Nachweis und Visualisierung von DNA-schadeninduzierten Proteinkomplexen in Suspensionszellkulturen unter Verwendung des Proximity Ligation Assays

Das übergeordnete Ziel dieses Proximity-Ligation-Assay-Experiments ist es, die Bildung von DNA-Schadensreaktionen und Reparaturproteinkomplexen nach der Induktion von DNA-Schäden in Suspensionszellkulturen zu visualisieren und zu quantifizieren. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen bei der Reparatur von DNA-Schäden zu beantworten, wie z. B. räumliche, zeitliche Organisation und Regulation und wie verschiedene Reparaturwege auf verschiedene Arten von DNA-Schäden reagieren. Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass sie relativ einfach ist, eine geringe Zellzahl erfordert und keine umfangreiche Verarbeitung erfordert, was die Protein-Protein-Wechselwirkungen stören oder verändern kann.

Obwohl diese Methode Einblicke in die DNA-Reparatur und die Bildung von Proteinkomplexen in Kultur-Suspensionszellen geben kann, kann sie auch in kultivierten adhärenten Zellen, gefrorenen oder in Paraffin eingebetteten Geweben und sogar ganzen Tieren angewendet werden. Die humane BCR-fähige, akute lymphoblastische B-Zell-Zelllinie, BV-173, wird in dieser Studie verwendet und in IMDM mit Nahrungsergänzungsmitteln bei 37 Grad Celsius in einer Atmosphäre von 5 % CO2 kultiviert. Die Zellen werden zweimal 10 bis sechstel pro Milliliter in einer Sechs-Well-Platte mit fünf Millilitern pro Vertiefung plädiert.

Um die Zellen in der G1-Phase des Zellzyklus zu stoppen, geben Sie fünf Mikromolare Ammoniummethansulfonat in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius in einer Atmosphäre von 5 % CO2. Geben Sie am nächsten Tag fünf Mikromolaren eines ATM-Inhibitors in jede der beiden Vertiefungen und stellen Sie die Platte für 30 Minuten wieder in den Inkubator. Als nächstes induzieren Sie DNA-Schäden, indem Sie 50 Nanogramm pro Milliliter NCS in eine der Vertiefungen geben, die mit dem ATM-Inhibitor vorbehandelt wurden, und in eine andere Vertiefung, die nicht vorbehandelt wurde.

Zwei Stunden inkubieren. Bereiten Sie 1XPBS plus 10% BSA zu, indem Sie fünf Gramm Fraktion-5 BSA auf 50 Milliliter 1XPBS in einem Becherglas schichten und bei Raumtemperatur ohne Schütteln oder Rühren ruhen lassen, bis sich das BSA aufgelöst hat. Den PBS plus 10%ige BSA-Lösung langsam durch den 0,22-Mikrometer-Filter filtrieren und auf Eis halten.

Ernten Sie die Zellen und geben Sie den Inhalt jeder Vertiefung in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Waschen Sie die Zellen zweimal mit eiskalten 1XBPS. Nach dem Zählen der Zellen wird zweimal 10 bis zum sechsten Zellchen pro Milliliter in 1XBPS plus 10% BSA resuspendiert.

Halten Sie die Zellen auf Eis. Bereiten Sie die Objektträger für dieses Verfahren vor, indem Sie sie vorsichtig mit fusselfreiem Tuch polieren und entfetten, indem Sie ein 96%iges Ethanol fünf Minuten lang in ein Coplin-Glas geben. Lassen Sie die Dias 10 Minuten an der Luft trocknen.

Montieren Sie die Mikroskopie-Objektträger in die Cytospin-Zytologie-Trichter mit einer Fläche von sechs Millilitern. Beschichten Sie die Objektträger, indem Sie 50 Mikroliter 1XPBS plus 10 % BSA in jeden Trichter pipettieren und eine Minute lang bei 500 U/min zentrifugieren. Geben Sie 100 Mikroliter der Zellsuspension in jeden Trichter und zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 500 U/min.

Zerlegen Sie die Trichter vorsichtig und achten Sie darauf, die Flecken auf den Objektträgern nicht zu berühren. Verwende einen Pap Pen Liquid Blocker mit einer Fünf-Millimeter-Spitze, um einen Kreis um jeden Punkt zu zeichnen. Geben Sie dann 50 Mikroliter 4%ige PFA-Fixierlösung auf jede Stelle.

Und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Waschen Sie die Zellen nach 30 Minuten mit 1XPBS in einem Coplin-Glas bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren. Waschen Sie auf diese Weise dreimal jeweils fünf Minuten lang.

Trocknen Sie die Objektträger mit einem fusselfreien Tuch um die Flecken herum und entfernen Sie so viel Flüssigkeit wie möglich von den Flecken, indem Sie den Objektträger kippen und mit fusselfreiem Tuch trocknen. Geben Sie 50 Mikroliter 0,25%Triton X in 1XPBS zu jedem Fleck und inkubieren Sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur ohne Rühren. Waschen Sie die Objektträger in 50 bis 60 Millilitern TBS-T in einem Coplin-Glas bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren.

Dreimal für jeweils fünf Minuten. Vor dem Blockieren TBS-T abklopfen und die Objektträger mit einem fusselfreien Tuch um die Stellen herum trocknen. Entfernen Sie so viel Flüssigkeit wie möglich von der Stelle.

Wirbeln Sie die Blockierungslösung kurz ein und geben Sie dann einen Tropfen von etwa 40 Mikrolitern auf jede Stelle. Legen Sie die Objektträger in eine vorgewärmte befeuchtete Kammer und inkubieren Sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Bereiten Sie die Antikörper-Cocktails vor.

Vortexen und pipettieren Sie dann das handelsübliche Antikörperverdünnungsmittel in jedes Mikrofuge-Röhrchen. Fügen Sie den Anti-ATM-Antikörper der Ziege bei 1:1000 hinzu. Und der Kaninchen-Anti-Phosphoserin-15 p53-Antikörper bei 1:100.

Für Einzelantikörper-Kontrollexperimente werden Antikörperverdünnungen vorbereitet, die nur den Ziegen-Anti-ATM-Antikörper und nur den Kaninchen-Anti-Phosphoserin-15-p53-Antikörper enthalten. Nach Beendigung der einstündigen Inkubation klopfen Sie die Blocklösung ab, aber achten Sie darauf, dass die Zellen nicht austrocknen. Geben Sie 30 Mikroliter jeder Antikörper-Cocktail-Verdünnung hinzu und inkubieren Sie sie über Nacht in einer befeuchteten Kammer bei vier Grad Celsius.

Waschen Sie die Objektträger am Folgetag mit 1X NC2 Waschpuffer A in einem Coplin-Glas bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren zweimal für jeweils fünf Minuten. Nachdem die Objektträger zweimal mit dem Waschpuffer A gewaschen wurden, klopfen Sie den Waschpuffer von den Objektträgern ab und fügen Sie 30 Mikroliter der Proximity-Ligations-Assay-Sondenmischung zu jeder Stelle hinzu. Eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius in einer vorgewärmten Befeuchtungskammer inkubieren.

Waschen Sie die Objektträger mit 50 bis 60 Millilitern Waschpuffer A in einem Coplin-Glas bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren. Bereiten Sie als Nächstes die Ligatur-Ligase-Lösung auf Eis vor, indem Sie für jeden Spot einen Mikroliter Ligase zu 39 Mikrolitern Ligaturlösung hinzufügen. Geben Sie 40 Mikroliter der Ligaselösung auf jede Stelle.

Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius in einer vorgewärmten befeuchteten Kammer für 30 Minuten. Waschen Sie die Objektträger mit Waschpuffer A in einem Coplin-Glas bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren. Bereiten Sie die Amplifikationspolymerasemischung auf Eis vor.

Verdünnen Sie zuerst die Amplifikations-Stammlösung ein bis fünf Mal in Wasser. Und fügen Sie 0,5 Mikroliter Polymerase zu 39,5 Mikrolitern 1X Amplifikationslösung für jeden Spot hinzu. Klopfen Sie den Waschpuffer ab und fügen Sie 40 Mikroliter Amplifikationspolymerase-Mischung pro Spot hinzu.

Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius in einer vorgewärmten Befeuchtungskammer für 100 Minuten. Nach Abschluss der 100-minütigen Inkubation klopfen Sie das Amplifikationspolymerase-Gemisch ab und waschen Sie die Objektträger mit 1X NC2 Waschpuffer B in einem Coplin-Glas. Bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren zweimal für je 10 Minuten durchführen.

Danach waschen Sie die Objektträger eine Minute lang in 0,01x Waschpuffer B. Klopfen Sie überschüssigen Waschpuffer B ab und trocknen Sie die Objektträger mit einem fusselfreien Tuch um die Stellen herum. Entfernen Sie so viel Flüssigkeit wie möglich von der Stelle.

Bereiten Sie DAPI-haltiges Eindeckmedium vor, das die Zellkerne nicht überfärbt, indem Sie DAPI-haltiges Eindeckmedium 1:5 in Eindeckmittel ohne DAPI verdünnen. Geben Sie 25 bis 30 Mikroliter des verdünnten DAPI-haltigen Eindeckmediums auf einen 24 Millimeter x 24 Millimeter großen Deckglas. Nehmen Sie den Deckglas mit dem Objektträger auf und üben Sie leichten Druck aus, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen eingeschlossen sind.

Versiegeln Sie den Deckglas mit Nagellack und warten Sie mindestens 15 Minuten, bevor Sie fotografieren. Abschließend werden die Objektträger mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop abgebildet und analysiert. Der Proximity-Ligationsassay wurde verwendet, um die Interaktion zwischen ATM und Phosphoserin 15 p53 in BV 173 humanen BCR-fähigen positiven Zellen zu untersuchen, die in der G1-Phase arretiert wurden.

Im Gegensatz zu Zellen, die nicht mit NCS behandelt wurden, um DNA-Schäden zu induzieren, hatte die Mehrzahl der mit NCS behandelten Zellen punktförmige Signale ausschließlich im Zellkern mit durchschnittlich sieben Signalen pro Zelle. Dies deutet darauf hin, dass die Induktion von DNA-Schäden zu einer Wechselwirkung zwischen ATM und Phosphoserin 15 p53 führt. Die Vorbehandlung der Zellen mit einem spezifischen ATM-Kinase-Inhibitor vor der Induktion von DNA-Schäden verringerte die Anzahl der Signale auf durchschnittlich zwei Signale pro Zelle, was bestätigt, dass die Phosphorylierung von p53 am Rest Serin 15 von der ATM-Kinase-Aktivität abhängig war.

Einzelantikörper-Kontrollexperimente, bei denen entweder der Anti-ATM- oder der Anti-Phosphoserin-15-p53-Antikörper emittiert wurde, lieferten nicht wie erwartet Signale. Diese Abbildung zeigt die Quantifizierung und statistische Analyse der Ergebnisse, die die Spezifität der Proximity-Ligation-Assay-Technik auf Cytospin-Präparate von Suspensionszellkulturen demonstrieren und bestätigen. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie in etwa fünf Stunden nach einer nächtlichen Inkubation mit einem primären Antikörper durchgeführt werden, wenn sie ordnungsgemäß durchgeführt wird.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, den Antikörper sorgfältig durch Immunfluoreszenzfärbung der Zellen Ihres Interesses zu titrieren, bevor Sie einen Proximity-Ligationsassay durchführen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern in der Zellbiologie den Weg, um transiente Protein-Protein-Wechselwirkungen zu erforschen, die mit Standardmethoden wie Immunpräzipitationen und FRET-basierter Bildgebung, die oft zu technischen Artefakten führen, nur schwer zu beurteilen sind. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie einen Proximity-Ligationsassay an Suspensionszellkulturen durchführen, um die Protein-Protein-Interaktion in situ zu visualisieren und zu quantifizieren.