Nachweis und Visualisierung von DNA-schadeninduzierten Proteinkomplexen in Suspensionszellkulturen unter Verwendung des Proximity Ligation Assays

Das übergeordnete Ziel dieses Nachweises mittels Ligationsassay in der Nähe (proximity ligation assay) besteht darin, die Bildung von Protein-Komplexen der DNA-Schadensantwort und -reparatur nach Induktion von DNA-Schäden in Zellsuspensionen sichtbar zu machen und zu quantifizieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der DNA-Reparatur zu beantworten, beispielsweise zur räumlich-zeitlichen Organisation und Regulation sowie dazu, wie unterschiedliche Reparaturwege auf verschiedene Arten von DNA-Schäden reagieren. Die wesentlichen Vorteile dieser Technik liegen in ihrer vergleichsweise einfachen Durchführung, dem geringen Zellbedarf und dem Umstand, dass keine aufwändige Probenvorbereitung erforderlich ist, die Protein-Protein-Interaktionen stören oder verändern könnte.

Obwohl diese Methode Einblicke in die DNA-Reparatur und die Bildung von Protein-Komplexen in Kultur-Suspensionszellen ermöglicht, kann sie auch in kultivierten adhärenten Zellen, gefrorenen oder paraffineinbetteten Geweben sowie sogar in ganzen Tieren angewendet werden. Die menschliche BCR-positiven, B-Zell-akuten lymphoblastischen Zelllinie BV-173 wird in dieser Studie verwendet und in IMDM mit Zusätzen bei 37 Grad Celsius in einer Atmosphäre mit 5 % CO2 kultiviert. Impfen Sie die Zellen mit zwei mal 10 hoch sechs pro Milliliter in eine sechswelligen Platte mit fünf Milliliter pro Vertiefung aus.

Um die Zellen in der G1-Phase des Zellzyklus anzuhalten, fügen Sie fünf Mikromolar Ammoniummethansulfonat zu jedem Well hinzu und inkubieren die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius in einer Atmosphäre mit 5 % CO2. Fügen Sie am folgenden Tag fünf Mikromolar eines ATM-Inhibitors zu jeweils zwei Wells hinzu und stellen Sie die Platte für 30 Minuten zurück in den Inkubator. Induzieren Sie anschließend DNA-Schäden, indem Sie einem der mit dem ATM-Inhibitor vorbehandelten Wells sowie einem nicht vorbehandelten Well jeweils 50 Nanogramm pro Milliliter NCS hinzufügen.

Two Stunden inkubieren. Bereiten Sie 1×PBS mit 10 % BSA vor, indem Sie fünf Gramm Fraction-5-BSA auf 50 Milliliter 1×PBS in einem Becher schichten und bei Raumtemperatur stehen lassen, ohne zu schütteln oder zu rühren, bis das BSA gelöst ist. Filtern Sie die PBS- mit 10 % BSA-Lösung langsam durch einen 0,22-Mikrometer-Filter und bewahren Sie sie auf Eis auf.

Die Zellen gewinnen, indem der Inhalt jedes Wells in ein 15-Milliliter-Röhrchen überführt wird. Die Zellen zweimal mit eiskaltem 1x PBS waschen. Nach der Zellzählung in 1x PBS mit 10 % BSA bei zwei mal 10 hoch sechs Zellen pro Milliliter resuspendieren.

Halten Sie die Zellen auf Eis. Bereiten Sie die Mikroskopiepräparate für dieses Verfahren vor, indem Sie sie vorsichtig mit fusselfreiem Tuch polieren und entfetten, indem Sie 96 % Ethanol in ein Coplin-Gefäß geben und die Präparate fünf Minuten lang darin belassen. Lassen Sie die Präparate 10 Minuten lang an der Luft trocknen.

Bauen Sie die Mikroskopiepräparate in die Zytospin-Zytologiefunnele mit einem Bereich von sechs Millilitern ein. Beschichten Sie die Präparate vorab, indem Sie 50 Mikroliter 1×PBS mit 10 % BSA in jeden Trichter pipettieren und eine Minute bei 500 U/min zentrifugieren. Geben Sie zu jedem Trichter 100 Mikroliter der Zellsuspension hinzu und zentrifugieren Sie fünf Minuten bei 500 U/min.

Zerlegen Sie die Trichter vorsichtig und achten Sie darauf, die Stellen auf den Objektträgern nicht zu berühren. Verwenden Sie einen flüssigen Pap-Pen-Blocker mit einer 5-Millimeter-Spitze, um einen Kreis um jede Stelle zu zeichnen. Geben Sie anschließend 50 µL einer 4 %igen PFA-Fixierungslösung auf jede Stelle.

Anschießend 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nach 30 Minuten die Zellen in einem Coplin-Gefäß bei Raumtemperatur mit 1×PBS unter leichtem Schütteln waschen. Diesen Waschschritt dreimal jeweils fünf Minuten lang wiederholen.

Trocknen Sie die Objektträger um die Flecken herum mit einem fusselfreien Tuch und entfernen Sie so viel Flüssigkeit wie möglich aus den Flecken, indem Sie den Objektträger kippen und mit einem fusselfreien Tuch trocknen. Geben Sie 50 µL von 0,25 % Triton X in 1× PBS zu jedem Fleck hinzu und inkubieren Sie 10 Minuten bei Raumtemperatur ohne Schütteln. Waschen Sie die Objektträger in 50 bis 60 mL TBS-T in einem Coplin-Gefäß bei Raumtemperatur mit sanfter Schüttelbewegung.

Dreimal für jeweils fünf Minuten. Vor dem Blockieren klopfen Sie die TBS-T-Lösung ab und trocknen Sie die Objektträger um die Stellen herum mit einem fusselfreien Tuch ab. Entfernen Sie so viel Flüssigkeit wie möglich von der Stelle.

Vortexen Sie die Blockierungslösung kurz und geben Sie dann etwa 40 Mikroliter, entsprechend einem Tropfen, auf jeden Fleck. Legen Sie die Objektträger in eine vorgewärmte feuchte Kammer und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Bereiten Sie die Antikörper-Cocktails vor.

Vortexen Sie und pipettieren Sie anschließend kommerziellen Antikörperverdünnungspuffer in jedes Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie den Ziegen-Anti-ATM-Antikörper im Verdünnungsverhältnis 1:1000 und den Kaninchen-Anti-Phosphoserin-15-p53-Antikörper im Verdünnungsverhältnis 1:100 hinzu.

Bei Einzelantikörper-Kontrollexperimenten bereiten Sie Antikörperverdünnungen vor, die nur den Ziegen-Anti-ATM-Antikörper bzw. nur den Kaninchen-Anti-Phosphoserin-15-p53-Antikörper enthalten. Am Ende der einstündigen Inkubation pipettieren Sie die Blockierungslösung ab, achten jedoch darauf, dass die Zellen nicht austrocknen. Geben Sie 30 Mikroliter jeder Antikörper-Cocktail-Verdünnung hinzu und inkubieren Sie über Nacht in einer befeuchteten Kammer bei vier Grad Celsius.

Am folgenden Tag die Objektträger in einem Coplin-Behälter zweimal je fünf Minuten bei Raumtemperatur mit 1X NC2-Waschpuffer A unter leichtem Schütteln waschen. Nachdem die Objektträger zweimal mit Waschpuffer A gewaschen wurden, den Waschpuffer von den Objektträgern abklopfen und 30 Mikroliter der Proximity-Ligations-Assay-Sondenmischung auf jeden Fleck geben. Eine Stunde bei 37 Grad Celsius in einer vorgewärmten feuchten Kammer inkubieren.

Spülen Sie die Objektträger mit 50 bis 60 Milliliter Waschpuffer A in einem Coplin-Gefäß bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. Bereiten Sie danach die Ligationsligase-Lösung auf Eis vor, indem Sie ein Mikroliter Ligase zu 39 Mikrolitern Ligationslösung für jeden Fleck hinzufügen. Geben Sie 40 Mikroliter der Ligationsligase-Lösung auf jeden Fleck.

30 Minuten bei 37 Grad Celsius in einer vorgewärmten feuchten Kammer inkubieren. Die Objektträger in einem Coplin-Gefäß mit Waschpuffer A bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln waschen. Die Amplifikations-Polymerase-Mischung auf Eis vorbereiten.

Verdünnen Sie zunächst die Amplifikations-Stammlösung im Verhältnis 1 zu 5 mit Wasser. Geben Sie für jeden Spot 0,5 Mikroliter Polymerase zu 39,5 Mikrolitern 1×-Amplifikationslösung hinzu. Entfernen Sie den Waschpuffer durch Abklopfen und geben Sie pro Spot 40 Mikroliter der Amplifikations-Polymerase-Mischung hinzu.

Inkubieren Sie 100 Minuten bei 37 Grad Celsius in einer vorgewärmten, befeuchteten Kammer. Am Ende der 100-minütigen Inkubation entfernen Sie vorsichtig die Amplifikations-Polymerase-Mischung und waschen die Objektträger zweimal je 10 Minuten bei Raumtemperatur mit 1X NC2-Waschpuffer B in einem Coplin-Gefäß unter leichtem Schütteln.

Anschließend die Objektträger eine Minute lang in 0,01x Waschpuffer B waschen. Überschüssigen Waschpuffer B abklopfen und die Bereiche um die Flecken mit einem fusselfreien Tuch trocknen. So viel Flüssigkeit wie möglich aus dem Fleck entfernen.

Bereiten Sie ein Montagemedium mit DAPI vor, das die Kerne nicht überfärbt, indem Sie das DAPI-enthaltende Montagemedium im Verhältnis 1:5 mit Montagemedium ohne DAPI verdünnen. Geben Sie 25 bis 30 Mikroliter des verdünnten, DAPI-enthaltenden Montagemediums auf einen 24 Millimeter mal 24 Millimeter großen Deckgläser. Heben Sie das Deckglas mit dem Objektträger auf und üben Sie leichten Druck aus, um sicherzustellen, dass keine eingeschlossenen Luftblasen vorhanden sind.

Versiegeln Sie den Deckglaser mit Nagellack und warten Sie mindestens 15 Minuten, bevor Sie die Probe einmikroskopieren. Schließlich mikroskopieren und analysieren Sie die Präparate mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop. Der Nachweiszirkulationsassay wurde verwendet, um die Interaktion zwischen ATM und Phosphoserin 15 p53 in BV 173 menschlichen BCR-abl-positiven Zellen, die in der G1-Phase arretiert waren, zu untersuchen.

Im Gegensatz zu Zellen, die nicht mit NCS zur Induktion von DNA-Schäden behandelt wurden, wiesen die meisten mit NCS behandelten Zellen punktförmige Signale ausschließlich im Zellkern auf, mit durchschnittlich sieben Signalen pro Zelle. Dies deutet darauf hin, dass die Induktion von DNA-Schäden zur Interaktion zwischen ATM und Phosphoserin 15 p53 führt. Die Vorbehandlung der Zellen mit einem spezifischen ATM-Kinase-Inhibitor vor der Induktion von DNA-Schäden verringert die Anzahl der Signale auf durchschnittlich zwei Signale pro Zelle, was bestätigt, dass die Phosphorylierung von p53 an der Serin-15-Position von der ATM-Kinase-Aktivität abhängig war.

Einzelne Antikörper-Kontrollexperimente, bei denen entweder der anti-ATM- oder der anti-Phosphoserin-15-p53-Antikörper weggelassen wurde, ergaben wie erwartet keinerlei Signale. Diese Abbildung zeigt die Quantifizierung und statistische Analyse der Ergebnisse, die die Spezifität der Nähe-Ligations-Assay-Technik an Zytospin-Präparationen von Suspensionzellkulturen belegen und bestätigen. Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie nach einer Übernacht-Inkubation mit einem primären Antikörper, sofern ordnungsgemäß durchgeführt, innerhalb von etwa fünf Stunden durchgeführt werden.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, den Antikörper vor der Durchführung des Nachbarschafts-Ligations-Assays durch immunfluoreszenztechnische Färbung der Zellen Ihres Interesses sorgfältig zu titrieren. Nach seiner Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern in der Zellbiologie den Weg, um transiente Protein-Protein-Interaktionen zu untersuchen, die mit Standardmethoden wie Immunpräzipitationen und FRET-basierter Bildgebung, die oft zu technischen Artefakten führen, schwer zu bewerten sind. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man den Nachbarschafts-Ligations-Assay an Zellsuspensionen durchführt, um Protein-Protein-Interaktionen in situ zu visualisieren und zu quantifizieren.