millilitern beschrifteten Durchstechflaschen und legen Sie eine Sonde in jedes Fläschchen. Rühren Sie die Fläschchen 2 Stunden lang bei 1.200 U/min. Entfernen Sie dann die Sonden aus den Fläschchen und fahren Sie mit der LC-MS-Analyse fort.