Name: Eine einfache Methode zur Identifizierung von Kinasen, die die embryonale Stammzell-Pluripotenz durch Hochdurchsatz-Inhibitor-Screening regulieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Lernen Sie eine Hochdurchsatz-Methode zur Identifizierung von Kinasen, die die embryonale Stammzell-Pluripotenz regulieren. Dieses Screening nutzt Standard-Laborausrüstung und Immunoblotting zur Validierung.

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CACW wird von einem Doktorand des Medical Research Council unterstützt. GMF wird teilweise von einem Medical Research Council New Investigator Award (MR / N000609 / 1) und einem Tenovus Scotland Forschungsstipendium unterstützt.

1. Sortierung von kleinen Molekül-Kinase-Inhibitor-Bibliotheken <ol><li> Sortierung von Inhibitorbibliotheken aus öffentlich zugänglichen Kinase-Inhibitor-Sammlungen, zB Library of Integrated Network-based Cellular Signatures (LINCS) von der Harvard Medical School, eine gezielte Sammlung von 228 potenten und selektiven Kinase-Inhibitoren (http://lincs.hms.harvard.edu) , Und das Protein-Kinase-Inhibitor-Set (PKIS), eine 376 zusammengesetzte Sammlung, die von Industrieforschern zusammengestellt wurde (https://www.ebi.ac.uk/chembldb/extra/PKIS) 13 . Alternativ können Sie eine maßgeschneiderte Kinase-Inhibitor-Kollektion aus handelsüblichen Verbindungen zusammensetzen. HINWEIS: In unserem Labor haben wir eine Sammlung von 72 potenten und selektiven Werkzeugkinase-Inhibitoren zusammengestellt, die 51 primäre Zielkinasen abdecken, die alle aus kommerziellen Quellen verfügbar sind. </li><li> Zusammensetzen von Kinase-Inhibitoren in 96-Well-Platten für eine optimale Hochdurchsatzverarbeitung bei mehreren Konzentrationen (Einsatz 1, 0,1 aNd 0,01 mM). In jede Plattenkontakt-Vertiefungen, die nur DMSO enthalten, und Referenzkontrollinhibitoren PD173074 (FGFRi) und Ruxolitinib (JAKi), die bekanntermaßen naive und grundierte pluripotenten Zustände fördern, enthalten sind. Annotieren Sie in einer Tabellenkalkulation oder einer ähnlichen Software. </li></ol> 2. mESC-Kulturbedingungen und -verfahren für die Screen-Vorbereitung <ol><li> 0,1 g-Gelatine-beschichtete 10-cm-Schalen zugeben, indem man 5 ml 0,1% (w / v) Gelatine zu 10 cm-Platten hinzufügt und bei Raumtemperatur für 5 min inkubiert. Gelatine anziehen und 2 Minuten trocknen lassen. </li><li> Kultur jeder Standard-MESC-Linie bei 37 ° C 5% CO 2 auf 0,1% mit Gelatine beschichteten 10 cm-Schalen in Standard-MESC-Medien (siehe Materialtabelle ) mit 100 ng / mL GST-LIF, 10% Fetal-Kalbs Serum und 5% Knockout Serum Ersatz. Ersetzen Sie Medien jeden Tag und Durchgang mESCs bei etwa 80% Konfluenz jeden zweiten Tag bei einer Verdünnung von 1: 5-1: 10. </li><li> Zum Durchgang von MESCs, Absaugen von Medien und Waschen mit 5 ml OF Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) pro Platte. </li><li> Füge 1 ml Trypsin-EDTA (0,05% Trypsin, 0,02% EDTA) pro Platte von mESCs hinzu und inkubiere bei 37 ° C für 10 min. </li><li> Restenzen Sie die trypsinisierten Zellen in 4 ml mESC-Medien und zentrifugieren Sie bei 1200 U / min für 5 min. </li><li> Das Pellet in 5 ml MESC-Medien sorgfältig resuspendieren, nach oben und unten pipettieren, um eine einzelne Zellsuspension zu erzeugen. </li><li> Zählzellen durch Kombinieren einer 10 &amp; mgr; l Zellsuspension und 10 &amp; mgr; l Trypan Blue (0,4%). In eine Zellzählkammer stellen oder ein Hämocytometer und Lichtmikroskop verwenden. </li><li> Samen 3 x 10 3 mESCs in 0,1% gelatinebeschichtete 96-Well-Platten, Endvolumen 100 μl Medium, unter Verwendung einer Mehrkanalpipette. </li><li> Die Kinase-Inhibitoren bei 1: 100 Verdünnung (1 &amp; mgr; l Inhibitor zu 100 &amp; mgr; l Medium) unter Verwendung einer Mehrkanalpipette auftragen. Sanftes Pipettieren von Medikamenten, um Inhibitor und Zellsuspension zu mischen, dann lassen sich die Zellen in einer Gewebekulturhaube für 1 h absetzen, um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleistenSs die Überzugsfläche. Kulturzellen für 48 Stunden ohne Medienwechsel. HINWEIS: Stammplatten von 1 / 0,1 / 0,01 mM ergeben eine endgültige Inhibitorkonzentration von 10/1 / 0,1 μM. Empfiehlt es sich, den Bildschirm bei einer Endkonzentration von 1 μM zu starten, um eine wirksame Hemmung der primären Zielkinasen zu gewährleisten und gleichzeitig die Off-Target-Effekte zu minimieren. </li></ol> 3. Kinase Inhibitor Screening Analyse <ol><li> Waschen Sie 96 gut mESC Platten in 200 μL PBS mit Mehrkanal-Aspirator und Pipetten. </li><li> Zellextrakte in 150 μl Lysepuffer (20 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40 (v / v), 0,5% Natriumdeoxycholat (w / v), 10 mM β-Glycerophosphat , 10 mM Natriumpyrophosphat, 1 mM NaF, 2 mM Na 3 VO 4 , komplette Protease-Inhibitor-Cocktail-Tabletten). </li><li> Klären Sie die Extrakte durch Zentrifugation bei 1.500 xg für 30 min in V-Boden-96-Well-Platten. </li><li> 100 μl Überstände auf ein Nitrocel immobilisierenLymphmembran unter Verwendung eines 96-Well-Vakuum-Punkt-Blot-Verteilers. </li><li> Trocknen Sie die Membran und Fleck mit 40 ml Ponceau S, um eine gleichmäßige Übertragung zu gewährleisten. </li><li> Waschmembran mit TBST und Block in TBST / 3% (w / v) Milch. </li><li> Inkubieren in Nanog- und Dnmt3b-Antikörpern bei einer Verdünnung von 1: 1000 (v / v) in TBST / 3% (w / v) Milchpulver über Nacht. </li><li> Waschmembranen in 3 x 10 min in TBST waschen und in 30 ml Sekundärantikörper bei einer Verdünnung von 1: 10.000 (v / v) in TBST / 3% (w / v) Milch inkubieren. </li><li> Entwickeln Sie mit einem digitalen Immunoblotting-Imaging-System. HINWEIS: Wenn möglich, verwenden Sie quantitative Fluoreszenz-Immunoblotting, um Nanog und Dnmt3b zu erkennen. Allerdings ist das Hintergrundsignal für Dnmt3b durch Fluoreszenz-Immunoblotting zu hoch. Daher werden 800 nm Fluoreszenz-Anti-Kaninchen (Nanog) und Anti-Maus-HRP (Dnmt3b) sekundäre Antikörper verwendet. </li></ol> 4. Analyse der Screen-Daten und Validierung von Inhibitoren als Bona Fide Pluripotency Regulatoren <p class="jove_content"&gt; HINWEIS: Dies ist ein kritischer Schritt, um sicherzustellen, dass nur bona fide Pluripotenzmodulatoren identifiziert werden. Es ist entscheidend für Triage-Inhibitoren, die sowohl auf Nanog: Dnmt3b-Verhältnis als auch auf Gesamtsignal basieren, um sicherzustellen, dass Kinase-Inhibitoren, die das MESC-Überleben negativ beeinflussen, nicht für eine weitere Analyse ausgewählt werden. <ol><li> Quantifizieren Sie Nanog- und Dnmt3b-Signal mit Hilfe von Immunoblotting-Analyse-Software und importieren Sie Werte in eine Tabellenkalkulation oder ähnliche Software. Berechnen Sie das Nanog: Dnmt3b-Verhältnis für alle Proben im Vergleich zur DMSO-Kontrolle. Außerdem bestimmen Sie das gesamte Nanog- und das Dnmt3b-Signal, um sicherzustellen, dass Kinase-Inhibitoren das Nanog: Dnmt3b-Verhältnis nicht beeinflussen, indem sie die Lebensdauer von mESC verändern. </li><li> Verwenden Sie Ranglisten-Nanog: Dnmt3b-Verhältnisse, um Inhibitoren zu identifizieren, die naive Pluripotenz fördern (Nanog: Dnmt3b-Verhältnis höher als Kontrolle) und grundierte Pluripotenz (Nanog: Dnmt3b-Verhältnis niedriger als Kontrolle). Setzen Sie den Cut-off bei 2x Abweichung von den Steuerwerten und filtern Sie Kinase-Inhibitoren aus, die ein Gesamt-Nanog + Dnmt3b-Signal erzeugen50% des DMSO-Kontrollwertes, um eine hohe Vertrauensliste von Kinase-Inhibitoren zu erzeugen, die das naive (hohe Nanog: Dnmt3b-Verhältnis) und das geplante (niedrige Nanog: Dnmt3b-Verhältnis) pluripotenten Zustände stabilisieren. </li><li> Validieren von Kinase-Inhibitoren durch Samen von mESCs bei 2 x 10 5 Zellen pro 6-Well in 2-ml-Medien und Zugabe von Kinase-Inhibitoren bei 1 μM für 48 h, ohne Medienwechsel. </li><li> Lyse mESCs in Lysepuffer und analysieren Nanog- und Dnmt3b-Expression durch konventionelles SDS-PAGE-Immunoblotting. </li><li> Weiterhin validieren Sie Treffer durch SDS-PAGE-Immunoblotting für naive Pluripotenzmarker Klf2 und Klf4 und Oct4, um sicherzustellen, dass die Pluripotenz nach 48 h Inhibitorbehandlung aufrechterhalten wird. </li></ol>

<ol><li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).</li>
<li>Nichols, J., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naive+and+primed+pluripotent+states%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Naive and primed pluripotent states.</a> Cell Stem Cell. 4 (6), 487-492 (2009).</li>
<li>Boroviak, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage-Specific+Profiling+Delineates+the+Emergence+and+Progression+of+Naive+Pluripotency+in+Mammalian+Embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Lineage-Specific Profiling Delineates the Emergence and Progression of Naive Pluripotency in Mammalian Embryogenesis.</a> Developmental Cell. 35 (3), 366-382 (2015).</li>
<li>Tesar, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+cell+lines+from+mouse+epiblast+share+defining+features+with+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">New cell lines from mouse epiblast share defining features with human embryonic stem cells.</a> Nature. 448 (7150), 196-199 (2007).</li>
<li>Brons, I. G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+pluripotent+epiblast+stem+cells+from+mammalian+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Derivation of pluripotent epiblast stem cells from mammalian embryos.</a> Nature. 448 (7150), 191-195 (2007).</li>
<li>Festuccia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Esrrb+is+a+direct+Nanog+target+gene+that+can+substitute+for+Nanog+function+in+pluripotent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Esrrb is a direct Nanog target gene that can substitute for Nanog function in pluripotent cells.</a> Cell Stem Cell. 11 (4), 477-490 (2012).</li>
<li>Ficz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+signaling+inhibition+in+ESCs+drives+rapid+genome-wide+demethylation+to+the+epigenetic+ground+state+of+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">FGF signaling inhibition in ESCs drives rapid genome-wide demethylation to the epigenetic ground state of pluripotency.</a> Cell Stem Cell. 13 (3), 351-359 (2013).</li>
<li>Guo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Klf4+reverts+developmentally+programmed+restriction+of+ground+state+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Klf4 reverts developmentally programmed restriction of ground state pluripotency.</a> Development. 136 (7), 1063-1069 (2009).</li>
<li>Chambers, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanog+safeguards+pluripotency+and+mediates+germline+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development.</a> Nature. 450 (7173), 1230-1234 (2007).</li>
<li>Findlay, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+domains+of+Sos1%2FGrb2+are+finely+tuned+for+cooperative+control+of+embryonic+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Interaction domains of Sos1/Grb2 are finely tuned for cooperative control of embryonic stem cell fate.</a> Cell. 152 (5), 1008-1020 (2013).</li>
<li>Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+is+mediated+via+activation+of+STAT3%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3.</a> Genes Dev. 12 (13), 2048-2060 (1998).</li>
<li>Kunath, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+stimulation+of+the+Erk1%2F2+signalling+cascade+triggers+transition+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+from+self-renewal+to+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic stem cells from self-renewal to lineage commitment.</a> Development. 134 (16), 2895-2902 (2007).</li>
<li>Elkins, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+characterization+of+the+Published+Kinase+Inhibitor+Set%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Comprehensive characterization of the Published Kinase Inhibitor Set.</a> Nature Biotechnology. 34 (1), 95-103 (2016).</li>
<li>Williams, C. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erk5+Is+a+Key+Regulator+of+Naive-Primed+Transition+and+Embryonic+Stem+Cell+Identity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Erk5 Is a Key Regulator of Naive-Primed Transition and Embryonic Stem Cell Identity.</a> Cell Reports. 16 (7), 1820-1828 (2016).</li>
<li>Cao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+human+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conversion of human fibroblasts into functional cardiomyocytes by small molecules.</a> Science. 352 (6290), (2016).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+reprogramming+of+fibroblasts+into+neural+stem+cells+by+signaling-directed+transcriptional+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Pharmacological reprogramming of fibroblasts into neural stem cells by signaling-directed transcriptional activation.</a> Cell Stem Cell. 18 (5), 653-667 (2016).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte aus dieser Studie.

Hier zeigen wir eine weit verbreitete Methodik, um die Rolle der Kinase-Signalwege bei der Regulierung des naiv-basierten pluripotenten Übergangs zu untersuchen. Hierbei handelt es sich um eine zentrale Frage im ESC-Bereich. Obwohl Hochdurchsatz-Genomik- und Transkriptomikansätze routinemäßig zur Identifizierung von Schlüssel-Transkriptionsregulatoren naiver und grundierter pluripotenter Zustände verwendet werden, hat sich die Aufklärung von Pluripotenz-Signalisierungsnetzwerken als herausfordernd erwiesen. Wir stellen nun eine flexible Strategie zur Verfügung, die chemische Inhibitoren einsetzt, um Kinasen zu identifizieren, die den naiv-basierten pluripotenten Übergang in mESCs kontrollieren. Dies beruht auf einfachen Geräten, Reagenzien und Materialien, die für die meisten Laboratorien zur Verfügung stehen, die Zellsignalisierung und ESC-Biologie untersuchen. Kritisch für den Erfolg dieser Plattform ist unsere Entwicklung eines robusten Assays, um den Übergang zwischen naiven und grundierten pluripotenten Zuständen zu quantifizieren. Die Etablierung dieses Assays erforderte signifikante iterative Modifikationen an ZellplattDichte, Zeit der Inhibitor-Inkubation und Immunoblotting-Bedingungen. Kleine Molekülansätze gewinnen Traktion für rationellen Einsatz in therapeutischen ESC-Anwendungen 15 , 16 . Eine wesentliche Stärke des kleinen Molekülscreens ist, dass Werkzeugverbindungen für eine effiziente zelluläre Aufnahme entworfen und / oder modifiziert werden. Die Transfektionseffizienz ist nicht beschränkend, und die Verwendung von gefährlichen Abgabesystemen wie Lentivirus ist nicht erforderlich. Darüber hinaus hemmen Inhibitoren häufig mehrere Isoformen innerhalb einer Kinase-Familie ( z. B. Fgfr1-4, Jak1-3), die eine funktionelle Redundanz überwindet, die genetische / genomische Interferenztechniken wie RNAi und CRISPR / Cas9 behindert. Da stärkere und selektive Werkzeugverbindungen sowohl aus akademischen als auch pharmazeutischen Wirkstoffforschungsprogrammen zur Verfügung stehen, werden unterschätzte und schlecht verstandene Kinasen an die Spitze der ESC-Forschung gelegt. Wir schlagen daher vor, dass diese hoch-thRoughput Screening-Ansatz eröffnet neue Wege der Forschung in Kern-ESC Regulierungsnetzwerke. Eine geringfügige Einschränkung dieser Technologie ist, dass selbst die stärksten und selektivsten Molekülinhibitoren in vivo mehrere nicht verwandte Kinasen einspritzen und hemmen. Jedoch erlauben zunehmend umfassende Kinase-Inhibitor-Profiling-Daten, dass funktionelle Ziele von Kinase-Inhibitoren leicht identifiziert werden können (http://lincs.hms.harvard.edu/kinomescan; http://www.kinase-screen.mrc.ac.uk/kinase -Inhibitoren). Schließlich kann grundsätzlich unsere Plattform angewendet werden, um jeden kleinen Molekülsammel- und / oder zellulären Assay abzufragen, für den qualitativ hochwertige Immunoblotting-Antikörper verfügbar sind. Dies ermöglicht die Untersuchung mehrerer regulatorischer Systeme in der Pluripotenzregulation und erleichtert die Identifizierung von kleinen Molekülinhibitoren, die verschiedene zelluläre Prozesse modifizieren. Speziell sehen wir die Anwendung von aufkommenden kleinen Molekülsammlungen wie dem EpigenTic-Sonden, die vom Structural Genomics Consortium (http://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics) entwickelt wurden, haben das Potenzial, weitere neuartige Regulatoren von pluripotenten Übergängen aufzudecken.

Embryonale Stammzellen (ESCs) haben die Fähigkeit, sich selbst zu erneuern oder in jeden Zelltyp im erwachsenen Körper zu differenzieren, ein Phänomen, das als Pluripotenz bekannt ist. Der jüngste Beweis deutet darauf hin, dass entwicklungsbedingte pluripotenten Zustände existieren, die als &quot;naive&quot; und &quot;grundierte&quot; Pluripotenz bezeichnet werden. Naive ESCs repräsentieren einen Entwicklungszustand ähnlich dem, der im Präimplantationsembryo gefunden wurde 3 . Im Gegensatz dazu sind grundierte pluripotenten ESCs bereit, Pluralipotenz zu verlassen und in spezialisierte embryonische Linien 4 , 5 zu differenzieren. Naive und grundierte pluripotenten Zustände sind durch unterschiedliche Genregulationsnetze gekennzeichnet. Naive Pluripotenz ist durch die Expression von Schlüsselpluripotenz-Transkriptionsfaktoren wie Nanog, Krueppel-artigen Transkriptionsfaktoren (Klfs), Rex1 2 und Esrrb charakterisiert <supClass = &quot;xref&quot;&gt; 6 Bei Maus-ESCs (mESCs) ist die grundierte Pluripotenz durch eine reduzierte Expression von naiven Markern und einer spezifischen Genexpressions-Signatur charakterisiert, die die de novo DNA-Methyltransferase Dnmt3b 7 enthält . In vivo exprimieren die grundierten pluripotenten postimplantation epiblaststammzellen (EpiSCs) 4 , 5 zusätzlich den Epiblastmarker Fgf5 und Marker der Abstammungsgrundierung wie Brachyury 8 . MESCs stellen ein tragbares Modell zur Verfügung, um Mechanismen zu untersuchen, die naiv-grundierte pluripotenten Übergänge in vitro kontrollieren. Bei der Kultivierung in Leukämie-Hemmfaktor (LIF) und fötalem Rinderserum (FBS) unterliegen mESCs einem dynamischen Übergang zwischen naiven und grundierten pluripotenten Zuständen 9 , 10 . LIF-Jak-Stat3-Signalisierungsfunktionen zur Förderung eines naiven Genregulationsnetzes 11 </Sup&gt;, während die autokrine Signalisierung über den Fibroblastenwachstumsfaktor 4 (Fgf4) Erk1 / 2-Weg den Übergang zum grundierten Zustand 12 überträgt. Allerdings bleibt es eine Herausforderung, die Rolle der Proteinkinasen bei der Festlegung unterschiedlicher pluripotenter Zustände systematisch zu bewerten. Hier beschreiben wir eine quantitative und skalierbare Plattform, mit der gezielte kleine Molekülbildschirme für Kinase-Regulatoren des naiv-grundierten pluripotenten Übergangs durchgeführt werden können. Wir verwenden einfache mESC-Kulturbedingungen und Standardreagenzien, Materialien und Ausrüstung, um Kinase-Inhibitoren mit bisher unbekannter Fähigkeit zur Stabilisierung naiver Pluripotenz aufzudecken und zu validieren. Darüber hinaus diskutieren wir potenzielle erweiterte Anwendungen für diese Technologie, einschließlich für das Screening von anderen kleinen Molekülsammlungen wie auftauchende Inhibitorbibliotheken, die epigenetische Regulatoren ansprechen.

<table><tbody><tr><td>mESC media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCE mESCs</td><td>ATCC</td><td>ATCC&nbsp; SCRC-1023</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Media</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td>Finale: 2 mM</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Finale: 50 U/ml</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td>Finale: 0,1 mM</td></tr><tr><td>Leukämie-Hemmfaktor (GST-Fusion)</td><td>MRC-PPU Reagenzien und Dienstleistungen</td><td></td><td>Final: 100 ng/ml</td></tr><tr><td>Leukämie-Hemmfaktor</td><td>Thermo</td><td>PMC9484</td><td>Final: 100 ng/ml</td></tr><tr><td>nicht-essentielle Aminosäuren</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>Finale: 0,1 mM</td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td>Finale: 1 mM</td></tr><tr><td>KnockOut-Serumersatz</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td>Final: 5%</td></tr><tr><td>definiertes fötales Rinderserum</td><td>Fisher</td><td>10703464</td><td>Finale: 10%</td></tr><tr><td>Name</td><td><>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>TC-Materialien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,05%), phenolrot</td><td>Thermo</td><td>25300054&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine aus Schweinehaut</td><td>Sigma</td><td>1890</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MicroWell 96-Well Microplatten</td><td>Thermo</td><td>156545</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, kein Calcium, kein Magnesium</td><td>Gibco</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>V-Boden 96 Well Platten</td><td>Greiner Bio-one</td><td>651261</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company<</td><td> strong>Katalognummer</td><td>Kommentare</strong</td></tr><tr><td>>LysepufferTris-Puffer</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>VWR</td><td>103157P</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>VWR</td><td>97061</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E4884</td><td></td></tr><tr><td>1% NP-40</td><td>Sigma</td><td>9016-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Natrium Desoxycholat</td><td>Sigma</td><td>D6750-100g</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Glycerophosphat</td><td>Sigma</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyrophosphat</td><td>Sigma</td><td>13472-36-1</td><td></td></tr><tr><td>Natriumfluorid</td><td>Sigma</td><td>450022</td><td></td></tr><tr><td>Natriumorthovanadat</td><td>Sigma</td><td>450243</td><td></td></tr><tr><td>Roche Complete Protease Inhibitor Cocktail Tabletten</td><td>Sigma</td><td>CO-RO</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Name</td><td>Unternehmen</td><td>Katalognummer</td><td><>Kommentare</td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween</td><td>Sigma</td><td>P1379-1L</td><td></td></tr><tr><td>Milchpulver</td><td>Marvel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen</td><td><>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Western Blotting</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protran BA 85 Nitrocellulose 0,45 &m³; M&nbsp; Porengröße (20 cm x 20 cm Bogen) (25 Blatt)</td><td>GE</td><td>10401191</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Sigma</td><td>P7170-1L</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Firma</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</strong</td></tr><tr><td>>Laborgeräte</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minifold I System</td><td>GE</td><td>10447850</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc Imager</td><td>BioRad</td><td>1708280&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>LiCor Odyssey Imager</td><td>LiCor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer</td><td>><Kommentare</td></tr><tr><td>Antikörper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus</td><td>Nanog Reprocell</td><td>RCAB001P</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Dnmt3b</td><td>Imgenex</td><td>IMG-184A</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW Esel Anti-Kaninchen</td><td>Licor</td><td>926-32213</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus-HRP</td><td>Zellsignaltechnologie</td><td>7076S</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Klf2</td><td>Millipore</td><td>09-820</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Klf4</td><td>R& D Systems</td><td>AF3158</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Oct4</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-5279</td><td></td></tr></tbody></table>

eine einfache methode zur identifizierung von kinasen, die die embryonale stammzell-pluripotenz durch hochdurchsatz-inhibitor-screening regulieren

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

Embryonale Stammzellen (ESCs) können sich in alle Zelltypen selbst erneuern oder differenzieren, ein Phänomen, das als Pluripotenz bekannt ist. Es wurden ausgeprägte pluripotenten Zustände beschrieben, die als &quot;naive&quot; und &quot;grundierte&quot; Pluripotenz bezeichnet werden. Die Mechanismen, die den naiv-vorbereiteten Übergang kontrollieren, sind schlecht verstanden. Insbesondere bleiben wir schlecht über Proteinkinasen informiert, die naive und grundierte pluripotenten Zustände angeben, trotz der zunehmenden Verfügbarkeit von hochwertigen Werkzeugverbindungen zur Sonden-Kinase-Funktion. Hier beschreiben wir eine skalierbare Plattform, um gezielte kleine Molekülbildschirme für Kinase-Regulatoren des naiv-grundierten pluripotenten Übergangs in Maus-ESCs durchzuführen. Dieser Ansatz nutzt einfache Zellkulturbedingungen und Standardreagenzien, Materialien und Geräte, um Kinase-Inhibitoren mit bisher nicht geschätzten Effekten auf Pluripotenz aufzudecken und zu validieren. Wir diskutieren potenzielle Anwendungen für diese Technologie, einschließlich Screening von anderen kleinen MolekülSammlungen wie zunehmend anspruchsvolle Kinase-Inhibitoren und auftauchende Bibliotheken epigenetischer Werkzeugverbindungen.

Mit dem hier vorgestellten Verfahren (Abbildung 1 ) werden die LINCS-Bibliothek von 228 potenten und selektiven Kinase-Inhibitoren zur Identifizierung von MESC-Pluripotenzen untersucht. Die Bibliothek wird in einer Konzentration von 0,1 mM für eine 1: 100-Verdünnung und endgültige Siebkonzentration von 1 &amp; mgr; M in mESCs hergestellt. 48 h später wurden MESCs lysiert und Extrakte wurden für die quantitative Dot-Blot-Analyse der Nanog- und Dnmt3b-Expression vorbereitet (Abbildung 2 , oben). Ergebnisse aus anderen Screening-Konzentrationen sind hier nicht zur Kürze dargestellt. Nanog: Dnmt3b-Verhältnis wird für jeden Kinase-Inhibitor bestimmt und die Verbindungen werden eingestuft und ein 2x-Cut-off angewendet (Abbildung 2 , unten). Das Gesamt-Nanog- und Dnmt3b-Signal relativ zur Kontrolle wird auf die Inhibitor-Rangliste überlagert und einem 0,5-fachen Cut-off unterworfen, um ein Triaging von Inhibitoren zu ermöglichen, die eine signifikante MESC-Toxizität aufweisen. Wählen Sie Kinase-Inhibitoren, die die naive sta stabilisierenTe werden mit konventioneller Nanog / Dnmt3b-Immunoblotting validiert (Abbildung 3 ). Die primären Kinase-Targets dieser Inhibitoren sind in Tabelle 1 dargestellt. Wir zeigen auch die Anwendbarkeit dieses Bildschirms, um Inhibitoren zu identifizieren, die den grundierten Zustand stabilisieren 14 . <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55515/55515fig1.jpg" /> Abbildung 1: Workflow zum Screening von Kinase-Inhibitoren, die den naiv-primierten Übergang modulieren MESC wurden mit einer 228-Verbindungs-Kinase-Inhibitor-Bibliothek in einer Endkonzentration von 1 &amp; mgr; M behandelt. Lysate wurden hergestellt und auf Nitrozellulosemembranen zur Immuno-Dot-Blot-Analyse transferiert und Nanog- und Dnmt3b-Spiegel bestimmt (Abbildung von Williams et al., 14 ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55515/55515fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier um al</a><html> Arger Version dieser Figur. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55515/55515fig2.jpg" /> Abbildung 2: Naive-grundierte Pluripotenz-Screen-Analyse und Inhibitor-Identifizierung. (Top) Repräsentative Nanog- und Dnmt3b-Immuno-Dot-Blot-Bilder. (Bottom) Nanog- und Dnmt3b-Werte für jeden Kinase-Inhibitor wurden relativ zu der DMSO-Kontrolle bestimmt, und Nanog: Dnmt3b-Verhältnisse und insgesamt relatives Nanog + Dnmt3b-Signal bestimmt und Inhibitoren im Vergleich zur DMSO-Kontrolle eingestuft. Inhibitoren gefunden, um Nanog zu ändern: Dnmt3b-Verhältnis über eine 2-fache Schwelle oberhalb oder unterhalb der DMSO-Kontrolle wurden als Treiber der naiven oder grundierten Pluripotenz identifiziert. Eine Schwelle von 2x unterhalb der DMSO-Kontrolle wurde auf Triage-Inhibitoren eingestellt, die das Überleben von MESC beeinträchtigen. Für die weitere Validierung ausgewählte Inhibitoren werden hervorgehoben. (Abbildung von Williams et al., 14 ).S / ftp_upload / 55515 / 55515fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/55515/55515fig3.jpg" /> Abbildung 3: Validierung ausgewählter Trefferverbindungen identifiziert MESCs wurden entweder mit 1 &amp; mgr; M AZD4547 (einem selektiven FGFR-Inhibitor) oder den angegebenen Inhibitoren, die aus dem Screen in Fig. 2 identifiziert wurden, behandelt. Nanog: Dnmt3b-Spiegel, bestimmt durch Standard-SDS-PAGE und Immunoblot-Analyse. Numerische Werte von relativen Nanog: Dnmt3b und Nanog + Dnmt3b sind in der nachstehenden Tabelle angegeben und Inhibitoren, die den naiven pluripotenten Zustand, der grün hervorgehoben ist, stabilisieren. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55515/55515fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Verbindung </td><td colspan="2"> Primäre Ziele </td><td> Andere Ziele </td></tr><tr><td> AV-951 </td><td colspan="2"> VEGFR </td><td></td></tr><tr><td> HG-6-64-01 </td><td colspan="2"> ABL, BRAF, RET, CSF1R, EGFR, EPHA8, FGFR, FLT3, KIT, LOK, MAP4K1, p38b, MUSK, PDGFR, TAOK3, TNNI3K </td><td></td></tr><tr><td> WH-4-023 </td><td colspan="2"> Lck </td><td> Src </td></tr><tr><td> R406 </td><td colspan="2"> Syk </td><td></td></tr><tr><td> GW-572016 </td><td colspan="2"> HER2 </td><td> EGFR </td></tr><tr><td> KIN001-244 </td><td colspan="2"> PDK1 </td><td></td></tr><tr><td> WZ-4-145 </td><td colspan="2"> CSF1R, DDR1, EGFR, TIE1, PDGFR2 </td><td></td></tr><tr><td> WZ-7043 </td><td colspan="2"> CSF1R, DDR1, FGFR und TAO1 </td><td></td></tr><tr><td> GW786034 </td><td colspan="2"> VEGFR1 </td><td> VEGFR2, VEGFR3 &amp;# 160; </td></tr><tr><td> AZD-1480 </td><td colspan="2"> JAK2 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Ausgewählte Hit-Verbindungen und ihre primäre Kinase-Ziel (e).

Hier stellen wir ein quantitatives und skalierbares Protokoll vor, um gezielte kleine Molekülbildschirme für Kinase-Regulatoren des naiv-grundierten pluripotenten Übergangs durchzuführen.

Eine einfache Methode zur Identifizierung von Kinasen, die die embryonale Stammzell-Pluripotenz durch Hochdurchsatz-Inhibitor-Screening regulieren

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

Das übergeordnete Ziel dieses Screenings ist es, niedermolekulare Proteinkinase-Inhibitoren zu identifizieren, die die Pluripotenz embryonaler Stammzellen modulieren. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der embryonalen Stammzellsignale zu beantworten, indem sie neue Proteinkinase-Signalwege identifiziert, die die Pluripotenz embryonaler Stammzellen regulieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht also darin, dass das Screening mit Standard-Laborgeräten und leicht verfügbaren Reagenzien relativ einfach durchzuführen ist.Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir feststellten, dass die meisten Forschungen zu Pluripotenz-Signalwegen riesige Wellen des Kinoms völlig ignoriert hatten. Bereiten Sie mit Gelatine überzogene 10-Zentimeter-Gerichte zu, indem Sie fünf Milliliter 0,1 % Gelatine auf 10 Zentimeter große Platten geben. Nach einer fünfminütigen Inkubation bei Raumtemperatur die Gelatine einatmen und die Platte zwei Minuten trocknen lassen.Plattieren Sie dann eine beliebige Standard-Maus-ES-Zelllinie auf den beschichteten Schalen in Standard-Maus-ES-Zellmedien, die 100 Nanogramm pro Milliliter GST-markiertes LIF, 10 % fötales Kälberserum und 5 % Knockout-Serumersatz enthalten. Kultivieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius, 5% CO2 und tauschen Sie das Medium jeden Tag aus. Passieren Sie die ES-Zellen der Maus jeden zweiten Tag mit einer Konfluenz von etwa 80 %, indem Sie das Medium aspirieren und mit fünf Millilitern phosphatgepufferter Kochsalzlösung pro Platte waschen.Fügen Sie dann einen Milliliter Trypsin-EDTA pro Platte mit Maus-ES-Zellen hinzu und inkubieren Sie 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation werden die trypsinisierten Zellen in vier Millilitern Medium resuspendiert und fünf Minuten lang bei 1200 U/min zentrifugiert. Suspendieren Sie das resultierende Zellpellet gründlich in fünf Millilitern Medium und pipetieren Sie es auf und ab, um eine Einzelzellsuspension zu erzeugen.Zählen Sie die Zellen, indem Sie eine 10-Mikroliter-Zellsuspension und 10 Mikroliter Trypanblau kombinieren. Geben Sie die Mischung in eine Zellzählkammer oder verwenden Sie ein Hämozytometer und ein Lichtmikroskop. Anschließend werden 3000 ES-Zellen der Maus mit einer Mehrkanalpipette in 0,1 %ige gelatinebeschichtete 96-Well-Platten in einem Endvolumen von 100 Mikrolitern Medium gesät.Tragen Sie dann Kinaseinhibitoren in einer Verdünnung von eins bis 100 mit einer Mehrkanalpipette auf. Pipettieren Sie das Medium vorsichtig, um den Inhibitor und die Zellsuspension zu mischen. Lassen Sie die Zellen dann eine Stunde lang in einer Gewebekulturhaube ruhen, um eine gleichmäßige Verteilung auf der Beschichtungsoberfläche zu gewährleisten.Kultivieren Sie die Zellen 48 Stunden lang, ohne das Medium zu wechseln. Um mit der Screening-Analyse zu beginnen, waschen Sie 96-Well-ES-Zellplatten der Maus in 200 Mikrolitern PBS mit einem Mehrkanal-Aspirator und Pipetten. Nach dem Waschen die Zellextrakte in 150 Mikroliter Lysepuffer mischen.Klären Sie die Extrakte durch Zentrifugation bei 1500 mal G für 30 Minuten in 96-Well-Platten mit V-Boden. Immobilisieren Sie dann 100 Mikroliter Überstände auf einer Nitrozellulosemembran mit einem 96-Well-Vakuum-Dotplot-Verteiler. Trocknen Sie die Membran und färben Sie sie mit 40 Millilitern Ponceau S, um eine gleichmäßige Übertragung zu gewährleisten.Nachdem Sie die Membran mit TBST gewaschen haben, blockieren Sie sie in TBST plus 3% Milch. Dann inkubieren Sie die Membran in Nanog- und Dnmt3b-Antikörpern in einer Verdünnung von eins bis 1000 im Blockierungspuffer über Nacht. Waschen Sie die Membran am nächsten Tag dreimal für 10 Minuten in TBST.Inkubieren Sie es dann in 30 Millilitern Sekundärantikörpern in einer Verdünnung von eins bis 10.000 in Blockierungspuffer. Entwickeln Sie die Membran mit einem digitalen Immunoblotting-Bildgebungssystem. Es ist wichtig, die im Screening identifizierten Kinase-Inhibitoren mit konventionellem Immunblotting zu validieren, bevor man fortfährt.Dies hilft, Fehlalarme vor der weiteren nachgelagerten Analyse zu entfernen. Analysieren Sie die Screening-Daten und validieren Sie Inhibitoren als echte Pluripotenzregulatoren, wie im Textprotokoll beschrieben. Hier ist ein repräsentatives Nanog-Punktdiagramm aus dem durchgeführten Bildschirm zu sehen.Positivkontrollinhibitoren, die eine geprimte oder naive Pluripotenz auslösen, werden hervorgehoben. Ebenfalls zu sehen ist ein repräsentativer Dnmt3b-Punktplot aus dem durchgeführten Bildschirm. Positivkontrollinhibitoren, die eine geprimte oder naive Pluripotenz auslösen, werden erneut hervorgehoben.In diesem Diagramm wurden die Inhibitoren nach dem Verhältnis von Nanog zu Dnmt3b eingestuft. Ein zweifacher Schwellenwert für das Verhältnis von Nanog zu Dnmt3b wird festgelegt, um Inhibitoren zu identifizieren, die eine naive oder geprimte Pluripotenz stabilisieren. Summierte Nanog- und Dnmt3b-Signale werden ebenfalls bereitgestellt.Darüber hinaus werden Kinase-Inhibitoren, die für eine weitere Validierung ausgewählt wurden, aufgeführt. Hier ist eine konventionelle Immunoblot-Validierung ausgewählter Kinase-Inhibitoren, Nanog- und Dnmt3b-Immunblots sowie des Nanog-zu-Dnmt3b-Verhältnisses und des Gesamtsignals dargestellt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man niedermolekulare Kinase-Inhibitoren identifiziert, die die Pluripotenz embryonaler Stammzellen modulieren.Einmal gemeistert, kann diese Technik in 72 Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Obwohl diese Methode Einblicke in die Kinase-Signalwege geben kann, die die Pluripotenz steuern, kann sie auch auf die Differenzierung embryonaler Stammzellen und andere regulatorische Systeme wie epigenetische Modifikatoren angewendet werden. Nach dem Verfahren können andere Bibliotheken von niedermolekularen Inhibitoren, z. B. solche, die auf epigenetische Modifikatoren abzielen, verwendet werden, um neue Akteure in der Pluripotenzregulation zu identifizieren.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für unsere Forschungsgruppe, um neue Pluripotenz-Signalwege aufzuklären. Wir verwenden diese Technik, um eine neue Rolle für den amplifizierten Signalweg bei der Regulierung der Pluripotenz zu identifizieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

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Wir beschreiben eine Methode kombiniert automatisierte Zellkultur mit High-Content-Bildgebung zur Visualisierung und Quantifizierung von mehreren zellulären Prozessen und Strukturen, in einem High-Throughput Weise. Solche Methoden können in der weiteren funktionellen Annotation von Genomen Hilfe sowie zu identifizieren Krankheit Gen-Netzwerke und mögliche Angriffspunkte für Medikamente.

High Content Screening in Neurodegenerative Diseases

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Oct4GiP Reporter Assay auf Gene, die Maus embryonalen Stammzellen Wartungs-und Self-Study Erneuerung Regulate

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Eine einfache Methode zur Identifizierung von Kinasen, die die embryonale Stammzell-Pluripotenz durch Hochdurchsatz-Inhibitor-Screening regulieren (Video) | JoVE Journal

Eine einfache Methode zur Identifizierung von Kinasen, die die embryonale Stammzell-Pluripotenz durch Hochdurchsatz-Inhibitor-Screening regulieren

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