Das Studium der Zellzyklus-regulierten Genexpression durch zwei komplementäre Zellsynchronisationsprotokolle

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, einen Kontext für die Analyse der Genexpression in einer zellzyklusabhängigen Weise bereitzustellen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Krebsforschung zu beantworten, die sich auf zellzyklusabhängige transkriptionelle Ereignisse beziehen, die der malignen Transformation sowie der Krebsbehandlung zugrunde liegen. Der Hauptvorteil dieses Protokolls liegt darin, dass es präzise zellzyklusphasenspezifische Muster der Genexpression sowohl unter zwei definierten Bedingungen als auch nach Exposition gegenüber Chemotherapie ermittelt.

U2OS-Zellen werden für dieses Experiment verwendet und sollten am Abend gegen 19:00 Uhr in 100 Millimeter-Platten ausgesät werden, damit die nachfolgenden Schritte während der Arbeitszeit durchgeführt werden können. Die Zellen durch eine Inkubation der Platten bei 37 Grad Celsius in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % CO2 für 24 Stunden anheften lassen.

Untersuchen Sie am folgenden Tag die Zellen, um zu bestätigen, dass sie eine Konfluenz von 50 % erreicht haben. Für die Thymidin-Blockade geben Sie 100 Mikroliter einer frisch hergestellten 200 Millimolar-Thymidin-Stammlösung zu jeder 100-Millimeter-Kulturschale hinzu. Inkubieren Sie die Zellen 20 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % CO2 mit Thymidin.

Am folgenden Tag, etwa um 15 Uhr, lösen Sie die Zellen aus der Thymidin-Blockade, indem Sie das Wachstumsmedium, das Thymidin enthält, entfernen. Waschen Sie die Zellen zweimal mit vorgewärmtem 1X PBS.

Und dann 10 Milliliter komplettes Medium zu jeder 100-Millimeter-Schale hinzufügen. Die Zellen fünf Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Zur Arrestierung der Zellen in der Mitose Nocodazol auf eine Endkonzentration von 50 Nanogramm pro Milliliter zugeben.

Die Zellen mit Nocodazol nicht länger als 10 bis 11 Stunden inkubieren. Am folgenden Morgen zwischen sechs und sieben Uhr morgens die Zellen unter dem Mikroskop überprüfen, um zu bestätigen, dass sie tatsächlich im G2-M-Übergang blockiert sind, was durch ihr rundes Erscheinungsbild angezeigt wird.

Lösen Sie die mitotischen Zellen durch Schütteln jeder Platte ab, und pipettieren Sie vorsichtig das Wachstumsmedium, das Nocodazol enthält, zusammen mit den abgelösten Zellen von jeder 100-Millimeter-Platte. Vereinigen Sie die mitotischen Zellen aus allen Schalen in einem sterilen 50-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie fünf Minuten bei vier Grad Celsius mit 300 × g.

Washen Sie die Zellen zweimal, indem Sie kaltes 1X PBS hinzufügen, gefolgt von einer Zentrifugation. Nach dem Entfernen des PBS aus der zweiten Wäsche resuspendieren Sie die mitotischen Zellen in vollständigem Kulturmedium. Heben Sie zwei Milliliter für die RNA-Extraktion und zwei Milliliter für die FACS-Analyse zum Zeitpunkt null Stunden auf.

Die verbleibenden mitotischen Zellen für nachfolgende Zeitpunkte in 6-Loch-Platten erneut ansäen. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie 0,25 × 10⁶ U2OS-Zellen pro Loch in 6-Loch-Platten aussäen. Schreiben Sie auf den Deckel jeder 6-Loch-Platte die experimentelle Bedingung für jedes Loch.

Zum Beispiel unbehandelt oder mit unterschiedlichen Konzentrationen des Wirkstoffs und zu verschiedenen Zeitpunkten behandelt. Die Zellen durch eine Übernacht-Inkubation in 6-Loch-Platten anheften lassen. Am folgenden Morgen die Zellen untersuchen, um sicherzustellen, dass sie eine Konfluenz von 50 % erreicht haben.

Entfernen Sie das komplette Medium aus den Vertiefungen und geben Sie zwei Milliliter vorgewärmtes, FBS-freies DMEM-Glutamin-Medium pro Vertiefung hinzu. Inkubieren Sie die Zellen weitere 24 Stunden. Um die Zellen mit Hydroxyharnstoff zu arretieren, entfernen Sie das Medium aus den Vertiefungen und ersetzen Sie es durch frisch zubereitetes komplettes Medium, das vier Mikromolar Hydroxyharnstoff enthält.

Inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang in einem Medium, das Hydroxyharnstoff enthält. Vor dem Freisetzen der Zellen aus der durch Hydroxyharnstoff vermittelten Arrestierung überprüfen Sie die Zellen, um sicherzustellen, dass sie tatsächlich arrestiert sind. Entfernen Sie das Hydroxyharnstoff-haltige Medium aus den Vertiefungen und spülen Sie die Vertiefungen zweimal mit vorgewärmter 1X PBS aus.

Nach dem Entfernen des PBS aus der zweiten Waschung zwei Milliliter komplettes Medium pro Vertiefung hinzufügen. Die Platten bis zur Probenentnahme im Inkubator belassen. Proben aus beiden Synchronisationsprotokollen werden für die FACS-Analyse und die RNA-Extraktion auf die gleiche Weise gesammelt.

Für die FACS-Analyse spülen Sie jede Vertiefung mit zwei Milliliter vorgewärmter 1X PBS und geben dann 0,3 Milliliter vorgewärmte Trypsin-EDTA-Lösung hinzu, um die Zellen abzulösen. Nach fünf Minuten inaktivieren Sie Trypsin-EDTA durch Zugabe von einem Milliliter komplettem Medium. Sammeln Sie jede Probe in einem separaten 15-Milliliter-Röhrchen.

Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 × g bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand, waschen Sie mit 1X PBS und zentrifugieren Sie erneut. Entfernen Sie das PBS und bewahren Sie das Zellpellet auf.

Um die Zellen zu fixieren, resuspendieren Sie jedes Zellpellet in einem Milliliter gekühltem 70%igem Ethanol durch vorsichtiges Vortexen. Stellen Sie die Zellen vor der Propidiumiodid-Färbung und der FACS-Analyse etwa 15 Minuten auf Eis. Für die RNA-Extraktion entfernen Sie das Medium und spülen jedes Gefäß mit zwei Millilitern vorgewärmter 1X PBS aus.

Nehmen Sie die Platte in einen Sicherheitswerkbank und geben Sie je ein Milliliter geeignetes RNA-Isolationsreagenz pro Vertiefung hinzu. Pipettieren Sie mehrmals auf und ab, um die Zellen aufzulösen und zu lysieren, und überführen Sie anschließend jeden Zelllysate in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Inkubieren Sie fünf Minuten bei Raumtemperatur.

Beginnen Sie die RNA-Isolierung, indem Sie die Mikrozentrifugenröhrchen mit den Proben im RNA-Isolierungsreagenz aus dem Gefrierschrank entnehmen und sie innerhalb eines Sicherheitswerksbank für Chemikalien bei Raumtemperatur auftauen lassen. Geben Sie 400 µL Chloroform zu jeder Probe hinzu und schütteln Sie kräftig, ohne zu wirbeln, bis die Mischung vollständig homogen ist. Inkubieren Sie die Proben fünf Minuten bei Raumtemperatur.

Zentrifugieren Sie die Röhrchen 15 Minuten lang in einer Tischmikrozentrifuge. Überführen Sie die wässrige Phase jeder Probe in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie langsam, Tropfen für Tropfen, ein Volumen 100 %igen Ethanol zur wässrigen Phase hinzu, während Sie mischen.

Nicht zentrifugieren. Überführen Sie bis zu 700 Mikroliter jeder Probe, einschließlich eventuell gebildeten Niederschlags, in eine Säule in einem zwei Milliliter fassenden Sammelröhrchen, das in einem kommerziellen RNA-Mini-Präp-Kit enthalten ist, und schließen Sie den Deckel. Zentrifugieren Sie 15 Sekunden lang.

Entfernen Sie den Durchlauf. Wenn mit mehr als 700 Mikrolitern pro Probe begonnen wird, überführen Sie die verbleibende Probe in die Säule und zentrifugieren erneut. Nach der Reinigung der RNA gemäß den Anweisungen des Herstellers eluieren Sie jede Probe, indem Sie 30 bis 40 Mikroliter nukleasefreies Wasser in die Säule pipettieren und eine Minute bei Raumtemperatur zentrifugieren.

Bestimmen Sie die RNA-Konzentration und Reinheit der Proben mittels Absorptionsmessungen. Lagern Sie die RNA-Proben bei minus 80 Grad Celsius, bis sie für die Genexpressionsanalyse verwendet werden. Die Behandlung nach dem Thymidin-Nocodazol-Protokoll blockiert U2OS-Zellen beim Eintritt in die M-Phase und liefert eine Zellpopulation, die synchron die G1-Phase durchläuft und in die S-Phase eintritt, wie durch Durchflusszytometrie-Analyse gezeigt wird.

Die Behandlung nach dem Hydroxyharnstoff-Protokoll führt zu einer Arrestierung der Zellen an der G1/S-Grenze. Nach der Freisetzung durchlaufen die Zellen synchron die S- und G2-Phasen. Das Thymidin-Nocodazol-Protokoll eignet sich am besten zur Analyse der mRNA-Profile von Genen mit maximaler Expression während der G1-Phase.

Wie anhand der E2F1-Expression gezeigt. Im Gegensatz dazu eignet sich das Hydroxyharnstoff-Protokoll besser für die Analyse von Genen mit bevorzugter Expression in S- oder G2-Phase, wie am Beispiel der E2F7-Expression veranschaulicht. Der Zellzyklus wird typischerweise durch Antitumor-Medikamente gestört; dargestellt ist eine durch Mitomycin C verursachte dauerhafte Arrestierung in der G2-Phase in hydroxyharnstoff-synchronisierten Zellen.

Die Zell-Synchronisierung hilft dabei, Gene, die auf das Antitumor-Agens ansprechen, von solchen zu unterscheiden, die ausschließlich durch zellzyklusbedingte Störungen beeinflusst werden, die durch das Agens verursacht werden. Beispielsweise ist ein Abfall der E2F1-mRNA-Spiegel nach Behandlung mit Mitomycin C wahrscheinlich eine indirekte Wirkung des Wirkstoffs auf die Zellzyklusdynamik. Im Gegensatz dazu ist der Anstieg der p21-Cip1-mRNA-Expression nach Mitomycin-C-Behandlung direktes Ergebnis eines transkriptionellen Programms, das durch diesen Wirkstoff ausgelöst wird. Mithilfe dieses Verfahrens können genomweite transkriptomische sowie proteomische Analysen durchgeführt werden, um globale Genexpressionsänderungen aufzuklären, die bestimmte Phasen des Zellzyklus betreffen.

Entweder unter den beiden Bedingungen oder bei Anti-Tumor-Behandlungen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis der Verfahren haben, die erforderlich sind, um eine Genexpressionsanalyse in synchronisierten Zellkulturen durchzuführen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Propidiumiodid oder Reagenzien zur RNA-Isolierung äußerst gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen sowie die Verwendung eines Sicherheitswerks für Chemikalien sollten stets beachtet werden, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.