Das Studium der Zellzyklus-regulierten Genexpression durch zwei komplementäre Zellsynchronisationsprotokolle

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, einen Kontext für die Analyse der Genexpression auf zellzyklusspezifische Weise bereitzustellen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Krebsbereich im Zusammenhang mit zellzyklusabhängigen transkriptionellen Ereignissen zu beantworten, die der malignen Transformation sowie der Krebsbehandlung zugrunde liegen. Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass es sowohl unter den zweiten Bedingungen als auch nach Exposition gegenüber einer Chemotherapie mit Genauigkeit zellzyklusphasenspezifische Genexpressionsmuster festlegt.

Für dieses Experiment werden U2OS-Zellen verwendet, die abends gegen sieben Uhr in 100-Millimeter-Schalen ausgesät werden sollen, damit die nachfolgenden Schritte während der Arbeitszeit durchgeführt werden können. Lassen Sie die Zellen anheften, indem Sie die Schalen 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2 inkubieren.

Am nächsten Tag untersuchen Sie die Zellen, um zu bestätigen, dass sie eine Konfluenz von 50 % erreicht haben. Für den Thymidin-Block 100 Mikroliter einer frisch zubereiteten 200 Millimolar Thymidin-Brühe in jede 100-Millimeter-Kulturschale geben. Inkubieren Sie die Zellen mit Thymidin bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO2 für 20 Stunden.

Am nächsten Tag gegen drei Uhr nachmittags die Zellen aus dem Thymidinblock lösen, indem das Thymidin-haltige Wachstumsmedium entfernt wird. Waschen Sie die Zellen zweimal mit vorgewärmtem 1X PBS.

Und dann fügen Sie 10 Milliliter des vollständigen Mediums zu jeder 100-Millimeter-Schale hinzu. Inkubieren Sie die Zellen fünf Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Für einen mitotischen Zellarrest fügen Sie Nocodazol bis zu einer Endkonzentration von 50 Nanogramm pro Milliliter hinzu.

Inkubieren Sie die Zellen nicht länger als 10 bis 11 Stunden mit Nocodazol. Am nächsten Morgen zwischen sechs und sieben Uhr morgens überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop, um zu bestätigen, dass sie tatsächlich in G2-M blockiert sind, was sich an ihrem abgerundeten Aussehen zeigt.

Trennen Sie mitotische Zellen, indem Sie jede Platte schütteln und nocodazolhaltiges Wachstumsmedium vorsichtig mit abgelösten Zellen von jeder 100-Millimeter-Platte pipettieren. Kombinieren Sie mitotische Zellen aus allen Schalen in einem sterilen 50-Millileter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie 300 mal g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.

Waschen Sie die Zellen zweimal, indem Sie kaltes 1X PBS hinzufügen, gefolgt von einer Zentrifugation. Nachdem Sie das PBS aus der zweiten Wäsche entfernt haben, suspendieren Sie die mitotischen Zellen erneut in vollständigem Kulturmedium. Sparen Sie zwei Milliliter für die RNA-Extraktion und zwei Milliliter für die FACS-Analyse für den Zeitpunkt der Null-Stunde.

Plattieren Sie die verbleibenden mitotischen Zellen für nachfolgende Zeitpunkte in Sechs-Well-Platten neu. Um dieses Verfahren zu beginnen, säen Sie 0,25 mal 10 bis zur sechsten U2OS-Zellen pro Vertiefung in sechs Well-Platten. Schreiben Sie auf den Deckel jeder Platte mit sechs Vertiefungen die Versuchsbedingungen für jede Vertiefung.

Zum Beispiel unbehandelt oder mit unterschiedlichen Konzentrationen von Arzneimitteln und Zeitpunkten behandelt. Lassen Sie die Zellen anheften, indem Sie die Sechs-Well-Platten über Nacht inkubieren. Am nächsten Morgen untersuchen Sie die Zellen, um zu bestätigen, dass sie eine Konfluenz von 50 % haben.

Entfernen Sie das gesamte Medium aus den Vertiefungen und fügen Sie zwei Milliliter vorgewärmtes, FBS-freies DMEM-Glutamin-Medium pro Vertiefung hinzu. Inkubieren Sie die Zellen für weitere 24 Stunden. Um Zellen mit Hydroxyharnstoff zu fixieren, entfernen Sie das Medium aus den Vertiefungen und ersetzen Sie es durch frisch zubereiteten vier mikromolaren Hydroxyharnstoff, der vollständiges Medium enthält.

Inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang in hydroxyharnstoffhaltigem Medium. Bevor Sie Zellen aus dem Hydroxyharnstoff-vermittelten Stillstand befreien, überprüfen Sie die Zellen, um zu bestätigen, dass sie festgehalten sind. Entfernen Sie hydroxyharnstoffhaltiges Medium aus den Vertiefungen und spülen Sie die Vertiefungen zweimal mit vorgewärmtem 1X PBS.

Nachdem Sie das PBS aus der zweiten Wäsche entfernt haben, fügen Sie zwei Milliliter vollständiges Medium pro Vertiefung hinzu. Bewahren Sie die Platten bis zur Probenentnahme im Inkubator auf. Proben aus beiden Synchronisationsprotokollen werden auf die gleiche Weise für die FACS-Analyse und für die RNA-Extraktion gesammelt.

Spülen Sie für die FACS-Analyse jede Vertiefung mit zwei Millilitern vorgewärmtem 1X PBS und fügen Sie dann 0,3 Milliliter vorgewärmte Trypsin-EDTA-Lösung hinzu, um die Zellen zu lösen. Nach fünf Minuten inaktivieren Sie Trypsin-EDTA, indem Sie einen Milliliter des vollständigen Mediums hinzufügen. Sammeln Sie jede Probe in einem separaten 15-Milliliter-Röhrchen.

Die Zellen werden fünf Minuten lang bei 300 μg bei Raumtemperatur zentrifugiert. Den Überstand entsorgen, mit 1X PBS waschen und erneut schleudern. Entfernen Sie das PBS und bewahren Sie das zelluläre Pellet auf.

Um die Zellen zu fixieren, suspendieren Sie jedes Zellpellet in einem Milliliter gekühltem 70%igem Ethanol durch sanftes Vortexen. Legen Sie die Zellen vor der Propidiumiodid-Färbung und der FACS-Analyse etwa 15 Minuten lang auf Eis. Für die RNA-Extraktion entfernen Sie das Medium und spülen Sie jede gut mit zwei Millilitern vorgewärmtem 1X PBS aus.

Bringen Sie die Platte in einen Sicherheitsschrank und fügen Sie pro Vertiefung einen Milliliter eines geeigneten RNA-Isolationsreagenzes hinzu. Pipettieren Sie auf und ab, um die Zellen zu pipettieren und zu lysieren, und übertragen Sie dann jedes Zelllysat in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Beginnen Sie das RNA-Extraktionsverfahren, indem Sie die Mikrozentrifugenröhrchen mit den Proben im RNA-Isolationsreagenz aus dem Gefrierschrank holen und bei Raumtemperatur in einem Sicherheitsschrank für Chemikalien auftauen. Geben Sie 400 Mikroliter Chloroform zu jeder Probe und schütteln Sie sie kräftig ohne Vortexen, bis sie vollständig vermischt ist. Inkubieren Sie die Proben fünf Minuten lang bei Raumtemperatur.

Zentrifugieren Sie die Röhrchen 15 Minuten lang in einer Mikrozentrifuge. Überführen Sie die wässrige Phase jeder Probe in ein neues 1,5-Milliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie während des Mischens langsam ein Volumen 100%iges Ethanol Tropfen für Tropfen in die wässrige Phase.

Nicht zentrifugieren. Übertragen Sie bis zu 700 Mikroliter jeder Probe einschließlich des Niederschlags, der sich möglicherweise gebildet hat, in eine Spin-Säule in ein Zwei-Milliliter-Sammelröhrchen, das von einem kommerziellen RNA-Mini-Prep-Kit bereitgestellt wird, und schließen Sie den Deckel. 15 Sekunden lang zentrifugieren.

Verwerfen Sie den Durchfluss. Wenn Sie mit mehr als 700 Mikrolitern pro Probe beginnen, geben Sie die verbleibende Probe in die Spin-Säule und zentrifugieren Sie erneut. Nachdem Sie die RNA gemäß den Anweisungen des Herstellers gewaschen haben, eluieren Sie jede Probe, indem Sie 30 bis 40 Mikroliter nukleasefreies Wasser in die Spin-Säule pipettieren und eine Minute lang bei Raumtemperatur zentrifugieren.

Bestimmung der RNA-Konzentration und Reinheit von Proben durch Absorptionsmessungen. Lagern Sie die RNA-Proben bei minus 80 Grad Celsius, bis sie für die Genexpressionsanalyse verwendet werden. Die Behandlung mit dem Thymidin-Nocodazol-Protokoll stoppt U2OS-Zellen beim Eintritt in die m-Phase und liefert eine Zellpopulation, die synchron durch G1 in die S-Phase fortschreitet, wie die Durchflusszytometrie-Analyse zeigte.

Die Behandlung mit dem Hydroxyharnstoff-Protokoll hält Zellen an der G1/S-Grenze fest. Nach der Freisetzung durchlaufen die Zellen synchron die S- und G2-Phasen. Das Thymidin-Nocodazol-Protokoll eignet sich am besten für die Analyse von mRNA-Profilen von Genen mit maximaler Expression während der G1-Phase.

Wie für den E2F1-Ausdruck gezeigt. Im Gegensatz dazu eignet sich das Hydroxyharnstoff-Protokoll besser für die Analyse von Genen mit bevorzugter Expression in S oder G2, wie für die E2F7-Expression dargestellt. Der Zellzyklus wird typischerweise durch Anti-Tumor-Medikamente gestört, gezeigt ist ein von Mitomycin C auferlegter dauerhafter G2-Phasenarrest in Hydroxyharnstoff-synchronisierten Zellen.

Die Zellsychronisierung hilft, Gene zu unterscheiden, die auf das Antitumormittel ansprechen, von solchen, die ausschließlich von Zellzyklusstörungen betroffen sind, die durch das Mittel verursacht werden, z. B. ist eine Verringerung der E2F1-mRNA-Spiegel nach einer Mitomycin-C-Behandlung wahrscheinlich ein indirekter Einfluss des Arzneimittels auf die Zellzyklusdynamik. Im Gegensatz dazu ist der Höhepunkt der p21-Cip1-mRNA-Expression nach einer Mitomycin-C-Behandlung direkt das Ergebnis eines Transkriptionsprogramms, das durch dieses Medikament ausgelöst wird. Nach diesem Verfahren können sowohl genomweite transkriptomische als auch proteomische Analysen durchgeführt werden, um globale Genexpressionsänderungen zu entschlüsseln, die eine bestimmte Zellzyklusphase betreffen.

Entweder bei den zweiten Erkrankungen oder bei Anti-Tumor-Behandlungen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis der Verfahren haben, die für die Durchführung von Genexpressionsanalysen in synchronisierten Zellkulturen erforderlich sind. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Propidiumiodid- oder RNA-Isolationsreagenzien äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie Handschuhe und Sicherheitswerkbank für Chemikalien getroffen werden sollten.