Bewertung der Hippocampalen Dendritischen Komplexität bei gealterten Mäusen unter Verwendung der Golgi-Cox-Methode

Das übergeordnete Ziel dieser Methodik ist es, Hirngewebe richtig zu färben, um die dendritische Morphologie und Komplexität zu untersuchen und zu quantifizieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Neurowissenschaften zu beantworten. Da die Golgi-Färbung nur eine kleine Untergruppe von Zellen färbt, könnte diese Technik verwendet werden, um die Struktur von Neuronen zu verfolgen.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Gehirnabschnitte leicht verfärbt werden können, ohne dass die Gefahr besteht, dass sie während eines der Waschschritte austrocknen oder abfallen. Das Verfahren wird von Fred Kiffer, Tyler Alexander und Julie Anderson, Doktoranden in Dr. Allens Labor, vorgeführt. Beginnen Sie damit, frisch geerntete, nicht fixierte Nagetierhälften in fünf Milliliter oder Quecksilberchlorid Lösung zu tauchen.

Da Quecksilberchloridlösung lichtempfindlich ist, decken Sie die Tube mit Folie ab. Lagern Sie die Proben im Dunkeln bei Raumtemperatur. Am nächsten Tag die Lösung langsam in einen provisorischen Behälter umfüllen, bevor Sie sie ordnungsgemäß in einem Behälter für biologisch gefährliche Abfälle entsorgen.

Fügen Sie fünf Milliliter frische Quecksilberchloridlösung hinzu und stellen Sie sicher, dass das Gehirn eingetaucht wird. Bringen Sie die Proben für weitere 13 Tage bei Raumtemperatur ins Dunkel. Bereiten Sie nach 14 Tagen einen Nachimprägnierpuffer vor, indem Sie 30 Gramm elektrischen Nachimprägnierpuffer zu 90 Millilitern destilliertem oder deionisiertem Wasser, DH2O, hinzufügen.

Füllen Sie jede Vertiefung der Sechs-Well-Platte mit 6,5 Millilitern des Nachimprägnierpuffers, eine Vertiefung pro Gehirn. Entfernen Sie dann wie zuvor die Quecksilberchloridlösung aus dem Hirngewebe. Spülen Sie das Gewebe mit DH2O und übertragen Sie das Gewebe dann mit Nachimprägnierpuffer auf die Sechs-Well-Platten.

Decken Sie die Teller mit Folie ab und lagern Sie sie bei Raumtemperatur im Dunkeln. Am nächsten Tag den Nachimprägnierpuffer ansaugen und austauschen. Decken Sie den Teller wieder ab und bewahren Sie ihn in einem Kühlschrank bei vier Grad Celsius auf.

Bereiten Sie zwei oder drei 12-Well-Platten pro Gehirn vor, indem Sie zuerst die Platten auf ihren Deckeln mit Zahlen in aufsteigender Reihenfolge von links nach rechts und von oben nach unten beschriften. Fügen Sie die Identifikationsnummer des geschnittenen Gehirns hinzu. Pipettieren Sie zwei Milliliter 1X PBS in jede Vertiefung jeder Platte, richten Sie dann den Tisch ein und schalten Sie das Vibratom ein.

Kleben Sie dann Klebeband auf den Gewebeblock des Probenhalters und geben Sie etwas Cyanacrylatkleber darauf. Nehmen Sie ein Gehirn aus der Sechs-Well-Platte und legen Sie es auf eine Plastik- oder Glasschale. Verwende eine zweischneidige Klinge aus rostfreiem Stahl, um das Kleinhirn kaudal zu schneiden, und achte darauf, dass der Teil des Kleinhirns, der auf dem Gehirn verbleibt, flach ist.

Lege dann die flache Fläche des restlichen Kleinhirns auf den Kleber. Nachdem der Kleber getrocknet ist, legen Sie den Probenhalter mit dem Taschentuch in das Probenbad. Legen Sie das Probenbad auf das Vibratom und decken Sie die Gewebeprobe mit PBS ab.

Befestigen Sie dann die Klinge an der Klingenhalterung des Vibratoms und senken Sie die Klinge langsam in das Probenbad ab, bis sie vollständig untergetaucht und leicht unter der Oberseite des Gewebes liegt. Stellen Sie als Nächstes die Schwingungsgeschwindigkeit auf sieben, die Amplitude auf sechs und den Schnittwinkel auf 12 Grad ein. Starten Sie die Vibration und schneiden Sie 200-Mikron-Abschnitte.

Schieben Sie die Gewebeschnitte mit einem großen Pinsel aus dem Probenbad in jede dafür vorgesehene Vertiefung der 12-Well-Platten. Schneiden Sie das Gewebe weiter, bis die gewünschte Anzahl an Gewebeschnitten erreicht ist. Verwenden Sie nach dem Schneiden eine Transferpipette, um das PBS aus den Vertiefungen der 12-Well-Platte zu aspirieren, fügen Sie dann zwei Milliliter PBS-T hinzu und waschen Sie es 30 Minuten lang unter Rühren.

Gegen Ende der Waschperiode drei Teile Ammoniumhydroxidlösung mit fünf Teilen DH2O verdünnen. Fügen Sie dann, nachdem Sie das PBS-T entfernt haben, die verdünnte Ammoniumhydroxidlösung hinzu. Mit Folie vor Licht schützen und die Abschnitte 19 bis 21 Minuten lang beizen.

Dann, nachdem Sie die Ammoniumhydroxidlösung sicher entfernt haben, fügen Sie Puffer nach der Färbung hinzu. Mit Folie und Beizen weitere 19 bis 21 Minuten schützen. Spülen Sie abschließend die Abschnitte in PBS-T dreimal für jeweils fünf bis 10 Minuten aus.

Montieren Sie die Abschnitte mit dem großen Pinsel auf 1%ige gelatinebeschichtete Objektträger. Lassen Sie sie 20 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur trocknen, geben Sie sie dann in ein Coplin-Glas und lassen Sie sie über Nacht stehen. Nehmen Sie die Objektträger aus dem Coplin Jar und legen Sie sie in ein Plastikgestell in den Abzug.

In eine Färbeschale mit 100 % Ethanol für fünf Minuten geben. Dehydrieren Sie die Abschnitte durch zwei weitere fünfminütige Ethanolwäschen. Legen Sie als Nächstes die Objektträger in ein Glasgestell und verwenden Sie einen Metallgriff, um das Gestell in eine Glasfärbeschale mit 99 % Xylol abzusenken.

Waschen Sie die Objektträger in zwei Wechseln Xylol für jeweils fünf Minuten. Nachdem die Zeit für die zweite Wäsche abgelaufen ist, entfernen Sie die Objektträger nacheinander aus dem Xylol und bedecken Sie das Gewebe schnell mit ca. 0,25 Millilitern Einbettmedien. Nehmen Sie als Nächstes eine Diaabdeckung und legen Sie sie über das Medium.

Schieben Sie eingeschlossene Luftblasen unter den Diaabdeckungen mit einem stumpfen Gegenstand, z. B. dem Ende des Pinsels, an den Rand. Stellen Sie die Objektträger an einen Ort ohne direkte Sonneneinstrahlung und lassen Sie sie zwei bis drei Tage trocknen. Nach dem Trocknen fahren Sie mit der Bildaufnahme mit einem Mikroskop und der Analyse mit der entsprechenden Software fort.

Dieses Hellfeldbild zeigt ein Golgi-gefärbtes Neuron, das die Kriterien für die Bildgebung und weitere Analyse erfüllt. Alle drei Wirbelsäulentypen sind gut zu erkennen. Die Färbung ist über die gesamte Länge des Dendriten konsistent und der Dendrit wird von anderen Neuronen isoliert.

Diese Abbildung zeigt, dass die Golgi-gefärbten Neuronen im Gyrus dentatus nach der Behandlung mit 5-Fluorouracil im Vergleich zur mit Kochsalzlösung behandelten Gruppe eine verringerte Länge vierter und sechster Ordnung aufwiesen. Die Golgi-Färbung kann verwendet werden, um signifikante Unterschiede in der Dichte der Wirbelsäule zu erkennen. In den apikalen pyramidalen Dendriten CA1 verringerte die Verabreichung von 5-Fluorouracil an lebende Mäuse signifikant die Dichte der Wirbelsäule.

In den basalen Dendriten gab es keine signifikanten Veränderungen in der Gesamtdichte der Stacheln. Die Shull-Analyse von CA1-apikalen pyramidalen Dendriten zeigte, dass die Behandlung mit 5-Fluorouracil die dendritische Arborisierung in Abständen zwischen 40 und 160 Mikrometern vom Soma signifikant verringerte. In den basalen Dendriten verringerte die 5-Fluorouracil-Behandlung die dendritische Arborisation in einem Abstand von 30 bis 110 Mikrometern vom Soma.

Einmal gemeistert, kann diese Technik, die sowohl den Golgi-Färbeprozess als auch das Montieren, Reinigen und Abdecken berücksichtigt, bei richtiger Durchführung in drei Stunden pro Gehirn durchgeführt werden. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Neurobiologie den Weg, um neuroanatomische Zusammenhänge in einem Mausmodell zu erforschen. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Schnitte nur 19 bis 21 Minuten in Ammoniumhydroxidlösung aufzubewahren, um die Neuronen nicht zu überfärben.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Gehirngewebe richtig färbt, schneidet und spült. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit der auf Quecksilberchlorid basierenden Lösung, der Ammoniumhydroxidlösung und Xylol äußerst gefährlich sein kann, also treffen Sie Vorsichtsmaßnahmen und tragen Sie Laborhandschuhe und arbeiten Sie in einem Abzug, wenn Sie dieses Verfahren durchführen.