Name: Bewertung der Hippocampalen Dendritischen Komplexität bei gealterten Mäusen unter Verwendung der Golgi-Cox-Methode (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Erfahren Sie die Golgi-Cox-Färbung zur Analyse dendritischer Morphologie und Komplexität im Hippocampus gealterter Mäuse. Diese Methode ermöglicht präzise neuronale Strukturuntersuchungen ohne Gewebeschäden.

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Diese Arbeit wurde von einem Pilotstipendium unter NIH P20 GM109005 (ARA) und dem Zentrum für Translational Neuroscience IDeA Programmpreis P30 GM110702 unterstützt.

Experimente wurden in Übereinstimmung mit den ethischen Standards durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee bei UAMS genehmigt wurden. 1. Tiere und 5-Fu Einspritzung Paradigma <ol><li> Kaufen Sie 6 Monate alte männliche C57Bl6 / J Wildtyp Mäuse und beherbergen sie unter einem konstanten 12 h Licht / Dunkel Zyklus bis sie 1 Jahr alt sind. </li><li> Verdünnen Sie die 5-Fu in 0,9% steriler Kochsalzlösung. Verwenden Sie 60 mg / kg als benötigte Dosis pro Maus. </li><li> Geben Sie die intraperitonealen Injektionen der 5-Fu (einmal pro Woche für drei Wochen). <ol><li> Geben Sie die intraperitonealen Injektionen um die gleiche Zeit an jedem Tag. Zum Beispiel zwischen 0900-1200 h. </li></ol></li><li> Euthanisieren Sie die Tiere und extrahieren Sie die Gehirne 30 Tage nach der letzten Injektion. </li></ol> 2. Euthanasie-Verfahren und Hirn-Extraktion <ol><li> Das Nagetier zurückhalten und die Schwanzbasis greifen Mit der anderen Hand, legen Sie den Daumen oder den ersten Finger auf thE Grund des Nagetieres. Schnell den Druck auf den Nagetier stellen und nach vorne drücken, während die andere Hand, die den Schwanz hält, nach hinten zieht. </li><li> Halten Sie das Nagetier mit einer Hand und die große chirurgische Schere mit dem anderen. Setzen Sie den Nagetier Hals zwischen die beiden Klingen und schnell enthaupten den Kopf. </li><li> Nimm den abgetrennten Mauskopf und benutze die feine Schere, um das Fell über dem Schädel zu schneiden, bis zu den Augen. Als nächstes legen Sie die Spitzen der Schere in jede Augenhöhle und schließen Sie die Schere mit leichter Kraft. </li><li> Verwenden Sie die Frühjahrsschere, um den Schädel nach links und rechts vom Kleinhirn zu schneiden. </li><li> Verwenden Sie Pinzette, um den Teil des Schädels, der das Kleinhirn umgibt, direkt auf und ab zu heben. </li><li> Benutze die Frühlingsschere, um die midsagittale Linie des Schädels zu schneiden. </li><li> Benutze die Pinzette, um den restlichen Teil des Schädels vom Gehirn zu heben. </li><li> Verwenden Sie einen Spatel und eine Sonde, um das Gehirn in den gewünschten Behälter zu schöpfen. Mit rostfreiem sTeel Klinge, schneiden Sie jedes Gehirn entlang der midsagittalen Ebene. Führen Sie die folgenden Golgi-Cox-Methode auf den rechten Halbkugeln durch. </li></ol> 3. Golgi-Färbung und Gewebevorbereitung <ol><li> Tauchen Sie die frisch geernteten Halbhirne in eine 5-ml-Quecksilberchlorid-basierte Lösung (Lösung A aus dem Kit) in ein 10 ml konisches Röhrchen ein. Die Quecksilberchloridlösung ist lichtempfindlich; Den Schlauch mit Folie bedecken. Die Probe im Raum bei Raumtemperatur aufbewahren. HINWEIS: Die Lösung A ist im Kit enthalten, das in der Werkstoffliste aufgeführt ist. Vorsicht! Lösung A (auch Quecksilberchloridlösung genannt) enthält toxische Reagenzien wie Kaliumdichromat, Quecksilberchlorid und Kaliumchromat. Schutzhandschuhe tragen und in einer Dunstabzugshaube arbeiten. </li><li> Nach 1 Tag langsam dekantieren die Lösung in einen temporären Container (wie ein großes Wägeboot), und entsorgen Sie es in einem biohazard Abfallbehälter. Tauchen Sie die Gehirne (noch in den ursprünglichen 10 ml konischen Röhrchen) mit 5 mlDie Quecksilberchloridlösung, und die Probe bei Raumtemperatur für 13 weitere Tage zur Dunkelheit zurückkehren. </li><li> Füge 30 g Nachimprägnierungspuffer zu 90 ml destilliertem oder deionisiertem Wasser (dH 2 O) hinzu. Füllen Sie jede Vertiefung einer 6-Well-Platte mit 6,5 ml des Nachimprägnierungspuffers, einer gut pro Gehirn HINWEIS: Der Nachimprägnierungspuffer ist im Kit enthalten, der in der Materialliste aufgeführt ist. <ol><li> Nach 14 Tagen (insgesamt) in der Quecksilberchloridlösung das Gewebe mit dH 2 O ausspülen und dann mit Nachimprägnierungspuffer in 6-Well-Platten überführen. Die Platten mit Folie bedecken und bei Raumtemperatur im Dunkeln aufbewahren. </li></ol></li><li> Den Nachimprägnierungspuffer nach 1 Tag Eintauchen ausspülen und mit frischem Nachimprägnierungspuffer erneuern; 1 Tag im Dunkeln bei Raumtemperatur aufbewahren. Falls erforderlich, bei 4 ° C bis zu 1 Monat 22 lagern. </li></ol> 4. Schnitt <ol><li> Etikettieren Sie die 12-Well-Platten auf ihren Deckeln mit Zahlen in aufsteigender Reihenfolge von links nach rechts und up-to-down. </li><li> Bereiten Sie zwei oder drei 12-Well-Platten pro Gehirn vor, wenn Sie das gesamte Gehirn schneiden. <ol><li> Beschriften Sie die Oberseite jedes 12-Well-Plattendeckels mit der Identifikationsnummer des Gehirns. </li><li> Pipette 2 ml von 1x PBS in jede Vertiefung jeder Platte. </li></ol></li><li> Richten Sie die Bühne ein und schalten Sie das Vibratom ein. Sicherstellen, dass genügend 1x PBS im Behälter vorhanden ist, um das Gewebe zu bedecken. <ol><li> Schneiden Sie zwei Stücke von Plastik-Paraffin-Film und falten Sie sie über zweimal. Legen Sie sie über die Löcher für die Probenhalterknöpfe, um zu verhindern, dass 1x PBS auf den Zähler austritt. </li><li> Legen Sie das Band auf den Gewebeblock des Probenhalters und legen Sie dann Cyanacrylat-Klebstoff (siehe Materialtabelle) darauf ein. </li></ol></li><li> Entfernen Sie das Gehirn aus der 6-Well-Platte und legen Sie es auf eine Plastik- oder Glasschale. Verwenden Sie den rostfreienStahl-Doppelklinge, um etwa die Hälfte des Kleinhirns abzuschneiden. <ol><li> Schneiden Sie den Kleinhirn kaudal. Vergewissern Sie sich, dass der noch verbleibende Teil des Zerebellums gerade ist. </li></ol></li><li> Sofort die flache Oberfläche des verbleibenden Kleinhirns auf den Leim legen. HINWEIS: Der dorsale Teil des Gewebes (der Hirnrinde) sollte gegenüber der Klinge nach links oder rechts liegen Das rostrale Ende, das zuvor die beigefügte olfaktorische Glühbirne enthielt, sollte nach oben zeigen. <ol><li> Warten Sie mindestens ein paar Minuten, um sicherzustellen, dass der Leim voll trocknet. </li></ol></li><li> Während der Leim, der das Gehirn an Ort und Stelle hält, trocknet, gießt 1x PBS in das Probenbad. Nachdem der Kleber trocken ist, legen Sie den Probenhalter mit dem Gewebe in das Probenbad. <ol><li> Wenn die Gewebeprobe nicht vollständig bedeckt ist, gießen Sie mehr 1x PBS in das Probenbad. </li></ol></li><li> Befestigen Sie die Klinge am Klingenhalter des Vibratoms und langsam lDie Klinge in das Probenbad schieben, bis sie vollständig in 1x PBS untergetaucht ist. Setzen Sie die Klinge fort, bis sie etwas unter der Oberseite des Gewebes liegt. </li><li> Setzen Sie die Vibrationsgeschwindigkeit auf 7, die Amplitude auf 6 und den Schneidwinkel auf 12 ° (siehe Tabelle der Materialien für Vibratom-Modell). Starten Sie die Vibration und schneiden Sie 200 μm Abschnitte 23 . <ol><li> Verwenden Sie einen großen Pinsel, um die Gewebeabschnitte aus dem Probenbad in jede ausgewiesene Vertiefung der 12-Well-Platten zu bewegen. </li></ol></li><li> Weiter, um das Gewebe zu schneiden, bis die gewünschte Anzahl von Gewebeschnitten erreicht ist. </li></ol> 5. Nachfärbung <ol><li> Für jede der folgenden Färbungsschritte und Spülungen 2 ml der angegebenen Lösung pro Vertiefung verwenden. Verwenden Sie einen motorisierten Pipettenfüller (siehe Materialtabelle), um die Lösungen in die Vertiefungen zu übertragen. Verwenden Sie eine Transferpipette (siehe Materialtabelle), um Lösungen aus den Brunnen und in den richtigen Abfall zu transportierenBehälter. </li><li> Spülen Sie die Sektionen in einer 30 min Waschung von 0,01 M PBS-T (fügen Sie 3,0 ml Waschmittel (siehe Tabelle der Materialien) auf 1.000 mL 0,01 M PBS). </li><li> Verdünnung der Ammoniumhydroxidlösung (Achtung) 3: 5 nach Volumen mit dH 2 O unmittelbar vor Gebrauch. Färben Sie die Abschnitte in der verdünnten Ammoniumhydroxidlösung für 19-21 min. <ol><li> Schützen Sie die lichtempfindliche Ammoniumhydroxidlösung mit Folie. HINWEIS: Ammoniumhydroxid in Lösung hat eine Konzentration von ~ 10% und wird als &quot;gefährlich&quot; eingestuft. Ammoniumhydroxidlösung kann Verbrennungen hervorrufen, wenn sie die Haut berühren. Bei Atemstillstand kann es zu Reizungen der Atemwege kommen. Schutzhandschuhe tragen und in einer Dunstabzugshaube arbeiten. </li></ol></li><li> Färben Sie die Abschnitte in den Nachfärbepuffer (fügen Sie 90 g Reagenz D in 500 ml dH 2 O) für 19-21 min hinzu. Der Nachfärbepuffer ist lichtempfindlich; Schütze es mit Folie 22 . </li><li> Spülen Sie die Abschnitte in drei, 5-10 min Wäschen von 0,01 M PBS-T. </li></ol> 6. Montage, Reinigung und Abdeckung <ol><li> Montieren Sie die Abschnitte auf 1% mit Gelatine beschichtete Folien mit dem großen Pinsel. Lassen Sie sie für 20-30 min bei Raumtemperatur trocknen, und legen Sie sie dann über Nacht in ein Coplin-Glas. </li><li> Entfernen Sie die Folien mit Handschuhen aus dem Coplin-Gefäß und legen Sie sie in ein Plastikgestell (siehe Materialtabelle). Legen Sie das Plastikgestell in die Färbeplatte (siehe Materialtabelle) mit 100% Ethanol. Dehydrieren Sie sie mit drei 5 min Wäschen. </li><li> Die Folien zweimal für jeweils 5 min in 99% Xylol waschen. Legen Sie die Objektträger in ein Glasgestell und senken Sie das Gestell in eine Glasfärbeplatte, die Xylol mit einem Metallgriff enthält (siehe Materialtabelle). HINWEIS: Vorsicht, Xylol ist schädlich bei Einatmen und verursacht Reizungen, wenn es die Haut berührt. Es ist leicht entflammbar in flüssigen und Dampfzuständen. Schutzhandschuhe tragen und in einer Dunstabzugshaube arbeiten. </li><li> Entfernen Sie die Folien aus dem XylEne eins zu einer Zeit und schnell decken das Gewebe mit ~ 0,25 mL Montagemedien (siehe Material Tabelle). Als nächstes nehmen Sie die Rutschenabdeckungen und legen sie über die Medien. <ol><li> Schieben Sie alle eingeschlossenen Luftblasen unter die Schiebeabdeckungen an den Rand mit einem stumpfen Gegenstand, wie das Ende eines Pinsels. </li></ol></li><li> Legen Sie die Objektträger in einen Bereich weg von Sonnenlicht und lassen Sie sie für 2-3 Tage trocknen. </li><li> Fahren Sie mit dem Aufnehmen von Bildern mit einem Mikroskop und analysieren Sie mit der entsprechenden Software. </li></ol> 7. Bildstapel erwerben <ol><li> Öffnen Sie das Imaging-Programm (siehe Materialtabelle ). Legen Sie die Folie auf die Bühne des Mikroskops. Klicken Sie im Menü oben auf dem Programm auf &quot;Akquisition&quot; und dann auf &quot;Livebild&quot;. </li><li> Stellen Sie das Mikroskop auf 10X. Identifizieren Sie das Neuron der Präferenz und bringen Sie dann den Cursor, der wie ein rotes X erscheint, auf die Mitte des Somas. Klicken Sie mit der linken Maustaste, um den Referenzpunkt zu setzen. </li><li> Stellen Sie das Mikroskop auf 40X. Klicken Sie auf &quot;Verschieben&quot; aus dem Menü am oberen Rand des Programms und klicken Sie dann auf &quot;Zum Referenzpunkt&quot;. </li><li> Beginnen Sie mit dem Erstellen des Bildstapels, indem Sie manuell mit dem feinen Objektiv über dem Gewebe scrollen, bis es etwas unscharf ist. <ol><li> Klicken Sie auf &quot;Set Top&quot; in der rechten unteren Ecke des Programms unter der Überschrift &quot;Image Acquisition&quot;. </li><li> Blättern Sie leicht unter das Gewebe, bis es etwas unscharf ist und klicken Sie dann unter &quot;Bildaufnahme&quot; auf &quot;Set Bottom&quot;. Klicken Sie anschließend auf &quot;Image Stack erwerben&quot;. </li></ol></li><li> Nachdem der Bildstapel erfasst wurde, geben Sie den gewünschten Namen für die Bilddatei in das angezeigte Fenster ein. Speichern als &quot;MBF-Ascii-Datei&quot;. <ol><li> Wenn Sie dazu aufgefordert werden, wählen Sie den Dateityp als &quot;MBF JPEG2000 Stack-Datei&quot; und klicken Sie dann auf &quot;Speichern&quot;. </li></ol></li></ol> 8. Neuronale Verfolgung <ol><li> In der toolbaR unter dem Menü, klicken Sie auf das Feld mit dem Titel &quot;Konturname&quot;. Wählen Sie &quot;Soma&quot; aus dem Dropdown-Menü. </li><li> Manchmal das Soma verfolgen. Dann klicken Sie mit der rechten Maustaste und wählen Sie &quot;Finish Cell Body&quot;, wenn die Ablaufverfolgung abgeschlossen ist. </li><li> Wählen Sie &quot;AutoNeuron&quot;, um einen weiteren Tab mit dem Titel &quot;AutoNeuron Workflow&quot; aufzurufen. </li><li> Wählen Sie unter &quot;Konfigurationstyp&quot; die Option &quot;Neu&quot;. Setzen Sie die Parameter und klicken Sie dann auf &quot;Next Step&quot;, um die Unterposition &quot;Soma Detection&quot; aufzurufen. <ol><li> Um die Parameter einzustellen, wählen Sie &quot;Hellfeld&quot;. Als nächstes klicken Sie unter &quot;Max. Prozessdurchmesser&quot; auf &quot;Messvorgang starten&quot;. Mit dem Cursor auf die Basis des Dendrits gehen und den Durchmesser manuell einstellen. </li></ol></li><li> Klicken Sie auf &quot;Ja&quot; im Fenster, das den Benutzer auffordert, das gesamte Bild zu verfolgen. Manchmal das Soma verfolgen. Unclick und dann auf &quot;Next step&quot; klicken, um die Unterposition &quot;Seed Placement&quot; aufzurufen. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Samen überprüfen&quot;S &quot;und klicken Sie dann auf&quot; Next Step &quot;, um die Unterposition&quot; Neuron Reconstruction &quot;aufzurufen. </li><li> Unter &quot;Neuron&quot; klicken Sie auf &quot;Interaktiv&quot;. Führen Sie eine interaktive Verfolgung durch, indem Sie der Richtung aus dem Programm der Dendriten folgen und mit der rechten Maustaste klicken, um den hervorgehobenen Bereich des Programms zu vervollständigen. Nach dem Tracing alle Dendriten, klicken Sie auf &quot;Next Step&quot;. </li><li> Nachdem ein neues Fenster erscheint, speichern Sie die neue Konfiguration mit einem gewünschten Titel. Klicken Sie auf &quot;Speichern&quot;. </li></ol> 9. Analyse <ol><li> Öffnen Sie das Analyseprogramm (siehe Tabelle der Materialien). </li><li> Klicken Sie im oberen Menü auf &quot;Datei&quot; und dann auf &quot;Datei öffnen&quot;. Wählen Sie die interessante Datei aus. </li><li> Wählen Sie unter der Unterkategorie &quot;Sholl-Analyse&quot;. </li><li> Im Fenster &quot;Sholl-Analyse&quot; den Startradius auf 10 μm einstellen. Klicken Sie unter &quot;Analyse&quot; auf die Felder &quot;Dendrites&quot; und &quot;Branch Orders&quot;. </li><li> Rechts clIck die neu geöffneten Fenster und klicken Sie auf &quot;Excel Export.&quot; Klicken Sie auf &quot;Speichern&quot;. </li><li> Klicken Sie unter der Analyse auf &quot;Verzweigte Strukturanalysen&quot;. Wählen Sie &quot;Alle möglichen Analysen&quot;. </li><li> Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das neu geöffnete Fenster und klicken Sie auf &quot;Excel Export&quot; 24 . </li></ol>

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<li>Kulkarni, V. A., Firestein, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dendritic+tree+and+brain+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The dendritic tree and brain disorders.</a> Mol Cell Neurosci. 50 (1), 10-20 (2012).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Im Vergleich zu moderneren Techniken hat die Golgi-Cox-Methode mehrere Vorteile, die es zur bevorzugten Methode zur Untersuchung der Wirbelsäulenmorphologie machen: 1) Die Färbung kann für im Wesentlichen jedes Gewebe verwendet werden, 2) Ein Grundlichtmikroskop-Setup ist alles, was benötigt wird Erwerben Golgi-basierte Bilder, 3) Die Golgi-Cox-Bildgebung ist schneller als konfokale Bildgebung und 4) Golgi-gefärbte Abschnitte sind für mehrere Monate bis Jahre länger als Proben, die fluoreszenzmarkiert sind, lebensfähig....

<html> Dendriten sind der größte Teil der Neuronen, die den präsynaptischen Eingang empfangen und verarbeiten 1 . Ihre dendritischen Prozesse haben eine komplexe Geometrie, wo die proximalen Zweige einen größeren Durchmesser haben als die distalen Zweige. Da Dendriten sich entwickeln, bilden sie mehrere Verbindungen mit anderen Neuronen in einem Prozess, der als dendritische Arborisierung bezeichnet wird. Das Ausmaß und Muster dieser Verzweigung bestimmt die Menge der synaptischen Eingaben, die ein Dendrit adäquat verarbeiten kann 2 . Dendritische Arborisierung ist ein notwendiger Prozess für die aktivitätsabhängige Plastizität und die richtige Entwicklung von neuronalen Schaltungen. Extension, Retraktion, Verzweigung und Synaptogenese sind komplizierte Prozesse, die intrinsische genetische Programme und Einflüsse aus extrinsischen Faktoren beinhalten. Die morphologischen und verzweigten Variationen der neuronalen Dendriten innerhalb des Hippocampus sind in die Erkenntnis- und Gedächtnisbildung verwickeltF &quot;&gt; 3 , 4. Die Veränderungen der dendritischen Komplexität sind mit pathophysiologischen und Verhaltensänderungen verbunden 5. Anomalien beziehen sich auf mehrere Krankheitszustände, darunter zerbrechliches X-Syndrom und Down-Syndrom 6 . Dendritische Stacheln sind die spezialisierten subzellulären Kompartimente der dendritischen Dorn, die exzitatorische Eingaben im zentralen Nervensystem erhalten. Es gibt drei morphologische Klassen von dendritischen Stacheln, wobei der Name jeder Klasse auf ihrer Größe und Form basiert: 1) Pilzstacheln, die komplexe postsynaptische Dichten mit mehr Glutamatrezeptoren haben als andere Stacheln 7 ; 2) Stubby Stacheln, denen ein Stamm fehlt; Und 3) dünne Stacheln, die aus einem langwierigen, schmalen Stamm und einem Kugelkopf bestehen 8 . Das dendritische Wirbelsäulenvolumen wird teilweise verwendet, um sie zu definieren, wobei dünne Stacheln im allgemeinen kleiner sind (0,01 μm 3 </sup&gt;) Im Vergleich zu Pilzstacheln (0,8 μm 3 ) 9 , 10 . Die Stacheln stabilisieren sich mit Reifung. Zum Beispiel ziehen sich die dünnen Stacheln nach einigen Tagen zurück oder entwickeln sich zu Pilzstacheln. Alternativ sind die Pilzstacheln relativ stabil und können über einen längeren Zeitraum überleben. Die Stärke der neuronalen Verbindungen beruht auf der Anzahl der Stacheln und / oder deren Volumen 11 , 12 , 13 . Die klassische Golgi-Färbemethode und ihre moderneren Variationen sind alle für die Untersuchung der dendritischen Wirbelsäulenmorphologie und -dichte nützlich gewesen. Ein einzigartiger Aspekt der Golgi-Färbung ist, dass es zufällig etwa 5% der gesamten Neuronen, die für die Verfolgung der einzelnen Neuronen 14 , 15 erlaubt. Obwohl der genaue Mechanismus, in dem die Golgi MethOd stains einzelne Neuronen ist noch unbekannt, das Prinzip des Verfahrens basiert auf der Kristallisation von Silberchromat (Ag 2 CrO 4 ) 16 , 17 . Es gibt drei Haupttypen der Golgi-Methode: den schnellen Golgi, den Golgi-Cox und den Golgi-Kopsch 18 , 19 . Alle drei Methoden beginnen mit einer anfänglichen Inkubationsphase in Chromsalzen für mehrere Tage bis Monate, aber es gibt bestimmte wichtige Unterschiede zwischen ihnen. Der schnelle Golgi nutzt Osmiumtetroxid im ersten Schritt, während der Golgi-Kopsch Paraformaldehyd enthält. Die Färbung sowohl im Rapid-Golgi als auch im Golgi-Kopsch folgt eine Inkubation in einer 1-2% Silbernitratlösung für etwa 7 Tage. Die Golgi-Cox-Methode verwendet Quecksilberchlorid und Kaliumdichromat anstelle von Silbernitrat und hat eine Imprägnierungszeit von 2-4 Wochen. Die Gewebe werden dann geschnitten und schnell in ein verdünntes Ammoniak gegebenLösung, gefolgt von einem fotografischen Fixierer, um Salze zu entfernen. Von den drei Typen wird die Golgi-Cox-Methode als am besten angesehen, um die dendritischen Dorn ohne große Hintergrundinterferenz zu färben, zum Teil weil die Kristallartefakte nicht auf der Oberfläche des Gewebes auftreten (anders als bei der schnellen Golgi-Methode) 17 , 20 , 21 . Die vorliegende Methode ist eine leichte Variation des Protokolls, das mit einem kommerziellen Golgi-Färbe-Kit versehen ist, und wurde entworfen, um zu beurteilen, wie eine relativ niedrige Dosis des 5-Fu die dendritischen morphologischen Eigenschaften und die Wirbelsäuredichte beeinflussen würde. Alle gewonnenen Daten könnten einen weiteren Einblick geben, wie sich die chemotherapeutische Behandlung auf die neuronale Schaltung auswirkt.

<table><tbody><tr><td>superGolgi Bausatz&nbsp;</td><td>Bioenno Lifesciences</td><td>30100</td><td>&nbsp; Enthält gefährliche Stoffe.</td></tr><tr><td>PBS 10x Pulverkonzentrat</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>BP665-1</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Permount&nbsp;</td><td>Fischer&nbsp;</td><td>SP 15-100</td><td></td></tr><tr><td>Schiebedeckel&nbsp;</td><td>Fischer&nbsp;</td><td>12-546-14</td><td></td></tr><tr><td>7 mL Transferpipette&nbsp;</td><td>Globe Scientific&nbsp;</td><td>135030</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Falcon Röhrchen&nbsp;</td><td>BD Biowissenschaften&nbsp;</td><td></td><td></td>352099</tr><tr><td>Folie&nbsp;</td><td>Fischer&nbsp;</td><td>01-213-105</td><td></td></tr><tr><td>12-Well-Platte&nbsp;</td><td>BD Biowissenschaften&nbsp;</td><td></td><td></td>353043</tr><tr><td>200 Proof Ethanol&nbsp;</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Xylol&nbsp;</td><td>Acros Organics&nbsp;</td><td>1330-20-7</td><td>Gefährlich.&nbsp;</td></tr><tr><td>Permabond 200</td><td>Permabond LLC</td><td>GF2492</td><td></td></tr><tr><td>25 mL serologische Pipette</td><td>Sigma</td><td>SIAL1489</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Midsci</td><td>HS234526C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Vibratom&nbsp;</td><td>World Precision Instruments&nbsp;</td><td>NVSLM1</td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6 männliche Mäuse&nbsp;</td><td>Das Jackson Laboratory&nbsp;</td><td></td><td></td>000664</tr><tr><td>Axio Imager 2</td><td>ZEISS</td><td>Mehrere Komponenten, weitere Informationen finden Sie auf der Website.</td><td></td></tr><tr><td>AxioCam MRc Kamera</td><td>ZEISS</td><td>426508-9902-000</td><td></td></tr><tr><td>Färbeschale, grün</td><td>Tissue-Tek</td><td>62541-12</td><td></td></tr><tr><td>Färbeschalen-Set&nbsp;</td><td>Elektronenmikroskopische Wissenschaften&nbsp;</td><td>70312-20</td><td></td></tr><tr><td>Motorisierter Pipettenfüller</td><td>Fischer&nbsp;</td><td>03-692-168</td><td></td></tr><tr><td>Neurolucida&nbsp;</td><td>mbf Biowissenschaften&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neurolucida Entdecker&nbsp;</td><td>mbf Biowissenschaften&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prisma&nbsp;</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bewertung der hippocampalen dendritischen komplexität bei gealterten mäusen unter verwendung der golgi-cox-methode

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Dendritische Stacheln sind die Ausstülpungen aus den neuronalen dendritischen Schächten, die exzitatorische Synapsen enthalten. Die morphologischen und verzweigten Variationen der neuronalen Dendriten innerhalb des Hippocampus sind in die Erkenntnis- und Gedächtnisbildung verwickelt. Es gibt mehrere Ansätze zur Golgi-Färbung, die alle für die Bestimmung der morphologischen Eigenschaften der dendritischen Lauben nützlich waren und einen klaren Hintergrund hervorbringen. Die vorliegende Golgi-Cox-Methode (eine leichte Variation des Protokolls, die mit einem kommerziellen Golgi-Färbe-Kit versehen ist) wurde entworfen, um zu beurteilen, wie eine relativ niedrige Dosis des chemotherapeutischen Arzneimittels 5-Flurouracil (5-Fu) die dendritische Morphologie beeinflussen würde , Die Anzahl der Stacheln und die Komplexität der Arborisierung im Hippocampus. Die 5-Fu modulierten die dendritische Komplexität signifikant und reduzierten die Wirbelsäulendichte im gesamten Hippocampus regionalspezifisch. Die dargestellten Daten zeigen, dass die Golgi-Färbemethode efDie fälligen Neuronen in der CA1, dem CA3 und dem Dentat Gyrus (DG) des Hippocampus fungiert. Dieses Protokoll berichtet die Details für jeden Schritt, so dass andere Forscher können zuverlässig Flecken Gewebe im gesamten Gehirn mit qualitativ hochwertigen Ergebnissen und minimale Fehlersuche.

Die Effekte der 5-Fu-Behandlung auf die dendritische Arborisierung und Komplexität im Hippocampus von Golgi-gefärbten Gehirnabschnitten wurden mit einer handelsüblichen Imaging-Software quantifiziert und verfolgt. Nach der Verfolgung wurden die dendritische Arborisierung, die Wirbelsäulendichte und die Wirbelsäulenmorphologie unter Verwendung der Sholl-Analyse und des dendritischen Komplexitätsindex (DCI) analysiert. Sholl-Analyse ist eine quantitative analytische Methode, die verwendet ...

Hier stellen wir ein Golgi-Cox-Protokoll ausführlich vor. Diese zuverlässige Gewebe-Fleck-Methode ermöglicht eine qualitativ hochwertige Beurteilung der Cytoarchitektur im Hippocampus und im gesamten Gehirn mit minimaler Fehlersuche.

Bewertung der Hippocampalen Dendritischen Komplexität bei gealterten Mäusen unter Verwendung der Golgi-Cox-Methode

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methodik besteht darin, Gehirngewebe korrekt nach Golgi zu färben, um die dendritische Morphologie und Komplexität zu untersuchen und zu quantifizieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Neurowissenschaft zu beantworten. Da die Golgi-Färbung nur eine kleine Teilmenge von Zellen anfärbt, eignet sich diese Technik zur Rekonstruktion der Neuronenstruktur. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Gehirnschnitte leicht gefärbt werden können, ohne dass sie während der Waschschritte austrocknen oder abfallen könnten. Die Durchführung des Verfahrens wird Fred Kiffer, Tyler Alexander und Julie Anderson, Doktoranden im Labor von Dr. Allen, demonstrieren. Beginnen Sie damit, frisch entnommene, ungefeste halbe Nagetiergehirne in fünf Milliliter einer Quecksilberchlorid-basierten Lösung einzutauchen.Da die Quecksilber(II)-chloridl&ouml;sung lichtempfindlich ist, decken Sie das R&ouml;hrchen mit Folie ab. Bewahren Sie die Proben bei Raumtemperatur im Dunkeln auf. Am n&auml;chsten Tag gie&szlig;en Sie die L&ouml;sung langsam in einen vor&uuml;bergehenden Beh&auml;lter, bevor Sie sie ordnungsgem&auml;&szlig; im Bioabfallbeh&auml;lter entsorgen.Geben Sie fünf Milliliter frische Quecksilberchloridlösung hinzu und stellen Sie sicher, dass die Gehirne vollständig bedeckt sind. Stellen Sie die Proben erneut 13 weitere Tage lang bei Raumtemperatur im Dunkeln auf. Bereiten Sie nach 14 Tagen den Postimprägnierungspuffer zu, indem Sie 30 Gramm pulverförmigen Postimprägnierungspuffer zu 90 Milliliter destilliertem oder entionisiertem Wasser, DH2O, hinzufügen.Füllen Sie jedes Loch der 6-Loch-Platte mit 6,5 Milliliter Puffer nach der Imprägnierung, ein Loch pro Gehirn. Entfernen Sie dann die Quecksilberchloridlösung wie zuvor aus dem Gehirngewebe. Spülen Sie das Gewebe mit DH2O und überführen Sie es anschließend in die 6-Loch-Platten mit Puffer nach der Imprägnierung.Bedecken Sie die Platten mit Folie und lagern Sie sie bei Raumtemperatur im Dunkeln. Am nächsten Tag saugen Sie den Puffer nach der Imprägnierung ab und ersetzen ihn. Bedecken Sie die Platte erneut und lagern Sie sie im Kühlschrank bei vier Grad Celsius.Bereiten Sie zwei oder drei 12-Loch-Platten pro Gehirn vor, indem Sie die Platten auf ihren Deckeln von links nach rechts und von oben nach unten mit aufsteigenden Zahlen beschriften. Fügen Sie die Identifikationsnummer des geschnittenen Gehirns hinzu. Pipettieren Sie zwei Milliliter 1X PBS in jedes Loch jeder Platte und richten Sie anschließend das Präparat ein, bevor Sie das Vibratom einschalten.Dann Klebeband auf den Gewebeklotz des Probenträgers geben und etwas Cyanacrylat-Kleber darauf auftragen. Entfernen Sie ein Gehirn aus der 6-Loch-Platte und legen Sie es auf eine Plastik- oder Glasunterlage. Schneiden Sie das Kleinhirn kaudal mit einer beidseitig geschliffenen Klinge aus rostfreiem Stahl ab und achten Sie darauf, dass der verbleibende Teil des Kleinhirns am Gehirn flach ist.Danach die flache Oberfläche des verbleibenden Kleinhirns auf den Kleber legen. Nachdem der Kleber getrocknet ist, den Probenträger mit dem Gewebe in das Präparatbad stellen. Das Präparatbad auf das Vibratom legen und die Gewebeprobe mit PBS bedecken.Danach die Klinge am Klingenhalter des Vibratoms befestigen und die Klinge langsam in das Präparatbad absenken, bis sie vollständig untergetaucht und leicht unterhalb der Oberseite des Gewebes liegt. Anschließend die Vibratomgeschwindigkeit auf sieben, die Amplitude auf sechs und den Schneidwinkel auf 12 Grad einstellen. Die Vibration starten und 200-Mikrometer-Schnitte anfertigen.Verwenden Sie einen großen Pinsel, um die Gewebeschnitte aus dem Präparatbad in die jeweils vorgesehenen Vertiefungen der 12-Loch-Platte zu überführen. Setzen Sie das Schneiden des Gewebes fort, bis die gewünschte Anzahl an Gewebeschnitten erreicht ist. Nach dem Schneiden aspirieren Sie mit einer Transferpipette das PBS aus den Vertiefungen der 12-Loch-Platte und geben anschließend zwei Milliliter PBS-T hinzu. Waschen Sie 30 Minuten unter Schütteln.Gegen Ende der Waschphase drei Teile Ammoniumhydroxidlösung mit fünf Teilen DH2O verdünnen. Anschließend, nach dem Entfernen des PBS-T, die verdünnte Ammoniumhydroxidlösung hinzufügen. Vor Licht durch Folie schützen und die Schnitte 19 bis 21 Minuten lang einfärben.Danach, nachdem die Ammoniumhydroxidlösung sicher entfernt wurde, Post-Färbepuffer hinzufügen. Mit Folie abdecken und weitere 19 bis 21 Minuten färben. Abschließend die Schnitte dreimal für jeweils fünf bis 10 Minuten in PBS-T spülen.Montieren Sie die Schnitte mit dem großen Pinsel auf mit 1 % Gelatine beschichteten Objektträgern. Lassen Sie sie 20 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur trocknen, anschließend über Nacht in ein Coplin-Gefäß stellen. Entfernen Sie die Objektträger aus dem Coplin-Gefäß und stellen Sie sie in einen Kunststoffhalter im Abzug. Legen Sie die Schnitte fünf Minuten lang in eine Färbeschale mit 100 % Ethanol. Dehydrieren Sie die Schnitte durch zwei weitere fünfundzwanzigminütige Ethanol-Waschungen. Anschließend legen Sie die Objektträger in ein Glasgestell und verwenden einen Metallgriff, um das Gestell in eine Glasfärbeschale mit 99 % Xylol abzusenken.Die Objektträger zweimal für jeweils fünf Minuten in Xylol waschen. Nach Ablauf der Zeit für die zweite Wäsche die Objektträger nacheinander aus dem Xylol nehmen und das Gewebe schnell mit etwa 0,25 Milliliter Einbettmedium bedecken. Danach ein Deckglas nehmen und es über das Medium legen.Drücken Sie eingeschlossene Luftblasen mit einem stumpfen Gegenstand, wie zum Beispiel dem Ende eines Pinsels, unter die Deckgläser zum Rand hin. Stellen Sie die Objektträger an einen Ort außerhalb direkter Sonneneinstrahlung und lassen Sie sie zwei bis drei Tage lang trocknen. Nach dem Trocknen fahren Sie mit der Bildaufnahme mithilfe eines Mikroskops und der Analyse mit der geeigneten Software fort.Dieses Hellfeldbild zeigt ein Golgi-gefärbtes Neuron, das die Kriterien für die Bildgebung und weitere Analysen erfüllt. Alle drei Dornentypen sind leicht erkennbar. Die Färbung ist über die gesamte Länge des Dendriten hinweg gleichmäßig, und der Dendrit ist von anderen Neuronen isoliert.Diese Abbildung zeigt, dass Golgi-gefärbte Neuronen im Gyrus dentatus nach Behandlung mit 5-Fluorouracil im Vergleich zur Saline-behandelten Gruppe eine verminderte Länge in der vierten und sechsten Ordnung aufwiesen. Mithilfe der Golgi-Färbung können signifikante Unterschiede in der Dornendichte nachgewiesen werden. In den apikalen pyramidalförmigen Dendriten des CA1 führte die Verabreichung von 5-Fluorouracil bei lebenden Mäusen zu einer signifikanten Abnahme der Dornendichte.In den basalen Dendriten gab es keine signifikanten Veränderungen in der Gesamtdichte der Dornfortsätze. Die Sholl-Analyse der apikalen pyramidalen Dendriten des CA1 zeigte, dass die Behandlung mit 5-Fluorouracil die dendritische Verzweigung signifikant verringerte, und zwar in Abständen zwischen 40 und 160 Mikrometern vom Soma. In den basalen Dendriten verringerte die Behandlung mit 5-Fluorouracil die dendritische Verzweigung in Abständen von 30 bis 110 Mikrometern vom Soma.Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie – einschließlich des Golgi-Färbeprozesses sowie des Montierens, Reinigens und Abdeckens – bei korrekter Durchführung pro Gehirn innerhalb von drei Stunden durchgeführt werden. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg dafür, dass Forscher im Bereich der Neurobiologie neuroanatomische Verbindungen in einem murinen Modell untersuchen konnten. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Schnitte nur 19 bis 21 Minuten lang in Ammoniumhydroxidlösung zu belassen, um eine Überfärbung der Neuronen zu vermeiden.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Gehirngewebe ordnungsgemäß anfärbt, einschneidet und spült. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit der auf Quecksilberchlorid basierenden Lösung, Ammoniumhydroxidlösung und Xylol äußerst gefährlich sein kann. Daher sollten Sie Vorsichtsmaßnahmen treffen, Laborschutzhandschuhe tragen und die Prozedur in einem Abzug durchführen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Ein Dissektionstechnik zur Entfernung des Gyrus dentatus aus adulten Maus unter einem Stereomikroskop wurde in diesem Video aufgezeichnet Protokoll demonstriert.

Dissection der hippocampalen von erwachsenen Maus

Dieser Artikel beschreibt Verfahren zur Herstellung von Schnitten des Hippocampus von Ratten und transgenen Mäusen für die Untersuchung der synaptischen Veränderungen mit Gehirn Altern und altersbedingte neurodegenerative Erkrankungen wie Alzheimer-Krankheit.

Vorbereitung der akuten Schnitten des Hippocampus von Ratten und transgenen Mäusen für das Studium der Synaptic Veränderungen während des Alterns und Amyloid-Pathologie

Dieser Beitrag beschreibt die Verfahren für die taktile Stimulation von Rattenjungen und anschließende Golgi-Cox-Färbung der neuronalen Morphologie. Taktile Stimulation ist eine positive Erfahrung, die in der Perinatalperiode durch Streicheln Welpen mit einem Haushalts duster verwaltet wird. Golgi-Färbung cox ist ein zuverlässiges Verfahren ermöglicht die Visualisierung der gesamten Neuronen.

Visualisierung der Auswirkungen einer Früh Positive Erfahrung, taktile Stimulation, auf dendritischen Morphologie und synaptische Verbindungen mit Golgi-Cox Färbung

Wir beschreiben zwei Methoden zur Visualisierung und Quantifizierung der dendritischen Arborisierung im Hippocampus von Mausmodellen: Echtzeit- und erweiterte Tiefenschärfebildgebung. Während die erste Methode eine ausgefeilte topographische Verfolgung und Quantifizierung des Ausmaßes der Verzweigung ermöglicht, ermöglicht die zweite eine schnelle Visualisierung des dendritischen Baumes.

Bewertung der dendritischen Verzweigung im Gyrus dentatus des Hippocampus-Region an der Maus

Wir präsentieren ein Protokoll der Golgi-Cox-Färbung in dicken Hirnschnitten für die Verwendung, um Neuronen mit langen Dendritenbäume innerhalb einzelner Gewebeproben enthalten ist, zu visualisieren. Zwei Varianten dieses Protokolls werden auch vorgestellt, Kresylviolett Gegenfärbung einzubeziehen und das Einfrieren von nicht verarbeiteten Gehirne für die Langzeitlagerung.

Imaging Neurone innerhalb Dickhirnschnitten Mit der Golgi-Cox-Methode

Ein Protokoll für die präzise Identifizierung und Analyse von Synapsen im Hippokampus Scheiben mit Immunfluoreszenz ist in diesem Artikel beschrieben.

Bewertung der Synapse Dichte im Hippokampus Nagetier Gehirnscheiben

Das Ziel dieses Protokolls ist es, einen Ansatz zur Analyse des Verhaltens von adulten neuronalen Stamm-/Vorläuferzellen als Reaktion auf die chemogenetische Manipulation eines bestimmten lokalen neuronalen Schaltkreises zu beschreiben.

Assaying Circuit Spezifische Regulation von adulthippocampal neuralen Vorläuferzellen

Dies ist ein Protokoll zur akuten Scheibenpräparation von erwachsenen und alternden Maus Hippocampi, die Vorteile der transkardialen Perfusion und Schneiden schneiden mit eiskalten NMDG-aCSF nutzt, um hypoxische Schäden am Gewebe zu reduzieren. Die resultierenden Scheiben bleiben über viele Stunden gesund und eignen sich für Langzeit-Patch-Clamp- und Field-Recordings.

Minimierung der Hypoxie in Hippocampal Scheiben von erwachsenen und alternden Mäusen

Wir stellen ein Protokoll zur Vorbereitung von Akutscheiben aus dem dorsal-zwischengeschalteten Hippocampus von Mäusen vor. Wir vergleichen dieses transversale Präparat mit koronalen Schnitten in Bezug auf die Qualität der Aufnahmen und die Erhaltung morphologischer Merkmale aufgezeichneter Neuronen.

Vorbereitung von akuten Scheiben aus dem Dorsal Hippocampus für die Ganzzellaufnahme und neuronale Rekonstruktion im Dentate Gyrus von erwachsenen Mäusen

Das Protokoll beschreibt eine Modifikation der schnellen Golgi-Methode, die an jeden Teil des Nervensystems angepasst werden kann, zur Färbung von Neuronen im Hippocampus und im medialen präfrontalen Kortex der Ratte.

Schneller Golgi-Fleck für die Visualisierung der dendritischen Wirbelsäule im Hippocampus und im präfrontalen Kortex

Erfahren Sie die Golgi-Cox-Färbung zur Analyse dendritischer Morphologie und Komplexität im Hippocampus gealterter Mäuse. Diese Methode ermöglicht präzise neuronale Strukturuntersuchungen ohne Gewebeschäden.

Bewertung der Hippocampalen Dendritischen Komplexität bei gealterten Mäusen unter Verwendung der Golgi-Cox-Methode

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