Eine einfache Methode zur Identifizierung von Kinasen, die die embryonale Stammzell-Pluripotenz durch Hochdurchsatz-Inhibitor-Screening regulieren

Das übergeordnete Ziel dieses Screenings ist es, niedermolekulare Proteinkinase-Inhibitoren zu identifizieren, die die Pluripotenz embryonaler Stammzellen modulieren. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der embryonalen Stammzellsignale zu beantworten, indem sie neue Proteinkinase-Signalwege identifiziert, die die Pluripotenz embryonaler Stammzellen regulieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht also darin, dass das Screening mit Standard-Laborgeräten und leicht verfügbaren Reagenzien relativ einfach durchzuführen ist.

Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir feststellten, dass die meisten Forschungen zu Pluripotenz-Signalwegen riesige Wellen des Kinoms völlig ignoriert hatten. Bereiten Sie mit Gelatine überzogene 10-Zentimeter-Gerichte zu, indem Sie fünf Milliliter 0,1 % Gelatine auf 10 Zentimeter große Platten geben. Nach einer fünfminütigen Inkubation bei Raumtemperatur die Gelatine einatmen und die Platte zwei Minuten trocknen lassen.

Plattieren Sie dann eine beliebige Standard-Maus-ES-Zelllinie auf den beschichteten Schalen in Standard-Maus-ES-Zellmedien, die 100 Nanogramm pro Milliliter GST-markiertes LIF, 10 % fötales Kälberserum und 5 % Knockout-Serumersatz enthalten. Kultivieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius, 5% CO2 und tauschen Sie das Medium jeden Tag aus. Passieren Sie die ES-Zellen der Maus jeden zweiten Tag mit einer Konfluenz von etwa 80 %, indem Sie das Medium aspirieren und mit fünf Millilitern phosphatgepufferter Kochsalzlösung pro Platte waschen.

Fügen Sie dann einen Milliliter Trypsin-EDTA pro Platte mit Maus-ES-Zellen hinzu und inkubieren Sie 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation werden die trypsinisierten Zellen in vier Millilitern Medium resuspendiert und fünf Minuten lang bei 1200 U/min zentrifugiert. Suspendieren Sie das resultierende Zellpellet gründlich in fünf Millilitern Medium und pipetieren Sie es auf und ab, um eine Einzelzellsuspension zu erzeugen.

Zählen Sie die Zellen, indem Sie eine 10-Mikroliter-Zellsuspension und 10 Mikroliter Trypanblau kombinieren. Geben Sie die Mischung in eine Zellzählkammer oder verwenden Sie ein Hämozytometer und ein Lichtmikroskop. Anschließend werden 3000 ES-Zellen der Maus mit einer Mehrkanalpipette in 0,1 %ige gelatinebeschichtete 96-Well-Platten in einem Endvolumen von 100 Mikrolitern Medium gesät.

Tragen Sie dann Kinaseinhibitoren in einer Verdünnung von eins bis 100 mit einer Mehrkanalpipette auf. Pipettieren Sie das Medium vorsichtig, um den Inhibitor und die Zellsuspension zu mischen. Lassen Sie die Zellen dann eine Stunde lang in einer Gewebekulturhaube ruhen, um eine gleichmäßige Verteilung auf der Beschichtungsoberfläche zu gewährleisten.

Kultivieren Sie die Zellen 48 Stunden lang, ohne das Medium zu wechseln. Um mit der Screening-Analyse zu beginnen, waschen Sie 96-Well-ES-Zellplatten der Maus in 200 Mikrolitern PBS mit einem Mehrkanal-Aspirator und Pipetten. Nach dem Waschen die Zellextrakte in 150 Mikroliter Lysepuffer mischen.

Klären Sie die Extrakte durch Zentrifugation bei 1500 mal G für 30 Minuten in 96-Well-Platten mit V-Boden. Immobilisieren Sie dann 100 Mikroliter Überstände auf einer Nitrozellulosemembran mit einem 96-Well-Vakuum-Dotplot-Verteiler. Trocknen Sie die Membran und färben Sie sie mit 40 Millilitern Ponceau S, um eine gleichmäßige Übertragung zu gewährleisten.

Nachdem Sie die Membran mit TBST gewaschen haben, blockieren Sie sie in TBST plus 3% Milch. Dann inkubieren Sie die Membran in Nanog- und Dnmt3b-Antikörpern in einer Verdünnung von eins bis 1000 im Blockierungspuffer über Nacht. Waschen Sie die Membran am nächsten Tag dreimal für 10 Minuten in TBST.

Inkubieren Sie es dann in 30 Millilitern Sekundärantikörpern in einer Verdünnung von eins bis 10.000 in Blockierungspuffer. Entwickeln Sie die Membran mit einem digitalen Immunoblotting-Bildgebungssystem. Es ist wichtig, die im Screening identifizierten Kinase-Inhibitoren mit konventionellem Immunblotting zu validieren, bevor man fortfährt.

Dies hilft, Fehlalarme vor der weiteren nachgelagerten Analyse zu entfernen. Analysieren Sie die Screening-Daten und validieren Sie Inhibitoren als echte Pluripotenzregulatoren, wie im Textprotokoll beschrieben. Hier ist ein repräsentatives Nanog-Punktdiagramm aus dem durchgeführten Bildschirm zu sehen.

Positivkontrollinhibitoren, die eine geprimte oder naive Pluripotenz auslösen, werden hervorgehoben. Ebenfalls zu sehen ist ein repräsentativer Dnmt3b-Punktplot aus dem durchgeführten Bildschirm. Positivkontrollinhibitoren, die eine geprimte oder naive Pluripotenz auslösen, werden erneut hervorgehoben.

In diesem Diagramm wurden die Inhibitoren nach dem Verhältnis von Nanog zu Dnmt3b eingestuft. Ein zweifacher Schwellenwert für das Verhältnis von Nanog zu Dnmt3b wird festgelegt, um Inhibitoren zu identifizieren, die eine naive oder geprimte Pluripotenz stabilisieren. Summierte Nanog- und Dnmt3b-Signale werden ebenfalls bereitgestellt.

Darüber hinaus werden Kinase-Inhibitoren, die für eine weitere Validierung ausgewählt wurden, aufgeführt. Hier ist eine konventionelle Immunoblot-Validierung ausgewählter Kinase-Inhibitoren, Nanog- und Dnmt3b-Immunblots sowie des Nanog-zu-Dnmt3b-Verhältnisses und des Gesamtsignals dargestellt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man niedermolekulare Kinase-Inhibitoren identifiziert, die die Pluripotenz embryonaler Stammzellen modulieren.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in 72 Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Obwohl diese Methode Einblicke in die Kinase-Signalwege geben kann, die die Pluripotenz steuern, kann sie auch auf die Differenzierung embryonaler Stammzellen und andere regulatorische Systeme wie epigenetische Modifikatoren angewendet werden. Nach dem Verfahren können andere Bibliotheken von niedermolekularen Inhibitoren, z. B. solche, die auf epigenetische Modifikatoren abzielen, verwendet werden, um neue Akteure in der Pluripotenzregulation zu identifizieren.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für unsere Forschungsgruppe, um neue Pluripotenz-Signalwege aufzuklären. Wir verwenden diese Technik, um eine neue Rolle für den amplifizierten Signalweg bei der Regulierung der Pluripotenz zu identifizieren.