Imaging Neurone innerhalb Dickhirnschnitten Mit der Golgi-Cox-Methode

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die wirksame Behandlung der Morphologie von Neuronen im Gehirn von Nagetieren zu bestimmen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, wie z.B. die normale und experimentell manipulierte Morphologie von Neuronen in verschiedenen Regionen des Nagetiergehirns. Diese Technik hat den Hauptvorteil, dass sie die Wahrscheinlichkeit erhöht, markierte Neuronen zu identifizieren und sichtbar zu machen, die vollständig in einzelnen histologischen Proben enthalten sind.

Beginnen Sie mit der Golgi-Cox-Färbung, indem Sie ein frisches Mausgehirn in ein 20-Milliliter-Glasszintillationsfläschchen mit 17 Millilitern Golgi-Cox-Lösung geben. Vor Licht schützen und 25 Tage bei Raumtemperatur inkubieren. Nach Ablauf der Inkubationszeit schützt Cryo das Gehirn, indem es in 40 Milliliter Saccharose-Kryoprotektor gegeben und 24 Stunden lang im Dunkeln bei 4 Grad Celsius inkubiert wird.

Nach der Inkubation in Saccharose kann das Gehirn für die Langzeitlagerung eingefroren oder sofort für die Sektion blockiert werden, wie im nächsten Abschnitt des Videos gezeigt. Tauchen Sie beim Einfrieren das ganze Gehirn in 200 Milliliter Isopentan, das auf Trockeneis vorgekühlt wurde. Anschließend wird das gefrorene Gehirn in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen gegeben und im Dunkeln bei minus 80 Grad Celsius gelagert.

Entfernen Sie zunächst das Gehirn von der Saccharose. Und verwenden Sie eine Rasierklinge, um es für das Schneiden zu blockieren, indem Sie das Kleinhirn abschneiden und eine flache Kante am verbleibenden kaudalen Ende des Gehirns hinterlassen. Das Gehirn muss in einem präzisen Winkel blockiert werden, um sicherzustellen, dass die interessierenden Neuronen vollständig in den resultierenden Abschnitten enthalten sind.

Zum Beispiel verwenden wir eine koronale Ebene, die perfekt senkrecht zur rostralen Schwanzachse für Pyramidenneuronen der Großhirnrinde verläuft. Als nächstes erhitzen Sie den Agar, bis er geschmolzen ist. Und lassen Sie es abkühlen, bis es leicht über dem Schmelzpunkt ist.

Legen Sie dann das Gehirn mit dem kaudalen Ende nach unten in eine kleine Einweg-Waagschale. Fügen Sie geschmolzenen Agar hinzu, um das Gehirn zu bedecken. Sobald der Agar fest geworden ist, schneiden Sie den Überschuss ab, so dass etwa zwei bis vier Milliliter das Gehirn umgeben.

Verwenden Sie dann eine kleine Menge Ethylcyanacrylat, um das Gehirn mit dem kaudalen Ende nach unten auf das Stadium eines Vibratoms zu kleben. Füllen Sie den Stadienbereich des Vibratoms mit genügend Saccharose-Kryoprotektivum, um das Gehirn zu bedecken. Dann schneiden Sie das Gehirn mit einer Schnittdicke von 400 bis 500 Mikrometern, abhängig von der zu untersuchenden Hirnregion.

Legen Sie die Gehirnschnitte mit einem kleinen Pinsel in Vertiefungen einer Gewebekulturplatte mit sechs Vertiefungen, die Netzbodeneinsätze enthalten und mit Saccharose-M-Phosphatpuffer vorgefüllt sind. Während des Schneidens vor Licht schützen. Wenn Sie mit dem Schneiden fertig sind, inkubieren Sie die Schnitte im Dunkeln bei vier Grad Celsius über Nacht.

Übertragen Sie die Gehirnabschnitte mit den Netzbodeneinsätzen in eine neue Vertiefung, die fünf Milliliter Paraformaldehyd in Phosphatpuffer enthält. Inkubieren Sie auf einer Wippe, die sich mit langsamer Geschwindigkeit bei Raumtemperatur im Dunkeln bewegt, 15 Minuten lang. Waschen Sie die Abschnitte zweimal, indem Sie sie in neue Brunnen mit fünf Millilitern Wasser umfüllen.

Vor Licht schützen und bei mäßiger Geschwindigkeit bei Raumtemperatur fünf Minuten lang waschen. Übertragen Sie dann die Abschnitte in eine neue Vertiefung, die fünf Milliliter Ammoniumhydroxid enthält. Im Dunkeln bei Raumtemperatur 15 Minuten langsam schaukeln.

Waschen Sie die Abschnitte zweimal, indem Sie sie in neue Brunnen mit fünf Millilitern Wasser umfüllen. Auf einer Wippe, die sich mit mäßiger Geschwindigkeit im Dunkeln bei Raumtemperatur bewegt, fünf Minuten lang waschen. Übertragen Sie die Schnitte in eine neue Vertiefung mit fünf Millilitern verdünntem Fixiermittel A.Inkubieren Sie auf einer Wippe, die sich bei langsamer Geschwindigkeit im Dunkeln bei Raumtemperatur bewegt, 25 Minuten lang.

Waschen Sie die Abschnitte zweimal wie zuvor mit Wasser. Lege die Schnitte mit einem kleinen Pinsel auf einen Objektträger und entferne dann mit einer Pinzette und einem kleinen Taschentuch überschüssiges Wasser und Agar. Stellen Sie sicher, dass alle Agars entfernt wurden, bevor Sie mit den Dehydratisierungsschritten fortfahren.

Lassen Sie die Abschnitte bei Raumtemperatur lichtgeschützt an der Luft trocknen. Die geeignete Trocknungszeit ist entscheidend und sollte für jedes Labor festgelegt werden. Eine zu kurze Zeit kann dazu führen, dass Abschnitte während der Dehydratisierungsschritte von den Objektträgern abfallen, und eine zu lange Zeit kann dazu führen, dass die Abschnitte reißen.

Legen Sie die Objektträger nach dem Trocknen zunächst für fünf Minuten in Klarmittel. Legen Sie die Objektträger fünf Minuten lang in 100%iges Ethanol. Durchlaufen Sie dann jeweils zwei Minuten lang eine Reihe von abnehmenden Ethanolkonzentrationen.

Legen Sie die Objektträger nach der Alkoholserie fünf Minuten lang in Wasser. Dann 0,5 % Kresylviolett sieben Minuten lang in Wasser einfärben. Legen Sie die Objektträger nach dem cresylvioletten Fleck zwei Minuten lang in Wasser.

Dehydrieren Sie dann die Schnitte durch eine Reihe von steigenden Alkoholkonzentrationen für jeweils zwei Minuten. Dann zwei Wäschen in 100%igem Ethanol für fünf Minuten. Fünf Minuten in das Clearingmittel stellen.

Zum Schluss fügen Sie ein wasserfreies Einbettmedium hinzu und legen Sie einen Decklader über die Abschnitte. Lassen Sie die Objektträger mindestens fünf Tage lang im Dunkeln bei Raumtemperatur liegend trocknen. Um hochauflösende Bildstapel des Bereichs aufzunehmen, in dem sich das Neuron von Interesse befindet, wählen Sie zunächst ein 30X 1,05 NA Silikonöl-Immersionsobjektiv am Mikroskop aus.

Tragen Sie dann drei bis vier Tropfen Silikon-Tauchöl auf den Objektträger auf. Platzieren Sie das Objektiv über dem Objektträger und stellen Sie sicher, dass das Objektiv mit dem Öl in Kontakt kommt. Fokussieren Sie das Bild und passen Sie die Kameraeinstellungen einschließlich Belichtung und Weißabgleich in der Bildgebungssoftware an.

Legen Sie als Nächstes die obere und untere Begrenzung für den Bildstapel fest, indem Sie auf den oberen Rand des Abschnitts fokussieren und dann im Bildaufnahmefenster neben dem oberen Rand des Stapels die Option Festlegen auswählen. Fokussieren Sie sich dann auf den unteren Rand des Abschnitts, und wählen Sie neben dem unteren Rand des Stapels Festlegen aus. Legen Sie den Schrittabstand auf einen Mikrometer fest, indem Sie im Bildaufnahmefenster einen Mikrometer neben dem Abstand zwischen den Bildern eingeben.

Erfassen Sie abschließend den Bildstapel, indem Sie im Bildaufnahmefenster die Option Bildstapel erfassen auswählen. Wiederholen Sie die vorherigen Schritte, um den gesamten Interessenbereich zu erfassen, und stellen Sie sicher, dass sich alle Bildstapel auf der X- und Y-Achse um mindestens 10 % überlappen. Dieses Bild der Großhirnrinde ist eine zusammengeführte Z-Projektion von Bildstapeln, die aus einem 500 Mikrometer dicken Schnitt mit einem 10-fachen Objektiv aufgenommen wurden.

Das Gewebe in diesem Bild wurde unter Verwendung des Hauptprotokolls "All Fresh" verarbeitet. Der durch das rote Quadrat angezeigte Bereich wurde mit einem 30-fachen Siliziumöl-Immersionsobjektiv abgebildet und ein höher aufgelöster zusammengeführter Z-Projektionsbildstapel aufgenommen. Der rote Pfeil zeigt die zweidimensionale Z-Projektion eines Neurons, das aus dem hochauflösenden 30X-Bildstapel verfolgt wurde.

Hier kam die frische Protokollvariante mit Cresylviolett-Färbung zum Einsatz. Dieses Bild mit höherer Auflösung zeigt den kresylviolett gefärbten Abschnitt. Und das ist das erhaltene Neuron-Tracing.

Schließlich wurde dieses Gewebe mit der Protokollvariante aufbereitet, bei der Gehirne nach einer Golgi-Cox-Imprägnierung eingefroren werden. Hier ist das zuvor eingefrorene Gewebe in höherer Auflösung zu sehen. Und wieder wird eine qualitativ hochwertige zweidimensionale Z-Projektion des Neuronen-Tracing erhalten.

Diese Technik kann innerhalb eines Monats abgeschlossen werden, wobei die Verarbeitungs- und Bildgebungsschritte innerhalb der letzten Woche abgeschlossen sind. Alternativ können die Gehirne nach einer Golgi-Cox-Imprägnierung eingefroren werden, so dass die Aufbereitung und Bildgebung zu einem späteren Zeitpunkt abgeschlossen werden kann. Nach diesem Verfahren können Neurowissenschaftler die aufgenommenen Bilder verwenden, um detaillierte morphologische Analysen wie die Dendritenkomplexität oder die Wirbelsäulendichte durchzuführen, um festzustellen, wie eine experimentelle Manipulation die Struktur von Neuronen im Gehirn verändern kann.