Name: Das Studium der Zellzyklus-regulierten Genexpression durch zwei komplementäre Zellsynchronisationsprotokolle (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-06T15:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Lernen Sie zwei komplementäre Zellsynchronisationsprotokolle zur Analyse zellzyklus-spezifischer Genexpression in U2OS-Zellen. Diese Methoden ermöglichen präzise Untersuchungen transkriptioneller Ereignisse in der Krebsforschung und bei Chemotherapie-Wirkungen.

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Wir danken den Mitgliedern der Zubiaga und den Altmeyer Laboratorien für hilfreiche Diskussionen und für technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des spanischen Ministeriums (SAF2015-67562-R, MINECO / FEDER, UE), der Baskischen Regierung (IT634-13 und KK-2015/89) und der Universität des Baskenlandes UPV / EHU ( UFI11 / 20).

1. Zelluläre Synchronisation, Freigabe und Überwachung der Zellzyklusprogression <ol><li> Thymidin- und Nocodazol-basierte (Thy-Noc) Synchronisation und Freisetzung von U2OS-Zellen aus Mitose <ol><li> Bereiten Sie das erforderliche Zellkulturmedium vor. U2OS-Zellen werden routinemäßig in DMEM-Glutamin-Medium, ergänzt mit 10% (vol / vol) FBS (optional: 1% Penicillin / Streptomycin), gezüchtet. Führen Sie die mittlere Vorbereitung und Manipulation unter sterilen Bedingungen durch und erwärmen Sie das komplementierte Medium (von nun an als &quot;komplettes Medium&quot;) bis 37 ° C vor dem Gebrauch aufwärmen. </li><li> Samen 2 x 10 6 U2OS Zellen pro 100 mm Schale in 10 ml vollständigem Kulturmedium. Um die Anzahl der benötigten Speisen zu berechnen, ist zu berücksichtigen, dass jede 100-mm-Schale typischerweise genügend mitotische Zellen bereitstellt, um etwa 5 Vertiefungen einer 6-Well-Platte (0,2 - 0,25 x 10 &amp; sup6; Zellen / Vertiefung) wieder aufzubauen (siehe Fig 1B ). Zwei Brunnen pro ausgewählter Zeitpunkt sind requirIm Experiment (1 Well für RNA Extraktion und 1 Well für Zellzyklusüberwachung). Zusätzlich kann eine dritte Vertiefung pro Zeitpunkt für die Proteinanalyse gesammelt werden. HINWEIS: Tellerzellen am Abend (ca. 19 Uhr), so dass nachfolgende Schritte während der Arbeitszeit in den folgenden Tagen durchgeführt werden können. Include 2 zusätzliche Brunnen von asynchron wachsenden Zellen, um die FACS-Analysekompensationseinstellungen zu definieren. </li><li> Lassen Sie die Zellen durch Inkubieren von 100 mm-Schalen bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO 2 für 24 h anhängen. </li><li> Für den Thymidinblock wird eine 200 mM Thymidin-Stammlösung durch Auflösen von 145,2 mg Thymidinpulver in 3 ml H 2 O (oder äquivalenten Mengen) hergestellt und die Lösung durch Filtration durch ein 0,2 μm Porengrßenfilter sterilisiert. Leichte Erwärmung könnte helfen, Thymidin aufzulösen. 100 μl des frisch zubereiteten 200 mM Stammes zu jeder 100 mm Kulturschale (Endkonzentration 2 mM) geben. Inkubieren von Zellen mit Thymidin für 20 h bei 3776, C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO 2 . HINWEIS: Behandeln Sie Zellen am Abend (um 7 Uhr), um Zeit zu haben, sowohl Thymidin-Freisetzung als auch Nocodazol-Block am nächsten Tag durchzuführen. </li><li> Um aus dem Thymidin-Block freizusetzen, entfernen Sie Thymidin-haltiges Wachstumsmedium am Nachmittag des folgenden Tages (15 Uhr); Waschen Sie die Zellen zweimal mit vorgewärmtem 1x PBS und fügen Sie 10 ml vollständiges Medium zu jeder 100 mm Schale hinzu. Inkubieren von Zellen für 5 h bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO 2 . </li><li> Für den mitotischen Zellarrest fügen Sie Nocodazol zu einer Endkonzentration von 50 ng / ml (20 Uhr) hinzu. Eine Stammlösung durch Auflösen von Nocodazolpulver in DMSO ( zB 5 mg / ml) zubereiten und bei -20 ° C gefroren aufbewahren. Inkubieren von Zellen mit Nocodazol für nicht länger als 10 - 11 h bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO 2 . </li><li> Freisetzung aus dem Nocodazol-vermittelten Arrest in der frühen M-Phase (mitotisches Shake-off) und Sammlung von Proben zu mehrmals poiNts (ab 6-7 Uhr). <ol><li> Abgerundete (mitotische) Zellen durch Schütteln jeder Platte und sanftes Pipettieren von nocodazolhaltigem Wachstumsmedium abziehen. Sammeln Sie das Medium mit abgelösten Zellen von jeder 100 mm-Platte in 50 ml sterile Röhrchen, zentrifugieren Sie (300 xg, 5 min, Raumtemperatur (RT)) und waschen Sie die Zellen zweimal, indem Sie 1x PBS hinzufügen, gefolgt von Zentrifugation. Die Verwendung von kaltem PBS oder PBS plus Nocodazol wird empfohlen, um mitotischen Schlupf zu vermeiden (siehe Diskussionsteil). </li><li> Resonieren Sie mitotische Zellen, die aus jeder 100 mm Platte in 10 ml vollständigem Medium gewonnen wurden. Sparen Sie 2 ml für die RNA-Extraktion und 2 ml für die FACS-Analyse für den 0-h-Zeitpunkt (ca. 0,2-0,25 x 10 6 Zellen pro Probe). </li><li> Wiederholte verbleibende mitotische Zellen für nachfolgende Zeitpunkte in 6-Well-Platten (2 ml / Vertiefung, 0,2-0,25 x 10 &amp; sup6; Zellen / Vertiefung). HINWEIS: Denken Sie daran, dass 2 ausgewählte Zeitpunkte (1 für RNA und 1 für die FACS-Analyse) benötigt werden. </li></ol></li><li> Sammle Proben bei selZeitpunkte. Alle 1,5 bis 3 h werden empfohlen, um ein adäquates Profil der Zellzyklusprogression zu erhalten. <ol><li> Für die RNA-Extraktion, entfernen Sie das Medium, spülen Sie gut mit 2 ml vorwärmenden 1x PBS aus und fügen Sie 1 ml des geeigneten RNA-Isolationsreagenzes ( zB TRIzol) in den Brunnen hinzu (führen Sie diesen letzten Schritt in einem Sicherheitsschrank für Chemikalien) durch. Pipettieren Sie nach oben und unten, um Zellen zu lindern und zu lysieren, übertragen Sie das Zelllysat in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, inkubieren Sie 5 min bei RT und speichern Sie das Röhrchen bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung. </li><li> Für die FACS-Analyse mit 2 ml vorwärmendem 1x PBS gut ausspülen, vorgewärmte Trypsin-EDTA-Lösung (0,3 ml / Vertiefung) abgeben, um Zellen zu entfernen, Trypsin-EDTA zu blockieren, indem man 1 ml vollständiges Medium zugibt und jede Probe in einem separaten sammelt 15 ml Rohr. <ol><li> Zentrifugen von Zellen (300 xg, 5 min, RT), retten zelluläres Pellet und verwerfen den Überstand. Um Zellen zu fixieren, werden die Zellen in 1 ml gekühltem 70% (v / v) Ethanol in 1x PBS durch sanftes Vortexen von Röhrchen resuspendiert und auf Eis gelegtEtwa 15 min vor der Lagerung bei 4 ° C oder zur Färbung zur weiteren Analyse durch FACS (beschrieben in den Schritten 1.4 - 1.5). </li></ol></li></ol></li></ol></li><li> HU-basierte Synchronisation und Freisetzung von U2OS-Zellen aus G1 / S-Grenze <ol><li> Vorbereiten des vollständigen Zellkulturmediums, wie in Schritt 1.1 beschrieben. </li><li> Samen 0,25 x 10 &amp; sup6; U2OS-Zellen pro Vertiefung in 6-Well-Platten (2 ml vollständiges Kulturmedium pro Vertiefung). Um die für das Experiment benötigte Anzahl von Bohrlöchern zu berechnen, ist zu berücksichtigen, dass für einen ausgewählten Zeitpunkt 2 Vertiefungen erforderlich sind (1 Well für die RNA-Extraktion und 1 Well für die Zellzyklusüberwachung) und dass 2 zusätzliche Wells von asynchron wachsenden Zellen sind Benötigt, um die Einstellungen der FACS-Analyse zu definieren. </li><li> Die Zellen werden durch Inkubieren von 6-Well-Platten über Nacht (O / N) bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO 2 gebunden. </li><li> Entfernen Sie das komplette Medium aus den Brunnen am nächsten Morgen und fügen Sie 2 ml hinzuVon vorgewärmtem FBS-freiem DMEM-Glutamin-Medium pro Vertiefung. Inkubieren von Zellen für weitere 24 h bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO 2 . HINWEIS: Führen Sie diesen Schritt in allen Vertiefungen mit Ausnahme von 2 (die gespeichert, um FACS-Einstellungen zu definieren). Der Serumentzugsschritt kann weggelassen werden, wenn eine effiziente Synchronisation durch einfaches Inkubieren von Zellen mit HU erreicht wird. </li><li> G1 / S-Zellzyklus verhaftet mit HU. <ol><li> Vor dem Gebrauch eine frische HU-Stammlösung (500 mM) vorbereiten. 2 ml H 2 O zu 76,06 mg HU-Pulver zugeben und mischen, bis es gut aufgelöst ist. Sterilisieren der Lösung durch Filtration durch ein 0,2 μm Porengrßenfilter. Mischen Sie 50 ml vollständiges Medium mit 400 μl Filter-sterilisierter HU-Stammlösung für eine endgültige HU-Konzentration von 4 mM. </li><li> Entfernen Sie das Medium aus allen Vertiefungen, außer aus den 2 Vertiefungen, die für die Definition der FACS-Einstellungen erforderlich sind, und ersetzen Sie es durch ein frisch zubereitetes 4 mM HU-haltiges vollständiges Medium (2 ml / Vertiefung). </li><li> Inkubieren von Zellen für 24 h inHU-haltiges Medium bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO 2 . </li></ol></li><li> Freisetzung von Zellen aus HU-vermittelter Verhaftung. HU-haltiges Medium aus den Brunnen entfernen und die Wells zweimal mit vorgewärmtem 1x PBS (jeweils 2 ml) abspülen. 2 ml Vollmedium pro Vertiefung zugeben. Sammeln Sie 2 Proben für den 0-h-Zeitpunkt (1 für die RNA-Extraktion und 1 für die Zellzyklus-Verhaftungsüberprüfung durch FACS) sowie 2 Samples, die für die FACS-Einstellungen gespeichert wurden. Legen Sie die restlichen Brunnen in den Inkubator. </li><li> Sammle Proben alle 1,5 bis 3 Stunden, um eine adäquate Verteilung der Zellzyklusprogression zu erhalten. Zu jedem Zeitpunkt die Probenverarbeitung durchführen (für die RNA-Extraktion und für die FACS-Analyse), wie in 1.1.8.1-1.1.8.2 beschrieben. </li></ol></li><li> Behandlung mit DNA-schädigenden Mitteln HINWEIS: Immer wenn es darum geht, die Wirkung einer Verbindung ( zB DNA-schädigende Agenzien) in Zellzyklus-Ereignissen zu ermitteln, kann jede der zuvor beschriebenen Synchronisationsmethoden seinKombiniert mit der Behandlung von Zellen mit dem genotoxischen Mittel. Um die Synchronisationsmethode zu wählen, ist es wichtig, die Phase des Zellzyklus zu betrachten, die wir analysieren möchten. Im Allgemeinen kann das Thy-Noc-Verfahren geeignet sein, die Wirkung einer Verbindung in der G1-Phase oder des S-Phaseneintrags zu untersuchen, während die HU-vermittelte Synchronisation geeigneter ist, um den Einfluss in S bis G2-Phasen oder im Eintritt zur Mitose zu untersuchen. <ol><li> Analyse der Wirkung von genotoxischen Mitteln in G1-Phase oder S-Phase-Eintritt <ol><li> Synchronisieren Sie die Zellen wie in 1.1.2 beschrieben. Bis 1.1.6. </li><li> Die Zellen aus Nocodazol freisetzen und wie in 1.1.7 beschrieben wieder aufplatten. Inkubieren sie bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO 2 für 3 h, um sie vor dem Hinzufügen von Mitteln zuzugeben (erforderliche Inkubationszeit kann je nach Zelllinie variieren). </li><li> Add Agent und sammeln Proben wie zuvor in 1.1.8 beschrieben. </li></ol></li><li> Analyse der Wirkung von Genotoxika in SG2 Phasen oder M Eintrag <ol><li> Synchronisieren Sie die Zellen wie in 1.2.2 beschrieben. Bis 1.2.5. </li><li> Freisetzen von Zellen aus HU, wie in 1.2.6 beschrieben. Und Agent sofort hinzufügen. </li><li> Sammle Proben wie oben in 1.8 beschrieben. </li></ol></li></ol></li><li> Überwachung der Zellsynchronisation und -progression durch den Zellzyklus durch Propidiumjodid (PI) -Färbung und FACS-Analyse HINWEIS: Proben, die zu allen Zeitpunkten gesammelt wurden, zusammen mit denen, die zur Definition von FACS-Einstellungen erforderlich sind, können bei 4 ° C gespeichert werden, sobald sie fixiert sind (wie in 1.1.8.2 erwähnt). Färben Sie die Färbung mit PI-Lösung, gefolgt von der FACS-Analyse für alle Proben des Experiments gleichzeitig. PI interkaliert in die Hauptrille von doppelsträngiger DNA, die ein hochfluoreszierendes Signal erzeugt, wenn sie bei 535 nm mit einem breiten Emissionspeak um 600 nm angeregt wird. Da PI auch an doppelsträngige RNA binden kann, ist es notwendig, die Zellen mit RNase für eine optimale DNA-Auflösung zu behandeln. <ol><li> Frisch hergestellte PI-Färbelösung vorbereiten. Eine PI-Stammlösung kann durch Auflösen von PI-Pulver in PBS ( zB 5 mg / ml) hergestellt werden. Lagern Sie die Stammlösung bei 4 ° C (in Dunkelheit). Die Färbelösung besteht aus PI (140 μM), Natriumcitrat (38 mM) und Triton X-100 (0,01% v / v). </li><li> Aufwärmen einer geeigneten Oberfläche ( zB Backofen) auf 37 ° C. </li><li> Zentrifugen feste Zellen (450 xg, 5 min, RT), dekantierender Überstand (Ethanol) und einmal mit 1x PBS waschen. </li><li> Zentrifugieren Sie Zellen erneut, entfernen Sie PBS und fügen Sie 300 μl PI-Färbelösung pro Probe hinzu (mit Ausnahme einer der Proben für FACS-Einstellungen), addieren Sie PBS zu dieser Probe stattdessen. </li><li> Übertragen von Zellen auf FACS-Röhrchen (5 ml Rundboden-Polystyrol-Röhrchen). </li><li> Füge 1 μl RNase A zu jeder Probe hinzu, mischen und inkubiere die Proben für 30 min in Dunkelheit bei 37 ° C. Proben können bei 4 ° C für ein Maximum von 2 - 3 Tagen vor Licht geschützt geschützt werden. </li><li> Analysieren Sie den DNA-Gehalt in Proben nach DurchflussZytometrie Definieren Sie die FACS-Analysekompensationseinstellungen mit PI-gefärbten asynchronen Samples. Verwenden Sie eine Blindprobe (ohne PI-Färbelösung), um die Autofluoreszenz zu überprüfen. Grundlagen der PI-färbungsvermittelten Analyse des DNA-Gehalts durch Durchflusszytometrie wurden zuvor beschrieben 9 . </li></ol></li><li> Bestimmung des mitotischen Index durch doppelte Phospho-H3 (Ser 10) / PI-Färbung HINWEIS: Zellen, die sich einer Mitose unterziehen, können leicht durch Durchflusszytometrie mit Antikörpern identifiziert werden, die für Phospho-Histon H3 in Serin 10 (pH 3) spezifisch sind. Eine gleichzeitige PI-Färbung ist nützlich, um die DNA-inhaltsbasierte Verteilung der Zellpopulation zu bestimmen. Für die optimalen Konfigurationen der FACS-Einstellungen sind 5 Samples erforderlich: leer, nur PI-nur, pH3-only, sekundärer Antikörper und doppelte Färbung. <ol><li> Zentrifugierte feste Zellen (450 xg, 5 min, 4 ° C) und verwerfen den Überstand. Die folgenden Schritte werden beschrieben, um eine Färbung in 15 ml Röhrchen durchzuführen. </li><li> Waschen von Zellen durch Zugabe von 1Ml PBS-T (PBS + 0,05% Tween-20) zum Pellet und Zentrifuge (450 xg, 5 min, 4 ° C). Den Überstand entfernen. </li><li> Füge anti-pH3-Antikörper, verdünnt (1: 500), in 100-200 &amp; mgr; l PBS-T + 3% BSA zu und inkubiere mit einem Kippen für 2 h bei RT (oder O / N bei 4 ° C). </li><li> 2 ml PBS-T (PBS + 0,05% Tween-20) zugeben und zentrifugieren (450 xg, 5 min, 4 ° C). Den Überstand entfernen. </li><li> Waschen Sie noch einmal durch Zugabe von 2 ml PBS-T zum Pellet, zentrifugieren und verwerfen Sie den Überstand. </li><li> Sekundär-Antikörper (Anti-Kaninchen-AlexaFluor 488 im Falle eines ausgewählten pH3-Antikörpers) verdünnt (1: 500) in 100-200 &amp; mgr; l PBS-T + 3% BSA und inkubieren mit Kokern für 1 h bei RT (oder O / N Bei 4 ° C). Schützen Sie die Proben vor Licht. </li><li> Waschen Sie zweimal mit PBS-T (2 ml) durch Zentrifugation wie in Schritt 1.5.4 beschrieben. </li><li> Führen Sie die PI-Färbung wie beschrieben durch (Schritte 1.4.1 bis 1.4.6). </li></ol></li></ol> 2. Probenentnahme und -verarbeitung für die Genexpressionsanalyse <ol><li> Nehmen1,5 mL Mikrozentrifugenproben im RNA-Isolationsreagenz aus dem Gefrierschrank und lassen sie bei RT in einem Sicherheitsschrank für Chemikalien auftauen. </li><li> Füge 400 μl Chloroform zu jeder Probe hinzu und schüttele kräftig (aber nicht vortexen) bis zum vollständigen Mischen. Inkubieren Sie die Proben für 5 min bei RT. </li><li> Zentrifugenröhrchen für 15 min (≥ 8000 xg, 4 ° C) in einer Tischzentrifuge zentrifugieren. </li><li> Übertragen Sie die wässrige (obere) Phase auf ein neues 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen und registrieren Sie das übertragene Volumen (um das Verfahren zu vereinfachen, empfiehlt es sich, in allen Proben des Experiments gleiche Volumina zu sammeln). </li><li> Füge 1 Volumen von 100% Ethanol langsam (tropfenweise) in die wässrige Phase während des Mischens zu. Nicht zentrifugieren </li><li> Führen Sie die nächsten Schritte mit dem kommerziellen RNA Mini Prep Kit. Pipetieren Sie bis zu 700 μl jeder Probe, einschließlich aller Niederschläge, die sich gebildet haben können, in eine Spinsäule in einem 2 ml Sammelröhrchen (vom Hersteller bereitgestellt). </li><li> SchließeDeckel und Zentrifuge (≥ 8.000 g, RT) für 15 s. Verwerfe den Durchfluss. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt mit dem restlichen Sample (falls vorhanden). </li><li> Befolgen Sie die Anweisungen der Hersteller für die RNA-Reinigung und Elution (eluieren Sie jede Probe in 30 - 40 μl nukleasefreies H 2 O, um eine geeignete RNA-Konzentration für den nächsten Schritt zu erreichen). </li><li> Bestimmen Sie die RNA-Konzentration und die Reinheit der Proben durch Absorptionsmessungen (ein A 260/280 -Verhältnis von 2,0-2,1 zeigt eine gute Reinheit der RNA-Probe an). RNA-Proben bei -80 ° C bis zur Verwendung für RT-qPCR-Analyse aufbewahren. </li><li> Für die RNA-Umwandlung in cDNA und nachfolgende quantitative PCR nehmen Sie 1 μg RNA pro Probe und bereiten die Retrotranskriptase-Reaktion gemäß den Anweisungen des Herstellers vor. Erhaltene cDNA-Proben können bei 4 ° C (für ein paar Tage) oder bei -20 ° C (für längere Zeit) gelagert werden. HINWEIS: Probenvorbereitung, Grundierung und andere Überlegungen für Echtzeit-PCR sind exSpannend in der Literatur 22 , 23 beschrieben. </li></ol>

<ol><li>Beato, M., Sánchez-Aguilera, A., Piris, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+deregulation+in+B-cell+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Cell cycle deregulation in B-cell lymphomas.</a> Blood. 101 (4), 1220-1235 (2003).</li>
<li>Chen, H. Z., Tsai, S. Y., Leone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+E2Fs+in+cancer%3A+an+exit+from+cell+cycle+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of E2Fs in cancer: an exit from cell cycle control.</a> Nat Rev Cancer. 9 (11), 785-797 (2009).</li>
<li>Cho, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+and+function+during+the+human+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation and function during the human cell cycle.</a> Nat Genet. 27 (1), 48-54 (2001).</li>
<li>Peña-Diaz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+profiling+during+the+cell+cycle+shows+that+a+subset+of+Polycomb-targeted+genes+is+upregulated+during+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Transcription profiling during the cell cycle shows that a subset of Polycomb-targeted genes is upregulated during DNA replication.</a> Nucleic Acids Res. 41 (5), 2846-2856 (2013).</li>
<li>Grant, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+cell+cycle-regulated+genes+periodically+expressed+in+U2OS+cells+and+their+regulation+by+FOXM1+and+E2F+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of cell cycle-regulated genes periodically expressed in U2OS cells and their regulation by FOXM1 and E2F transcription factors.</a> Mol Biol Cell. 24 (23), 3634-3650 (2013).</li>
<li>Minderman, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+irinotecan-induced+changes+in+expression+profiles+of+cell+cycle+and+apoptosis-associated+genes+in+acute+myeloid+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo irinotecan-induced changes in expression profiles of cell cycle and apoptosis-associated genes in acute myeloid leukemia cells.</a> Mol Cancer Ther. 4 (6), 885-900 (2005).</li>
<li>McKenna, E., Traganos, F., Zhao, H., Darzynkiewicz, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+DNA+damage+caused+by+low+levels+of+mitomycin+C+induces+irreversible+cell+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Persistent DNA damage caused by low levels of mitomycin C induces irreversible cell senescence.</a> Cell Cycle. 11 (16), 3132-3140 (2012).</li>
<li>Infante, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E2F2+represses+cell+cycle+regulators+to+maintain+quiescence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">E2F2 represses cell cycle regulators to maintain quiescence.</a> Cell Cycle. 7 (24), 3915-3927 (2008).</li>
<li>Cecchini, M. J., Amiri, M., Dick, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cell+cycle+position+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of cell cycle position in mammalian cells.</a> J Vis Exp. (59), (2012).</li>
<li>Schorl, C., Sedivy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cell+cycle+phases+and+progression+in+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of cell cycle phases and progression in cultured mammalian cells.</a> Methods. 41 (2), 143-150 (2007).</li>
<li>Lalande, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reversible+arrest+point+in+the+late+G1+phase+of+the+mammalian+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A reversible arrest point in the late G1 phase of the mammalian cell cycle.</a> Exp Cell Res. 186 (2), 332-339 (1990).</li>
<li>Park, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mimosine+arrests+the+cell+cycle+prior+to+the+onset+of+DNA+replication+by+preventing+the+binding+of+human+Ctf4%2FAnd-1+to+chromatin+via+Hif-1%CE%B1+activation+in+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Mimosine arrests the cell cycle prior to the onset of DNA replication by preventing the binding of human Ctf4/And-1 to chromatin via Hif-1α activation in HeLa cells.</a> Cell Cycle. 11 (4), 761-766 (2012).</li>
<li>Ikegami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aphidicolin+prevents+mitotic+cell+division+by+interfering+with+the+activity+of+DNA+polymerase-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Aphidicolin prevents mitotic cell division by interfering with the activity of DNA polymerase-alpha.</a> Nature. 275 (5679), 458-460 (1978).</li>
<li>Baranovskiy, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+inhibition+of+DNA+replication+by+aphidicolin%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Structural basis for inhibition of DNA replication by aphidicolin.</a> Nucleic Acids Res. 42 (22), 14013-14021 (2014).</li>
<li>Adams, R. L., Lindsay, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxyurea+reversal+of+inhibition+and+use+as+a+cell-synchronizing+agent%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Hydroxyurea reversal of inhibition and use as a cell-synchronizing agent.</a> J Biol Chem. 242 (6), 1314-1317 (1967).</li>
<li>Mitxelena, J., Apraiz, A., Vallejo-Rodríguez, J., Malumbres, M., Zubiaga, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E2F7+regulates+transcription+and+maturation+of+multiple+microRNAs+to+restrain+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">E2F7 regulates transcription and maturation of multiple microRNAs to restrain cell proliferation.</a> Nucleic Acids Res. , (2016).</li>
<li>Bootsma, D., Budke, L., Vos, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+synchronous+division+of+tissue+culture+cells+initiated+by+excess+thymidinE%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Studies on synchronous division of tissue culture cells initiated by excess thymidinE.</a> Exp Cell Res. 33, 301-309 (1964).</li>
<li>Galgano, P. J., Schildkraut, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G1%2FS+Phase+Synchronization+using+Double+Thymidine+Synchronization%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">G1/S Phase Synchronization using Double Thymidine Synchronization.</a> CSH Protoc. (2), (2006).</li>
<li>Edwin Taylor, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+inhibition+and+the+binding+of+h3-colchicine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Kinetics of inhibition and the binding of h3-colchicine.</a> J Cell Biol. 25, 145-160 (1965).</li>
<li>Zieve, G. W., Turnbull, D., Mullins, J. M., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+large+numbers+of+mitotic+mammalian+cells+by+use+of+the+reversible+microtubule+inhibitor+nocodazole.+Nocodazole+accumulated+mitotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Production of large numbers of mitotic mammalian cells by use of the reversible microtubule inhibitor nocodazole. Nocodazole accumulated mitotic cells.</a> Exp Cell Res. 126 (2), 397-405 (1980).</li>
<li>Matsui, Y., Nakayama, Y., Okamoto, M., Fukumoto, Y., Yamaguchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+cell+populations+in+metaphase%2C+anaphase%2C+and+telophase+by+synchronization+using+nocodazole+and+blebbistatin%3A+a+novel+method+suitable+for+examining+dynamic+changes+in+proteins+during+mitotic+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Enrichment of cell populations in metaphase, anaphase, and telophase by synchronization using nocodazole and blebbistatin: a novel method suitable for examining dynamic changes in proteins during mitotic progression.</a> Eur J Cell Biol. 91 (5), 413-419 (2012).</li>
<li>Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17406449">Quantification of mRNA using real-time RT-PCR.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1559-1582 (2006).</li>
<li>Thornton, B., Basu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+PCR+%28qPCR%29+primer+design+using+free+online+software%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">Real-time PCR (qPCR) primer design using free online software.</a> Biochem Mol Biol Educ. 39 (2), 145-154 (2011).</li>
<li>Abbas, T., Dutta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p21+in+cancer%3A+intricate+networks+and+multiple+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">p21 in cancer: intricate networks and multiple activities.</a> Nat Rev Cancer. 9 (6), 400-414 (2009).</li>
<li>Kung, A. L., Sherwood, S. W., Schimke, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+line-specific+differences+in+the+control+of+cell+cycle+progression+in+the+absence+of+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cell line-specific differences in the control of cell cycle progression in the absence of mitosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (24), 9553-9557 (1990).</li>
<li>Borel, F., Lacroix, F. B., Margolis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+arrest+of+mammalian+cells+at+the+G1%2FS+boundary+results+in+permanent+S+phase+stasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci.+115+%28Pt%22%5BJournal%5D)">Prolonged arrest of mammalian cells at the G1/S boundary results in permanent S phase stasis.</a> J Cell Sci. 115 (Pt. 14, 2829-2838 (2002).</li>
<li>Knehr, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+appraisal+of+synchronization+methods+applied+to+achieve+maximal+enrichment+of+HeLa+cells+in+specific+cell+cycle+phases%29%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A critical appraisal of synchronization methods applied to achieve maximal enrichment of HeLa cells in specific cell cycle phases).</a> Exp Cell Res. 217 (2), 546-553 (1995).</li>
<li>Zhu, W., Giangrande, P. H., Nevins, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E2Fs+link+the+control+of+G1%2FS+and+G2%2FM+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">E2Fs link the control of G1/S and G2/M transcription.</a> EMBO J. 23 (23), 4615-4626 (2004).</li>
<li>Whitcomb, E. A., Dudek, E. J., Liu, Q., Taylor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+control+of+S+phase+of+the+cell+cycle+by+ubiquitin-conjugating+enzyme+H7%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Novel control of S phase of the cell cycle by ubiquitin-conjugating enzyme H7.</a> Mol Biol Cell. 20 (1), 1-9 (2009).</li>
<li>Bruinsma, W., Macurek, L., Freire, R., Lindqvist, A., Medema, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bora+and+Aurora-A+continue+to+activate+Plk1+in+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Bora and Aurora-A continue to activate Plk1 in mitosis.</a> J Cell Sci. 127, 801-811 (2014).</li>
<li>Thomas, D. B., Lingwood, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+cell+cycle+control%3A+effects+of+thymidine+on+synchronous+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A model of cell cycle control: effects of thymidine on synchronous cell cultures.</a> Cell. 5 (1), 37-42 (1975).</li>
<li>Whitfield, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+periodically+expressed+in+the+human+cell+cycle+and+their+expression+in+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors.</a> Mol Biol Cell. 13 (6), 1977-2000 (2002).</li>
<li>Lim, S., Cdks Kaldis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cyclins+and+CKIs%3A+roles+beyond+cell+cycle+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">cyclins and CKIs: roles beyond cell cycle regulation.</a> Development. 140 (15), 3079-3093 (2013).</li>
<li>Tapia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+mitosis-specific+antibodies%2C+MPM-2+and+phospho-histone+H3+%28Ser28%29%2C+allow+rapid+and+precise+determination+of+mitotic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Surg+Pathol%22%5BJournal%5D)">Two mitosis-specific antibodies, MPM-2 and phospho-histone H3 (Ser28), allow rapid and precise determination of mitotic activity.</a> Am J Surg Pathol. 30 (1), 83-89 (2006).</li>
<li>Andreassen, P. R., Martineau, S. N., Margolis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+induction+of+mitotic+checkpoint+override+in+mammalian+cells+results+in+aneuploidy+following+a+transient+tetraploid+state%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Chemical induction of mitotic checkpoint override in mammalian cells results in aneuploidy following a transient tetraploid state.</a> Mutat Res. 372 (2), 181-194 (1996).</li>
<li>Wei, F., Xie, Y., He, L., Tao, L., Tang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERK1+and+ERK2+kinases+activate+hydroxyurea-induced+S-phase+checkpoint+in+MCF7+cells+by+mediating+ATR+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signal%22%5BJournal%5D)">ERK1 and ERK2 kinases activate hydroxyurea-induced S-phase checkpoint in MCF7 cells by mediating ATR activation.</a> Cell Signal. 23 (1), 259-268 (2011).</li>
<li>Kubota, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+prereplication+complex+is+blocked+by+mimosine+through+reactive+oxygen+species-activated+ataxia+telangiectasia+mutated+%28ATM%29+protein+without+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Activation of the prereplication complex is blocked by mimosine through reactive oxygen species-activated ataxia telangiectasia mutated (ATM) protein without DNA damage.</a> J Biol Chem. 289 (9), 5730-5746 (2014).</li>
<li>Hartwell, L. H., Weinert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Checkpoints%3A+controls+that+ensure+the+order+of+cell+cycle+events%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Checkpoints: controls that ensure the order of cell cycle events.</a> Science. 246 (4930), 629-634 (1989).</li>
<li>St-Denis, N. A., Derksen, D. R., Litchfield, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+regulation+of+mitotic+progression+through+temporal+phosphorylation+and+dephosphorylation+of+CK2alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Evidence for regulation of mitotic progression through temporal phosphorylation and dephosphorylation of CK2alpha.</a> Mol Cell Biol. 29 (8), 2068-2081 (2009).</li>
<li>Min, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAD51C-deficient+cancer+cells+are+highly+sensitive+to+the+PARP+inhibitor+olaparib%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">RAD51C-deficient cancer cells are highly sensitive to the PARP inhibitor olaparib.</a> Mol Cancer Ther. 12 (6), 865-877 (2013).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Analyse von Feinabstimmungsregulierten Genen, die an transienten und spezifischen Rollen im Zellzyklus beteiligt sind, erfordert eine einheitliche Zellpopulation. Viele Forscher verwenden routinemäßig langjährige Tumorzelllinien für diese Zwecke und es wurden verschiedene Methoden entwickelt, um synchrone (oder teilweise synchrone) Zellpopulationen zu erhalten, mit dem Ziel, möglichst viele Zellen in definierten Zellzyklusphasen zu akkumulieren. Darüber hinaus wurden starke Anstrengungen unternommen, um bewährte Syn...

Der Übergang durch alle Phasen des Zellzyklus ist an ein streng reguliertes Genexpressionsprogramm gekoppelt. Dieses koordinierte &quot;On und Off&quot; der Gen-Transkription im gesamten Zellzyklus wird vermutlich unter der Kontrolle von komplexen Transkriptionsregulationssystemen liegen, was nicht nur das Timing, sondern auch die Ebenen der Genexpression reguliert. Die Deregulierung von Schlüssel-Zell-Zyklus-Komponenten ist bekannt, um zur Entwicklung von mehreren Krankheiten beitragen und ist ein etabliertes Kennzeichen der Tumorigenese 1 , 2 . Genom-weite transkriptomische Analysen, die in Hefe- und Säugetierzellen durchgeführt wurden, haben ergeben, dass eine große Anzahl von Genen periodische Genexpressionsmuster im Zellzyklus aufweisen, was darauf hindeutet, dass die Transkriptionsfluktuation während des Zellzyklus eine Reflexion der zeitlichen Anforderung eines gegebenen Genprodukts ist In einer präzisen Phase 3 , 4 , </suP&gt; 5 Eine wesentliche Aufgabe bei der Untersuchung der zellzyklusregulierten Genexpression ist die Synchronisation von Zellen in spezifische Zellzyklusphasen. Die Zellsynchronisation hilft, die Assoziation eines Genexpressionsmusters auf einen bestimmten Zellzyklus-Phasenübergang zu interpretieren, und es hat zu einem besseren Verständnis der Regulation und Funktion zahlreicher Gene geführt. Die Zellsynchronisation ist auch wichtig für die Untersuchung des Wirkmechanismus von Antikrebsarzneimitteln, da bekannt ist, dass Chemotherapeutika sowohl die Genexpression als auch die Zellzykluskinetik 6 , 7 beeinflussen. Trotzdem ist es oft schwierig zu bestimmen, ob die aus der Behandlung mit diesen Mitteln resultierenden Genexpressionsdifferenzen eine direkte Reaktion auf die Behandlung sind oder lediglich die Folge von Veränderungen der Zellzyklusprofile sind. Um zwischen diesen Möglichkeiten zu unterscheiden, sollte die Genexpression in Zellen analysiert werden, die s gewesen sindYnchronisiert vor der Zugabe des chemotherapeutischen Arzneimittels. Mit Ausnahme von einigen primären Zellen wie frisch isolierten lymphatischen Zellen, die eine homogene Zellpopulation darstellen, die in G0 8 synchronisiert ist, wachsen in vitro etablierte Zelllinien asynchron in Kultur. Unter regelmäßigen Wachstumsbedingungen finden sich diese asynchron zyklischen Zellen in allen Phasen des Zellzyklus, aber bevorzugt in G1 9 . Daher bietet dieser Kontext kein optimales Szenario für Funktions- oder Genexpressionsanalysen in einer bestimmten Zellzyklusphase ( zB G1, S etc.). Nicht transformierte immortalisierte Zelllinien ( zB Fibroblasten) können mit sogenannten physiologischen Methoden synchronisiert werden 10 . Diese Methoden basieren auf den beibehaltenen primären Zellmerkmalen von nicht-transformierten Zellen, wie z. B. Zell-Kontakt-Inhibition und Wachstumsfaktor-Abhängigkeit, um den Zyklus fortzusetzen. EntfernungDes Serums in Kombination mit Kontaktinhibierung macht nicht-transformierte Zellen bei G0 / G1 verhaftet. Der synchronisierte Zellzykluseintrag und die Progression erfordert jedoch oft eine Subkultur, die auch eine künstliche Ablösung der Zellen und eine erneute Plattierung beinhaltet. Am wichtigsten ist, dass dieses Verfahren nicht für die Synchronisation von transformierten Zelllinien geeignet ist, wobei die überwiegende Mehrheit der etablierten Zelllinien, die gegenwärtig verwendet werden, dadurch gekennzeichnet ist, dass sie keine Zellkontakt-vermittelte Wachstumshemmung oder Reaktion auf Wachstumsfaktorentzug haben. So ist es klar, dass alternative Verfahren für eine effiziente Zellsynchronisation in bestimmten Phasen des Zellzyklus erforderlich sind. Im Allgemeinen basieren die am häufigsten verwendeten Synchronisationsmethoden auf einer transienten chemischen oder pharmakologischen Hemmung eines definierten Punktes des Zellzyklus, typischerweise DNA-Synthese oder mitotischer Spindelbildung. Die Hemmung der DNA-Synthese synchronisiert die Zellen, indem sie sie in der späten G1- oder frühen S-Phase festnehmen. Das kann achi seinDurch die Zugabe von Verbindungen wie Mimosin, einem Inhibitor der Nukleotidbiosynthese 11 , 12 , Aphidicolin, einem Inhibitor der DNA-Polymerasen 13 , 14 , Hydroxyharnstoff, einem Inhibitor der Ribonukleotidreduktase 15 , 16 oder durch überschüssige Mengen an Thymidin 17 , 18, Andererseits sind Inhibitoren der Mikrotubuluspolymerisation, wie Colchicin oder Nocodazol, in der Lage, die mitotische Spindelbildung zu blockieren, die zu einer Zellsynchronisation in der frühen M-Phase 19 , 20 , 21 führt . In dieser Arbeit beschreiben wir eine Methode, die zwei komplementäre Synchronisationsprotokolle umfasst, die auf einer transienten chemischen Inhibition basieren, um die Expression von zellzyklusregulierten Genen an der mRNA zu untersuchenEbene. Diese Methode ist grundlegend für die Definition der Rolle von Zellzyklus-Genen in bestimmten Zellzyklus-Prozesse. Darüber hinaus bietet es einen allgemeinen Rahmen für das Studium der Auswirkungen von Antikrebs-Behandlungen, um genau zu erkennen, Droge reagierende Gene und zu minimieren Fehlinterpretationen aus Störungen in Zellzyklus Progression von diesen Medikamenten generiert abgeleitet.

<table><tbody><tr><td>DMEM, hoher Glukosegehalt, GutaMAX Supplement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>61965-059</td><td></td></tr><tr><td>FBS, qualifiziert, EU-zugelassen, Herkunft aus Südamerika</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Trypsin-EDTA (1x), phenolrot</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>Thymidin</td><td>SIGMA</td><td>T1895-5G</td><td>Frisch zubereitet. Eine leichte Erwärmung kann helfen, Thymidin aufzulösen.</td></tr><tr><td>Nocodazol</td><td>SIGMA</td><td>M-1404</td><td>Stammlösung in DMSO gelagert bei -20 μm C in kleinen Aliquoten</td></tr><tr><td>Hydroxyharnstoff</td><td>SIGMA</td><td>H8627</td><td>Frisch zubereitetes</td></tr><tr><td>Mitomycin C aus Streptomyces caespitosus</td><td>SIGMA</td><td>M4287</td><td>1,5 mM Stammlösung in sterilem H2O lichtgeschützt und gelagert bei 4 & ordm; C</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>SIGMA</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Propidiumiodid</td><td>SIGMA</td><td>P4170</td><td>Stammlösung in sterilem PBS bei 5 mg/ml, gelagert bei 4 & ordm; C vor Licht geschützt.</td></tr><tr><td>PBS pH 7,6</td><td></td><td></td><td>Hausgemachtes</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>PANREAC</td><td>A3678,2500</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>SIGMA</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcitrat</td><td>PANREAC</td><td>131655</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>SIGMA</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>RNAse A</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagenz</td><td>LifeTechnologies</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>Reverse Transkriptionskit für cDNA mit hoher Kapazität</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Cyclin E1 Antikörper</td><td>Cell Signaling</td><td>4129</td><td>1:1000 Verdünnung in 5 % Milch, o/n, 4 & ordm; C</td></tr><tr><td>Anti-Cyclin B1 Antikörper</td><td>Zellsignalisierung</td><td>4135</td><td>1:1000 Verdünnung in 5% Milch, o/n, 4 & ordm; C</td></tr><tr><td>Anti-&beta;-Aktin</td><td>SIGMA</td><td>A-5441</td><td>1:3000 Verdünnung in 5 % Milch, 1 Std., RT</td></tr><tr><td>Anti-pH3 (Ser 10) antiboty</td><td>Millipore</td><td>06-570</td><td>Spezifiziert im Protokoll</td></tr><tr><td>Sekundärer Anti-Kaninchen-Antikörper AlexaFluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>R37116</td><td>Spezifiziert im Protokoll</td></tr><tr><td>Sekundärer Anti-Maus-HRP-Antikörper</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-3697</td><td>1:3000 Verdünnung in 5 % Milch, 1 Std., RT</td></tr><tr><td>Forward E2F1 Antikörper (human) &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; TGACATCACCAACGTCCTTGA</td><td>Biolegio</td><td></td><td>Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)</td></tr><tr><td>Reverse E2F1 Antikörper (Mensch)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; CTGTGCGAGGTCCTGGGTC</td><td>Biolegio</td><td></td><td>Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)</td></tr><tr><td>Forward E2F7 Antikörper (Mensch)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; GGAAAGGCAACAGCAAACTCT</td><td>Biolegio</td><td></td><td>Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)</td></tr><tr><td>Reverse E2F7 Antikörper (human)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; TGGGAGAGCACCAAGAGTAGAAGA</td><td>Biolegio</td><td></td><td>Entwickelt von PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)</td></tr><tr><td>Forward p21Cip1 Antikörper (human)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; AGCAGAGGAAGACCATGTGGAC</td><td>Biolegio</td><td></td><td>Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)</td></tr><tr><td>Reverse p21Cip1 Antikörper (human)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; TTTCGACCCTGAGAGTCTCCAG</td><td>Biolegio</td><td></td><td>Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)</td></tr><tr><td>Forward TBP Antikörper (Mensch) Referenzgen&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Biolegio</td><td></td><td>Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)</td></tr><tr><td>Reverse TBP Antikörper (human)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Biolegio</td><td></td><td>Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)</td></tr><tr><td>Forward Oxa1L-Antikörper (human) Referenzgen&nbsp; &nbsp; CACTTGCCAGAGATCCAGAAG&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Biolegio</td><td></td><td>Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)</td></tr><tr><td>Reverse Oxa1L &nbsp; Antikörper (Mensch)&nbsp; &nbsp; &nbsp; CACAGGGAGAATGAGAGGTTTATAG&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Biolegio</td><td></td><td>Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)</td></tr><tr><td>Power SYBRGreen PCR Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4368702</td><td></td></tr><tr><td>FACS Tubes&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>551578</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optische 96-Well-Reaktionsplatte</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N8010560</td><td></td></tr><tr><td>Corning 100 mm TC-behandelte Kulturschale</td><td>Corning Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Costar Zellkulturplatten 6 Well</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr> gekühlte <tr><td>Tisch-Mikrozentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415 R</td><td></td></tr><tr><td>Gekühlte Tischzentrifuge Jouan CR3.12</td><td>Jouan</td><td>743205604</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop Lite Spektralphotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-LITE-PR</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCalibur Durchflusszytometer</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 3 Echtzeit-PCR-System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A28567</td><td></td></tr></tbody></table>

das studium der zellzyklus-regulierten genexpression durch zwei komplementäre zellsynchronisationsprotokolle

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

Das Genexpressionsprogramm des Zellzyklus stellt einen kritischen Schritt zum Verständnis von zellzyklusabhängigen Prozessen und deren Rolle bei Krankheiten wie Krebs dar. Die zellzyklusregulierte Genexpressionsanalyse hängt von der Zellsynchronisation in spezifische Phasen ab. Hier beschreiben wir eine Methode, die zwei komplementäre Synchronisationsprotokolle verwendet, die üblicherweise zum Studieren einer periodischen Variation der Genexpression während des Zellzyklus verwendet werden. Beide Verfahren basieren auf einer vorübergehenden Blockierung des Zellzyklus in einem definierten Punkt. Das Synchronisationsprotokoll durch Hydroxyharnstoffbehandlung (HU) führt zu einem zellulären Arrest in der späten G1 / frühen S-Phase, und die Freisetzung aus dem HU-vermittelten Arrest liefert eine zelluläre Population, die gleichmäßig durch S und G2 / M fortschreitet. Das Synchronisationsprotokoll durch Thymidin- und Nocodazol (Thy-Noc) -Behandlung blockiert Zellen in der frühen Mitose und die Freisetzung von Thy-Noc-vermittelten Arrest liefert eine synchronisierte zelluläre Population, die für die G1-Phase und die S-Phase-en geeignet istVersuche Studien. Die Anwendung beider Verfahren erfordert die Überwachung der Zellzyklusverteilungsprofile, die typischerweise nach der Propidiumjodid (PI) -Färbung der Zellen und der Durchflusszytometrie-vermittelten Analyse des DNA-Gehalts durchgeführt wird. Wir zeigen, dass die kombinierte Verwendung von zwei Synchronisationsprotokollen ein robuster Ansatz ist, um die Transkriptionsprofile von Genen, die im Zellzyklus unterschiedlich reguliert sind ( dh E2F1 und E2F7), klar zu bestimmen und folglich ein besseres Verständnis ihrer Rolle im Zellzyklus zu haben Prozesse. Darüber hinaus zeigen wir, dass dieser Ansatz für die Untersuchung von Mechanismen, die Drogen-basierten Therapien ( dh Mitomycin C, ein Antikrebsmittel) zugrunde liegen, nützlich ist, da es erlaubt, Gene zu unterscheiden, die auf das genotoxische Mittel reagieren, von denen, die nur von Zellzyklus-Störungen betroffen sind Verhängt durch den agent

Schematische Darstellung von Thy-Noc- und HU-basierten Protokollen zur Zellsynchronisation. Abbildung 1 fasst die Schritte zusammen, die für die U2OS-Zellsynchronisation und die anschließende Probensammlung erforderlich sind, um die Progression durch den Zellzyklus zu überprüfen und Genexpressionsanalysen durchzuführen. Phospho-H3 und PI-Färbung sind gute...

Wir berichten über zwei Zellsynchronisationsprotokolle, die einen Kontext für das Studium von Ereignissen im Zusammenhang mit bestimmten Phasen des Zellzyklus bieten. Wir zeigen, dass dieser Ansatz für die Analyse der Regulation von spezifischen Genen in einem ungestörten Zellzyklus oder bei Exposition gegenüber Mitteln, die den Zellzyklus beeinflussen, nützlich ist.

Das Studium der Zellzyklus-regulierten Genexpression durch zwei komplementäre Zellsynchronisationsprotokolle

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, einen Kontext für die Analyse der Genexpression in einer zellzyklusabhängigen Weise bereitzustellen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Krebsforschung zu beantworten, die sich auf zellzyklusabhängige transkriptionelle Ereignisse beziehen, die der malignen Transformation sowie der Krebsbehandlung zugrunde liegen. Der Hauptvorteil dieses Protokolls liegt darin, dass es präzise zellzyklusphasenspezifische Muster der Genexpression sowohl unter zwei definierten Bedingungen als auch nach Exposition gegenüber Chemotherapie ermittelt.U2OS-Zellen werden für dieses Experiment verwendet und sollten am Abend gegen 19:00 Uhr in 100 Millimeter-Platten ausgesät werden, damit die nachfolgenden Schritte während der Arbeitszeit durchgeführt werden können. Die Zellen durch eine Inkubation der Platten bei 37 Grad Celsius in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % CO2 für 24 Stunden anheften lassen.Untersuchen Sie am folgenden Tag die Zellen, um zu bestätigen, dass sie eine Konfluenz von 50 % erreicht haben. Für die Thymidin-Blockade geben Sie 100 Mikroliter einer frisch hergestellten 200 Millimolar-Thymidin-Stammlösung zu jeder 1

studying-cell-cycle-regulated-gene-expression-two-complementary-cell

Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Die Bestimmung der Zellzyklus-Position eine Population von Zellen, oder zu verstehen, wie Signale Verbreitung beeinflussen, kann leicht durch Durchflusszytometrie mit diesem Protokoll gemessen werden. Wir berichten über einen einfachen experimentellen Ansatz zur Färbung von Zellen und die Quantifizierung ihrer Position in den Zellzyklus.

Analyse des Zellzyklus Position in Säugerzellen

Tracking-feine Veränderungen in der Progression und die Kinetik der Zellzyklusstadien kann durch Verwendung einer Kombination von metabolische Markierung von Nukleinsäuren mit BrdU und genomischer Gesamt-DNA-Färbung über Propidiumiodid durchgeführt werden. Dieses Verfahren vermeidet die Notwendigkeit von chemischen Synchronisation der Rad-Zellen, wodurch die Einführung von nicht-spezifischen DNA-Schäden, die sich wiederum auf den Ablauf des Zellzyklus.

Mess-Zellzyklus-Progression Kinetics mit Metabolische Markierung und Durchflusszytometrie

Die Synchronisation von Bakterienzellen ist essentiell für die Erforschung des bakteriellen Zellzyklus und der Entwicklung.  Caulobacter crescentus ist durch Dichtezentrifugation synchronisierbar und ermöglicht so ein schnelles und leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung des bakteriellen Zellzyklus.  Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Synchronisation von Caulobacter-Zellen zur Verfügung.

Synchronisation<em&gt; Caulobacter crescentus</em&gt; Für die Untersuchung der Bakterienzellzyklus

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Bromdesoxyuridin (BrdU) -Aufnahme, die zeitliche Verfolgung von Zellen, die in der S-Phase auf einen bestimmten Zeitpunkt waren ermöglichen. Die Zugabe von DNA-Farbstoffen und Antikörpermarkierung erleichtert die detaillierte Analyse des Schicksals der S-Phasen-Zellen zu späteren Zeitpunkten.

Zeitliche Verfolgung von Zellzyklus mittels Durchflusszytometrie, ohne die Notwendigkeit für die Synchronisation

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll für doppelte Thymidin-Synchronisation von HeLa-Zellen, gefolgt von Analyse mit hochauflösenden konfokalen Mikroskopie. Diese Methode ist Schlüssel zu große Anzahl von Zellen, die synchron von S-Phase, Mitose gehen, Studien auf mitotischen Rollen multifunktionale Proteine, die auch Interphase Funktionen besitzen.

Kombination von mitotische Zelle Synchronisation und hochauflösenden konfokalen Mikroskopie zur Untersuchung der Rolle von multifunktionalen Zelle Zyklus Proteine während der Mitose

Dieses Protokoll beschreibt eine nicht-invasive Methode zur effizienten Identifizierung von S-Phasen-Zellen für nachgelagerte Mikroskopiestudien, wie z. B. die Messung der Rekrutierung von DNA-Reparaturproteinen durch Lasermikrobestrahlung.

Laser-Mikrobestrahlung zur Untersuchung der DNA-Rekrutierung während der S-Phase

Eine Herausforderung bei der Analyse synchronisierter Zeitreihenexperimente besteht darin, dass sich die Experimente oft in der Dauer der Erholung von der Synchronität und der Zellzyklusperiode unterscheiden. Daher können die Messungen aus verschiedenen Experimenten nicht aggregiert analysiert oder ohne weiteres verglichen werden. Hier beschreiben wir eine Methode zur Ausrichtung von Experimenten, um phasenspezifische Vergleiche zu ermöglichen.

Abgleich von synchronisierten Zeitreihendaten unter Verwendung des Modells zur Charakterisierung des Zellzyklusverlusts für experimentübergreifende Vergleiche

Das folgende Protokoll zeigt den Nachweis einzelsträngiger DNA-Foci in der G1-Phase des Zellzyklus unter Verwendung von Zellzyklussynchronisation, gefolgt von RPA2-Immunfluoreszenzfärbung.

Visualisierung einzelsträngiger DNA-Herde in der G1-Phase des Zellzyklus

Dieses Protokoll beschreibt zwei Methoden des Hefezellzyklus-Arrests und der optionalen Freisetzung und erläutert den Einsatz von Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung von zellzyklusabhängigen Prozessen in S. cerevisiae.

Manipulation und Analyse von zellzyklusabhängigen Prozessen in knospenden Hefen

Hier beschreiben wir Einstellungen, um die zirkadiane Biolumineszenz und die sekretorische Aktivität von menschlichen Inselzellen und primären Myotuben parallel zu überwachen. Zu diesem Zweck verwendeten wir die lentivirale Genverabreichung eines Luciferase-Kernuhrreporters, gefolgt von einer in vitro Synchronisation und Sammlung des Ausflussmediums durch kontinuierliche Zellperifusion.

Parallel Messung von Circadian Clock Genexpression und Hormon-Sekretion in primären humanen Zellkulturen

Lernen Sie zwei komplementäre Zellsynchronisationsprotokolle zur Analyse zellzyklus-spezifischer Genexpression in U2OS-Zellen. Diese Methoden ermöglichen präzise Untersuchungen transkriptioneller Ereignisse in der Krebsforschung und bei Chemotherapie-Wirkungen.

Das Studium der Zellzyklus-regulierten Genexpression durch zwei komplementäre Zellsynchronisationsprotokolle

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