Name: Imaging Neurone innerhalb Dickhirnschnitten Mit der Golgi-Cox-Methode (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Lernen Sie die Golgi-Cox-Färbung zur Visualisierung von Neuronen mit langen dendritischen Bäumen in dicken Gehirnschnitten. Diese Methode ermöglicht die detaillierte Analyse neuronaler Morphologie im Nagetiergehirn.

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Diese Arbeit wurde von einem Discovery-Grant CDCB aus den Natur- und Ingenieurwissenschaften Research Council of Canada (NSERC) unterstützt, ein John R. Evans Leaders Fund Forschungsinfrastruktur Zuschuss CDCB aus Kanada Foundation for Innovation (CFI Projektnummer 30381) und durch eine Entdeckung Grant NJM von NSERC. ELL wurde von einem Ontario Graduate Scholarship und von einem OVC Stipendium des Ontario Veterinary College an der University of Guelph unterstützt. CDS wurde durch einen Bachelor-Student Aspirantur von NSERC unterstützt. ALM wurde von einem Alexander Graham Bell Stipendium NSERC und von einem OVC Stipendium des Ontario Veterinary College an der University of Guelph unterstützt.

Erwachsene weibliche CD1-Stamm-Mäuse wurden in dieser Studie verwendet. Ähnliche Färbung kann unter Verwendung beider Geschlechter in verschiedenen Altersstufen durchgeführt werden. Versuchstiere wurden nach den Grundsätzen und Richtlinien des Canadian Council on Animal Care betreut, und das experimentelle Protokoll wurde von der University of Guelph Animal Care Committee genehmigt. 1. Golgi-Cox Staining <ol><li> Golgi-Cox Imprägnierung von Brains <ol><li> Macht die Golgi-Cox Lösung von 1% (w / v) Kaliumdichromat, 0,8% (w / v) Kaliumchromat und 1% (w / v) Quecksilberchlorid durch das Kaliumdichromat Auflösen und Kaliumchromat in hochwertiges Wasser separat . Mischen Sie die Lösungen, fügen Sie das Quecksilberchlorid und filtern die endgültige Lösung unter Verwendung von Grad 1 Filterpapier. Bewahren Sie die Lösung im Dunkeln für bis zu einem Monat. </li><li> Betäuben die Maus mit 5% Isofluran. </li><li> Euthanize die Maus durch Enthauptung und schnell das Gehirn entfernen. </li><li> Legen Sie das Gehirn in ein 20 ml Glasszintillationsröhrchen mit 17 ml Golgi-Cox-Lösung und Inkubieren im Dunkeln bei RT 25 d. </li><li> Cryoprotect das Gehirn, indem es in ein konisches 50 ml-Röhrchen mit 40 ml Saccharose Kryoprotektivum (30% (w / v) Sucrose in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,4) im Dunkeln bei 4 ° C für 24 h platziert. HINWEIS: Die folgenden optionalen drei Schritte als Alternative zum Hauptprotokoll verwendet werden können, um das Gehirn in dieser Phase für die langfristige Lagerung einfrieren. </li><li> Frieren Sie das ganze Gehirn, indem es in 200 ml Isopentan getaucht, das auf Trockeneis vorgekühlt wurde. </li><li> Das tiefgefrorene Gehirn in ein 50 ml konischen Röhrchen und speichert im Dunkel bei -80 ° C. </li><li> Wenn bereit zu gehen, aufzutauen, das Gehirn, indem es in ein konisches 50 ml-Röhrchen mit 40 ml Saccharose Kryoschutzmittels im Dunkeln bei 4 ° C für 24 h platziert. </li></ol></li><li> Gehirn Sectioning <ol><li> Entfernen Sie das Gehirn aus dem Saccharose und block es zum Schneiden durch das Kleinhirn mit einer Rasierklinge abgeschnitten und eine flache Kante an dem verbleibenden kaudalen Ende des Gehirns zu verlassen. </li><li> Wärme-Agar (3% (w / v) in Wasser), bis sie geschmolzen und abkühlen lassen, bis sie geringfügig über seinem Schmelzpunkt liegt. </li><li> Legen Sie das Gehirn in einem kleinen Einweg wiegt Gericht mit seinen Schwanzende bedruckten Seite nach unten und fügen Sie eine ausreichende Menge an geschmolzenem Agar, das Gehirn zu decken. </li><li> Sobald der Agar sich verfestigt hat, Überschüssiges Agar verlassen etwa 2 bis 4 mm um das Gehirn und das Gehirn auf die Bühne eines Vibratom mit seinem caudalen Ende der Vorderseite nach unten Leim eine kleine Menge von Ethylcyanoacrylat Leim. </li><li> Füllen Bühnenbereich des Vibratom mit einer ausreichenden Menge an Saccharose Gefrierschutzmitteln, das Gehirn zu bedecken, und Abschnitt des Gehirn bei einer Schichtdicke von 400 bis 500 um (je nach der Hirnregion zu untersuchenden) unter Verwendung eine Schwingungsfrequenz von 86 Hz und eine Klingenvorschubgeschwindigkeit von 0,125 mm / s. </li><li> Mit einem kleinen Pinsel, Place Hirnschnitten in eine Vertiefung einer 6-Well-Gewebekulturplatte mit im Handel erhältlichen maschenBodenEinsätze und vorgefüllt mit 10 ml 6% (w / v) Sucrose in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,4 enthält. </li><li> Inkubieren Abschnitte im Dunkeln bei 4 ° CO / N. </li></ol></li><li> Die Entwicklung Hirnschnitten <ol><li> Unter Verwendung der maschenBodenEinsätze, übertragen Hirnschnitten in eine neue Vertiefung mit 5 ml 2% (w / v) Paraformaldehyd (PBD) in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,4. Inkubieren auf einem Schüttler bei niedriger Geschwindigkeit im Dunkeln bei RT für 15 min bewegt. </li><li> Wasche zweimal Abschnitte von ihnen, um neue Vertiefungen mit 5 ml Wasser zu übertragen. Waschen Sie auf einer Wippe mit mäßiger Geschwindigkeit im Dunkeln bei RT für 5 min bewegt. </li><li> Transferabschnitte in einen neuen gut, die 5 ml von 2,7% (v / v) Ammoniumhydroxid. Inkubieren auf einem Schüttler mit einer langsamen Geschwindigkeit im Dunkeln bei RT für 15 min bewegt. </li><li> Wasche zweimal Abschnitte von ihnen, um neue Vertiefungen mit 5 ml Wasser zu übertragen. waschen Sie ona Wippe für 5 Minuten bei mäßiger Geschwindigkeit im Dunkeln bei RT bewegt. </li><li> Transferabschnitte in einen neuen gut , die 5 ml Fixativ A (siehe Materialien Table) , die in Wasser 10 - fach von seiner ursprünglichen Konzentration verdünnt gekauft wurde. Inkubieren auf einer Wippe mit einer langsamen Geschwindigkeit im Dunkeln bei RT für 25 min bewegt. </li><li> Wasche zweimal Abschnitte von ihnen, um neue Vertiefungen mit 5 ml Wasser zu übertragen. Waschen Sie auf einer Wippe mit mäßiger Geschwindigkeit im Dunkeln bei RT für 5 min bewegt. </li></ol></li><li> Montage Gehirnschnitte <ol><li> Mit einem kleinen Pinsel, montieren Schnitte auf Objektträger. Überschüssiges Wasser und Agar Pinzette und ein kleines Gewebe verwendet wird. Stellen Sie sicher, dass alle Agar, bevor mit Dehydratation entfernt wird. </li><li> Allow Abschnitte an der Luft trocknet bei RT für etwa 45 min (400 &amp; mgr; m Abschnitte) oder 90 min (500 &amp; mgr; m Abschnitte). HINWEIS: Der Zeitpunkt und die richtige Höhe der Trockenheit ist kritisch und muss möglicherweise in jedem zu bestimmendenLabor in Abhängigkeit von der Umgebungstemperatur und der Luftfeuchtigkeit. Ein zu kurzer Trocknungszeit führt zu Abschnitten aus den Folien während der anschließenden Entwässerungsschritte fallen, und ein zu lange Trocknungszeit führt zu Abschnitten Knacken. Abschnitte werden nach wie vor auf der entsprechenden Ebene der Trockenheit sein glänzend erscheinen. </li><li> Stain Schnitte mit Kresylviolett von Dias in Coplin Färbeschalen wie angezeigt setzt. HINWEIS: Dieser optionale Schritt für Abschnitte verwendet werden kann, die eingefroren nie hatte, um neuronale Kerne mit Kresylviolett zu färben. Wir haben gefunden, dass das Clearing und Rehydratisieren Abschnitte vor der Inkubation in Kresylviolett führt zu noch über Abschnitte und niedrige Hintergrundfärbung. <ol><li> Platzieren in Mittel für 5 min löschen. Wiederhole einmal. </li><li> Legen Sie in 100% Ethanol für 5 min. Wiederhole einmal. </li><li> Platzieren in 95% Ethanol in Wasser, dann 75% Ethanol in Wasser und dann 50% Ethanol in Wasser für 2 min je. </li><li> Legen Sie in Wasser für 5 min. </li><li> Platzieren in 0,5% (w / v) cresyl violet in Wasser für 7 min. </li><li> Legen Sie in Wasser für 2 min. Wiederhole einmal. </li></ol></li><li> Dehydratisieren Abschnitte durch wie angegeben Dias in Coplin Färbeschalen platzieren. <ol><li> Platzieren in 50% Ethanol in Wasser, dann 75% Ethanol in Wasser und dann 95% Ethanol in Wasser für 2 min je. </li><li> Legen Sie in 100% Ethanol für 5 min. Wiederhole einmal. </li><li> Platzieren in Mittel für 5 min löschen. Wiederhole einmal. HINWEIS: Diese Austrocknung und Clearing Zeiten sind ausreichend Gehirn der Maus zu verarbeiten, wie in diesem Manuskript beschrieben. Wir haben jedoch für andere Arten, einschließlich Ratten und cowbird beobachtet, dass der endgültige Clearing Schritt muß bis 15 min insgesamt verlängert werden. </li></ol></li><li> Coverslip Abschnitte eine wasserfreie Befestigungsmedium verwendet. </li><li> Erlauben Folien für mindestens 5 d horizontal im Dunkeln bei RT zu trocknen. </li></ol></li></ol> 2. Imaging Stained Neurone innerhalb Thick Hirnschnitten <ol><li> Erfassen von Bildstapel </strong&gt; <ol><li> Schalten Sie das Mikroskop Glühbirne, die Kamera und Objekttischsteuerung. </li><li> Öffnen Sie die Mikroskop - Software (zB Neurolucida). </li><li> Platzieren einer Folie auf dem Mikroskoptisch. </li><li> Erfassen eine 2D-Weitsichtbild des Gehirns Abschnitt eine niedrige Vergrößerung Ziel Verwendung wie 1,25X 0,4 NA PlanApo oder 4x 0,16 NA <ol><li> Fokus Bild und stellen Sie die Kameraeinstellungen einschließlich der Belichtungszeit und Weißabgleich. </li><li> Erstellen Sie einen Referenzpunkt mit der linken Maustaste irgendwo auf dem Abschnitt </li><li> Nehmen Sie das Bild von „erwerben einzelnes Bild“ im Bildaufnahmefenster auswählen. </li></ol></li><li> Erfassen Mitte Auflösung Bildstapel der Fläche enthält, die Neuronen (e) von Interesse, unter Verwendung eines 10X-0,3 NA uPlan FL N Ziels. <ol><li> das Bild konzentrieren und die Kameraeinstellungen einschließlich der Belichtung und Weißabgleich einzustellen. </li><li> Stellen Sie die obere und untere Grenze für die Bildstapel durch an der Oberseite des Abschnitts eine fokussierendend die Auswahl von „gesetzt“ neben „top of stack“ innerhalb des Bildaufnahmefensters, und dann auf den Boden des Abschnitts konzentriert und „set“ neben „bottom of stack“ innerhalb des Bildaufnahmefensters ausgewählt wird. </li><li> Stellen Sie das Schrittweite bis 5 um durch „5 &amp; mgr; m“ neben „Abstand zwischen den Bildern“ innerhalb des Bildaufnahmefensters eintritt. </li><li> Nehmen Sie das Bild Stapel von „acquire Bildstapel“ im Bildaufnahmefenster auswählen. </li><li> Wiederholen der obigen Schritte den gesamten Bereich von Interesse zu erfassen, um sicherzustellen, dass alle Bildstapel von mindestens 10% überlappen, in der X- und Y-Achsen. </li></ol></li><li> Erfassen hochauflösenden Bildstapeln der Fläche des Neurons von Interesse enthalten, unter Verwendung eines 30X 1,05 NA Silikonölimmersionsobjektiv. <ol><li> Anwenden von 3 bis 4 Tropfen Silikon Sionsöl auf den Objektträger und legt das Ziel über den Objektträger, um sicherzustellen, Kontakt herzustellen zwischen dem Objektiv und oil. </li><li> das Bild konzentrieren und die Kameraeinstellungen einschließlich der Belichtung und Weißabgleich einzustellen. </li><li> Stellen Sie die obere und untere Grenze für die Bildstapel durch an die Oberseite des Abschnitts Fokussierung und die Auswahl von „gesetzt“ neben „top of stack“ innerhalb des Bildaufnahmefensters, und dann auf den Boden des Abschnitts Fokussierung und die Auswahl von „gesetzt“ neben „bottom of stack“ innerhalb des Bildaufnahmefensters. </li><li> Stellen Sie die Schrittweite auf 1 &amp; mgr; m um „1 &amp; mgr; m“ neben „Abstand zwischen den Bildern“ innerhalb des Bildaufnahmefensters eintritt. </li><li> Nehmen Sie das Bild Stapel von „acquire Bildstapel“ im Bildaufnahmefenster auswählen. </li><li> Wiederholen der obigen Schritte den gesamten Bereich von Interesse zu erfassen, um sicherzustellen, dass alle Bildstapel von mindestens 10% überlappen, in der X- und Y-Achsen. </li></ol></li><li> Speichern Sie die Datei und speichern Sie alle Bilddateien im TIFF-Format für externe Verarbeitung. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Erstellen von Z-Projektionsbilder und Bild Montages <ol><li> Erstellen Z-Projektionsbilder in ImageJ <ol><li> Offene ImageJ-Software, die das Bio-Formate Plugin installiert hat. </li><li> Wählen Sie &quot;Plugins&quot; -&gt; &quot;Bio-Formate&quot; -&gt; &quot;Bio-Formate Importeur&quot;. </li><li> Wählen Sie die Bildstapel-Datei zu öffnen. </li><li> Sobald die Datei geöffnet wird, um das Format zu ändern, indem RGB „Bild“ wählen -&gt; „Type“ -&gt; „RGB-Farbe“. </li><li> Erstellen Sie die Z-Projektion durch Auswahl von &quot;Bild&quot; -&gt; &quot;Stacks&quot; -&gt; &quot;Z Projekt ...&quot;. </li><li> Speicher zweidimensionales Z-Projektionsbild als TIFF-Datei. </li></ol></li><li> Erstellen Sie ein zweidimensionales Bild Montage der gesamten Fläche von Interesse. <ol><li> Öffnen Sie die Software (zB Adobe Photoshop). </li><li> Wählen Sie &quot;Datei&quot; -&gt; &quot;Automatisieren&quot; -&gt; &quot;Photomerge&quot;. </li><li> Wählen Sie „Durchsuchen“ und dann alle imag hinzufügenes Dateien zusammengeführt werden. </li><li> Stellen Sie sicher, dass „Blend Images Together“ ausgewählt ist, und wählen Sie dann „OK“. </li><li> Speichern Sie die Montagebild des gesamten Bereichs von Interesse als TIFF-Datei. </li></ol></li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Wir beschreiben hier ein Golgi-Cox Färbeprotokolls zusammen mit zwei nützliche Varianten für Neuronen im dicken Hirnschnitten sichtbar zu machen. Wie in den Repräsentative Ergebnisse gezeigt, die Verwendung eines hochauflösenden Ziel, die eine lange 800 &amp; mgr; m Arbeitsabstand hat ermöglicht die zuverlässige Visualisierung der gesamten Neuronen über die gesamte Tiefe des Gehirns bei 500 &amp; mgr; m geschnitten Abschnitte. Diese Studie von relativ dicken Hirnschnitten erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass gefärbt Neur...

Die Visualisierung von einzelnen Neuronen innerhalb von Gewebeproben ermöglicht die in - situ - Analyse von Neuronen morphologischer Eigenschaften, die unser Verständnis des Gehirns deutlich fortgeschritten sind und wie sie durch endogene Krankheit oder exogene Umweltfaktoren beeinflusst werden. Die Golgi-Cox-Färbeverfahren sind ein kostengünstiges, relativ einfaches Mittel eine Stichprobe von Neuronen im Gehirn Anfärben. Zuerst von Golgi 1 entwickelt und modifiziert von Cox 2 in den 1800er Jahren haben die Forscher weiter verfeinert , diese Technik im Laufe der Jahre klar, gut gefärbten Neuronen zu erzeugen , die verwendet werden können , zu visualisieren und sowohl Dendritenbaum Morphologie und Wirbelsäule Dichte 3, 4, zu quantifizieren 5, 6, 7, 8, 9. Eine wichtige technische Überlegungen für die Visualisierung von gefärbten Neuronen in Hirnschnitten ist die maximale Schichtdicke, die von der Arbeitsabstand der verfügbaren hochvergrößernde / hochauflösendes Mikroskop-Objektive begrenzt ist. Gemeinsame Öl-Tauchziele in den 60 - 100X Bereich hervorragende Auflösung bieten, sind aber durch ihre Arbeitsabstände begrenzt, die typischerweise nicht größer sind als 200 &amp; mgr; m. Hirnschnitte bei der 200 um Bereich schneiden kann ausreichend sein , bestimmte Neuron Typen sichtbar zu machen , die innerhalb dieser Schichtdicke enthalten sein können, beispielsweise pyramidalen Neuronen in flachen Schichten der Hirnrinde 10, 11, 12, pyramidalen Neuronen in der CA1 - Region des Hippocampus 13, 14 und Körnerzellen im Gyrus dentatus des Hippocampus 15. Neurone mit relativ mehrDendritenbäume wie pyramidalen Neuronen in tiefen Schichten des Hirnrinde , die für Maus kann mehr als 800 erstrecken , um von dem Zellkörper 16, eine größere Herausforderung bieten , da Gehirne in einem perfekten Winkel geschnitten werden müßten den gesamten Dendriten Baum enthalten innerhalb von 200 &amp; mgr; m-Scheiben. Dies kann auch nicht durchführbar sein, wenn ein Dendrit oder eine ihrer Verzweigungen in der rostralen oder kaudalen Richtung erstrecken. Während es möglich ist , diese Einschränkung zu adressieren , indem ein Neuron über mehrere benachbarte Hirnschnitte Tracing stellt dieser Ansatz eine erhebliche technische Herausforderung , die Abschnitte genau in Ausrichtung 17 zur Verfolgung. Ein praktischer Ansatz wäre gesamte Neuronen in Hirnschnitten enthalten ist, zu visualisieren, die mit einer größeren Dicke geschnitten werden. Wir berichten hier über eine Technik Neuronen zu färben innerhalb von 400 bis 500 &amp; mgr; m dicker Hirnschnitten von Mäusen, die die Golgi-Cox-Methode und dessen mo zu visualisierenrphology unter Verwendung eines hochauflösenden Silizium-Ölimmersionsobjektiv, das einen 800 um Arbeitsabstand aufweist. Das Golgi-Cox Imprägnierung und Verarbeitungsprotokoll , das wir beschreiben , wird aus einem der zitierten modernen Protokollen in der Literatur 6 modifiziert. Unser Ansatz mit dicken Hirnschnitten bietet den Vorteil einer Erhöhung der Wahrscheinlichkeit der Identifizierung Neuronen jeglicher Art, die im Abschnitt vollständig enthalten sind. Neben dem Hauptprotokoll wir auch zeigen zwei Varianten, die einzigartige Vorteile bieten: (1) Golgi-Cox-Färbung mit Cresylviolett Gegenfärbemittel auf der Oberfläche der montierten Teile, um die Grenzen der Hirnregionen zu definieren und Schichten des identifizieren Großhirnrinde, und (2) Golgi-Cox-Färbung mit einem Zwischengefrierschritt für die lang~~POS=TRUNC von imprägniertem gesamtem Gehirn vor dem Schneiden und Endverarbeitung.

<table><tbody><tr><td>Kaliumdichromat</td><td>Fisher Scientific</td><td>P188-100</td><td>Gefährliches</td></tr><tr><td>Kaliumchromat</td><td>Fisher Scientific</td><td>P220-100</td><td>Gefährliches</td></tr><tr><td>Quecksilberchlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25423</td><td>Gefährliches</td></tr><tr><td>Filterpapier der Klasse 1</td><td>Fisher Scientific</td><td>1001-185</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Pharmazeutische Partner von Kanada</td><td></td><td></td>CP0406V2</tr><tr><td>20 mL Szintillationsfläschchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-4</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Bioshop Deutschland</td><td>SUC700.1</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat monobasisch</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5011-500G</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat zweibasig</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9390-500G</td><td></td></tr><tr><td>50 mL konisches Röhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-271</td><td></td></tr><tr><td>Isopentan</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC126470010</td><td>Auch bekannt als 2-Methylbutan; gefährlicher</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1296-100G</td><td></td></tr><tr><td>kleine Waage</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-202-100</td><td></td></tr><tr><td>Vibratom</td><td>Leica</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Gewebekulturplatten</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1b</td><td></td></tr><tr><td>Gewebekultureinsätze mit Netzboden</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-214</td><td></td></tr><tr><td>Paraformadelhyde (PFA), 16%</td><td>Elektronenmikroskop Sciences</td><td>15710-S</td><td>Gefährliches</td></tr><tr><td>Ammoniumhydroxid</td><td>Fisher Scientific</td><td>A669S-500</td><td>Gefährliches</td></tr><tr><td>Kodak Fixiermittel A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7542</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost plus Objektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>CitroSolv Clearingmittel</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-143-975</td><td></td></tr><tr><td>wasserfreier Ethylalkohol</td><td>Kommerzielle Alkohole</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>cresylviolet</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1791</td><td></td></tr><tr><td>permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>aufrechtes Mikroskop</td><td>Modell</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Olympus BX53Farbkamera, 12 Bit</td><td>MBF Biosciences</td><td>DV-47d</td><td>QImaging-Teil 01-MBF-2000R-F-CLR-12</td></tr><tr><td>3D motorisierter Mikroskoptisch, Controller und Ender</td><td>MBF Biosciences</td><td>N/A</td><td>Lieferung und integriert mit dem Mikroskop von MBF Biosciences</td></tr><tr><td>4X Mikroskopobjektiv</td><td>Olympus</td><td>4x 0,16 N.A. UplanSApo</td><td></td></tr><tr><td>10X Mikroskopobjektiv</td><td>Olympus</td><td>10x 0,3 N.A. UPlan FL N&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>30X Mikroskop Objektiv</td><td>Olympus</td><td>30x 1.05 N.A. UPlanSApo&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>60X Mikroskopobjektiv</td><td>Olympus</td><td>60x 1.42 N.A. PlanAPO N</td><td></td></tr><tr><td>Silikon-Immersionsöl</td><td>Olympus</td><td>Z-81114</td><td></td></tr><tr><td>Neurolucida Software</td><td>MBF Biosciences</td><td>Version 10</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>U.S. National Institutes of Health</td><td>Aktuelle Version Mit</td><td>dem OME Bio-Formats Plugin installiert</td></tr><tr><td>Photoshop Software</td><td>Adobe-Version</td><td>CS6</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging neurone innerhalb dickhirnschnitten mit der golgi-cox-methode

Imaging Neurons within Thick Brain Sections Using the Golgi-Cox Method

Der Golgi-Cox-Methode von Neuron-Färbung ist seit mehr als zweihundert Jahren beschäftigt unser Verständnis der neuronalen Morphologie innerhalb histologischen Hirnproben vorzurücken. Zwar ist es aus praktischer Sicht zu bevorzugen ist, um Hirnschnitt bei der größten Dicke möglich ist, um die Wahrscheinlichkeit des Identifizierens stained Neuronen zu erhöhen, die vollständig innerhalb einzelnen Abschnitte enthalten ist, herzustellen, ist dieser Ansatz aus technischen Sicht von dem Arbeitsabstand von hohen begrenztem Lineare Wiedergabe Mikroskopobjektive. Wir berichten hier über ein Protokoll Neuronen färbt das Golgi-Cox-Verfahren in Mausgehirnschnitte verwenden, die bei 500 &amp; mgr; m Dicke geschnitten werden, und Neuronen in der gesamten Tiefe dieser Abschnitte zur Visualisierungen mit einem hochauflösenden 30X 1,05 NA Silikon ausgerüstet ein aufrechtes Mikroskop Ölimmersionsobjektiv, das einen 800 um Arbeitsabstand aufweist. Wir berichten auch zwei nützliche Varianten dieses Protokolls, das verwendet werden kann, um die Oberfläche des gegenzufärbenmontiert Gehirnschnitt mit der Kresylviolett Nissl-Färbung, oder ganze Gehirne für die Langzeitlagerung vor dem Schneiden und Endverarbeitung gefrieren. Das Hauptprotokoll und seine zwei Varianten produzieren gefärbte dicke Hirnschnitten, wobei durchwegs voll Neuron Dendritenbäume und Dendriten Stacheln können zuverlässig sichtbar gemacht und quantifiziert werden.

500 &amp; mgr; m dicke Gehirnschnitte - Dieses Golgi-Cox-Färbung Protokoll und seine beiden beschriebenen optionalen Varianten können einzelne Neuronen innerhalb von 400 zu visualisieren eingesetzt werden. Repräsentatives Bild montages von zweidimensionalen Z-Projektionen Ziel unter Verwendung eines 10X aufgefangen und 5 um Schritte in der Z - Achse ist in Abbildung 1 gezeigt: A1 - C1 für einen großen Bereich der koronalen Hirnschnitten, die den anterioren cingulären Cor...

Wir präsentieren ein Protokoll der Golgi-Cox-Färbung in dicken Hirnschnitten für die Verwendung, um Neuronen mit langen Dendritenbäume innerhalb einzelner Gewebeproben enthalten ist, zu visualisieren. Zwei Varianten dieses Protokolls werden auch vorgestellt, Kresylviolett Gegenfärbung einzubeziehen und das Einfrieren von nicht verarbeiteten Gehirne für die Langzeitlagerung.

Imaging Neurone innerhalb Dickhirnschnitten Mit der Golgi-Cox-Methode

The Golgi-Cox method of neuron staining has been employed for more than two hundred years to advance our understanding of neuron morphology within ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die wirksame Behandlung der Morphologie von Neuronen im Gehirn von Nagetieren zu bestimmen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, beispielsweise zur normalen und experimentell veränderten Morphologie von Neuronen in verschiedenen Regionen des Nagetiergehirns. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, markierte Neuronen zu identifizieren und sichtbar zu machen, die vollständig innerhalb einzelner histologischer Proben enthalten sind.Beginnen Sie die Golgi-Cox-Färbung, indem Sie ein frisches Maushirn in ein 20 ml fassendes Glaszählfälschchen mit 17 ml Golgi-Cox-Lösung geben. Lichtgeschützt lagern und 25 Tage bei Raumtemperatur inkubieren. Nach Ablauf der Inkubationszeit das Gehirn durch Einlegen in 40 ml Saccharose-Cryoschutzmittel kryoprotegieren und 24 Stunden im Dunkeln bei 4 Grad Celsius inkubieren.Nach der Inkubation in Saccharose kann das Gehirn zur Langzeitlagerung eingefroren oder direkt wie im nächsten Abschnitt des Videos gezeigt für den Schnitt präpariert werden. Zum Einfrieren das gesamte Gehirn in 200 Milliliter Isopentan e

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Dieses Video zeigt den Prozess der Visualisierung eines mit Biocytin gefüllten Interneurons in einem Hippocampus-Schnitt einer Ratte und hebt seine neurochemische Identität durch den Einsatz spezifischer Antikörper und Fluoreszenzmikroskopie hervor.

Immunfärbung von Interneuronen in einem Hippocampus-Schnitt an der Ratte

Quelle: Louth, E. L., et al. Bildgebung von Neuronen in dicken Hirnschnitten mit der Golgi-Cox-Methode. J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video zeigt die Bildgebung von Neuronen in einem Golgi-Cox-gefärbten dicken Gehirnschnitt, indem obere und untere Fokusgrenzen festgelegt und überlappende Bilder aufgenommen werden. Mehrere Orte werden abgebildet, um detaillierte neuronale Projektionen zu gewährleisten, die zu einer 3D-Darstellung kombiniert werden.

Mikroskopische Bildgebung von Neuronen in einem Mausgehirnschnitt mittels Golgi-Cox-Metallic-Färbung

Dieser Beitrag beschreibt die Verfahren für die taktile Stimulation von Rattenjungen und anschließende Golgi-Cox-Färbung der neuronalen Morphologie. Taktile Stimulation ist eine positive Erfahrung, die in der Perinatalperiode durch Streicheln Welpen mit einem Haushalts duster verwaltet wird. Golgi-Färbung cox ist ein zuverlässiges Verfahren ermöglicht die Visualisierung der gesamten Neuronen.

Visualisierung der Auswirkungen einer Früh Positive Erfahrung, taktile Stimulation, auf dendritischen Morphologie und synaptische Verbindungen mit Golgi-Cox Färbung

Wir beschreiben zwei Methoden zur Visualisierung und Quantifizierung der dendritischen Arborisierung im Hippocampus von Mausmodellen: Echtzeit- und erweiterte Tiefenschärfebildgebung. Während die erste Methode eine ausgefeilte topographische Verfolgung und Quantifizierung des Ausmaßes der Verzweigung ermöglicht, ermöglicht die zweite eine schnelle Visualisierung des dendritischen Baumes.

Bewertung der dendritischen Verzweigung im Gyrus dentatus des Hippocampus-Region an der Maus

Dieses Protokoll stellt eine Methode für die morphologische Erholung von Neuronen während elektro Aufnahmen mit biocytin Füllung und anschließende immunhistochemischen Nachbearbeitung geflickt. Wir zeigen, dass dicke biocytin gefüllten Abschnitte, die später mit einem zweiten primären Antikörper Tage oder Monate erneut gefärbt können wurden gefärbt und Eindecken werden.

Immunostaining von Biocytin gefüllte und verarbeitete Abschnitte für Marker Neurochemisches

Dieses Protokoll beschreibt groß angelegte Rekonstruktion selektiver neuronaler Populationen, etikettiert folgende retrograden Infektion mit einem modifizierten Tollwutvirus Fluoreszenzmarker exprimieren, und unabhängig, unvoreingenommen Clusteranalysen, umfassende Charakterisierung der morphologischen Metriken unter verschiedene neuronale Subklassen ermöglichen.

Großflächige Rekonstruktionen und Independent, Unvoreingenommene Clustering Basierend auf Morphologische Metriken Klassifizieren Neurons in Selective Populations

Hier stellen wir ein Golgi-Cox-Protokoll ausführlich vor. Diese zuverlässige Gewebe-Fleck-Methode ermöglicht eine qualitativ hochwertige Beurteilung der Cytoarchitektur im Hippocampus und im gesamten Gehirn mit minimaler Fehlersuche.

Bewertung der Hippocampalen Dendritischen Komplexität bei gealterten Mäusen unter Verwendung der Golgi-Cox-Methode

Hier beschreiben wir eine Vorgehensweise für Gewebe, clearing, fluoreszierende Kennzeichnung und umfangreiche Darstellung der Maus Hirngewebe, die dadurch ermöglicht die Visualisierung der dreidimensionalen Organisation der Zelltypen der Großhirnrinde.

Groß angelegte dreidimensionale Bildgebung der zelluläre Organisation in der Maus Neocortex

Dieses Protokoll demonstriert eine einfache und robuste Methode zur Untersuchung des In-situ-Axonwachstums und der Wachstumskegeldynamik. Es beschreibt, wie ex vivo physiologisch relevante akute Hirnschnitte hergestellt werden können und stellt eine benutzerfreundliche Analysepipeline zur Verfügung.

In situ Visualisierung des Axonwachstums und der Wachstumskegeldynamik in akuten ex vivo embryonalen Hirnschnittkulturen

Das Protokoll beschreibt eine Modifikation der schnellen Golgi-Methode, die an jeden Teil des Nervensystems angepasst werden kann, zur Färbung von Neuronen im Hippocampus und im medialen präfrontalen Kortex der Ratte.

Schneller Golgi-Fleck für die Visualisierung der dendritischen Wirbelsäule im Hippocampus und im präfrontalen Kortex

Lernen Sie die Golgi-Cox-Färbung zur Visualisierung von Neuronen mit langen dendritischen Bäumen in dicken Gehirnschnitten. Diese Methode ermöglicht die detaillierte Analyse neuronaler Morphologie im Nagetiergehirn.

Imaging Neurone innerhalb Dickhirnschnitten Mit der Golgi-Cox-Methode

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