Manipulation und Analyse von zellzyklusabhängigen Prozessen in knospenden Hefen

Wir untersuchen, wie sich teilende Zellen während der Mitose ihre Chromosomen treu weitergeben, wobei wir uns auf die molekularen Maschinen und Mechanismen konzentrieren, die eine genaue Chromosomentrennung gewährleisten. Wir synchronisieren Zellen, um molekulare Prozesse zu untersuchen, die sich mit dem Zellzyklus verändern. Ohne diese Methoden wären wichtige Änderungen in einer unsynchronisierten Zellpopulation verborgen.

Im Vergleich zu anderen Synchronisationsmethoden bietet der Alpha-Faktor-Arrest bei BAR1-Mutanten einen saubereren, reversiblen G1-Arrest, der es uns ermöglicht, eine gesamte Hefekultur synchron im Zyklus zu verfolgen. Unsere Arbeit zeigt dynamische Veränderungen in der Proteinlokalisierung und -aktivität während des Zellzyklus auf und beleuchtet wichtige mitotische Prozesse wie Chromosomensegregation und Spindelpflege. Zu Beginn inokulieren Sie die Hefe in 25 Milliliter YPAD-Medium und inkubieren Sie über Nacht, um eine optische Dichte von 600 Nanometern zwischen 0,5 und 2,0 zu erreichen.

Verdünnen Sie die Hefezellen auf eine optische Dichte von 600 Nanometern von 0,5. Fügen Sie der Kultur einen Alpha-Faktor hinzu, um eine Endkonzentration von einem Mikrogramm pro Milliliter zu erreichen. Nach 2,5 bis 3,5 Stunden nach Alphafaktorzugabe wird der Prozentsatz der nicht geknüppten Shmooed-Zellen unter dem Mikroskop erfasst, um den Zellstillstand zu beurteilen.

Dann wird die Kultur in einer Zentrifuge mit 3.000 g für drei bis fünf Minuten bei 23 Grad Celsius gedreht. Gieße vorsichtig das Supernatant ab, um den Alpha-Faktor zu entfernen. Setzen Sie das Zellpellet in 25 Millilitern YPAD mit 1 % Dimethylsulfoxid wieder auf, um die Zellen zu reinigen.

Übertragen Sie das Zellpellet in ein frisches Rohr und wiederholen Sie die Waschphasen zweimal weiter, insgesamt drei Waschen, um eventuelle Rest-Alpha-Faktoren zu entfernen. Als Nächstes geben Sie YPAD zu den gewaschenen Zellen, um das Endvolumen auf 25 Milliliter zu bringen, und übergeben Sie die Suspension in eine neue Flasche für weitere Inkubation oder Gebrauch. Sammeln Sie die Null-Minuten-Zeitpunktprobe unmittelbar nach der Freigabe und fixieren Sie die Probe.

60 Minuten nach der Freisetzung wird die Synchronität der Zellpopulation unter einem Lichtmikroskop beurteilt. Falls gewünscht, fügen Sie den Alpha-Faktor 60 Minuten nach der Freisetzung erneut hinzu, um eine Endkonzentration von einem Mikrogramm pro Milliliter zu erreichen, um den Übergang zum nächsten Zellzyklus zu blockieren. Sammeln Sie weiterhin Zeitpunktproben alle 15 Minuten bis zu 180 Minuten oder so lange wie nötig.

Um die Hefezellen zu fixieren, zentrifugiere einen Milliliter Kultur für eine Minute mit maximaler Geschwindigkeit. Aspiriere das Supernatant vollständig. Anschließend wird das Pellet in 500 Mikrolitern fixierender Lösung erneut suspendiert und bei 23 Grad Celsius zwei bis 15 Minuten inkubiert.

Nach der Zentrifugation der fixierten Zellen wird das Supernatant aspiriert und das Pellet in 500 Mikrolitern 0,1-molaren Kaliumphosphatpuffer bei pH 6,4 wieder suspendiert. Vor der Bildgebung werden die festen Zellen eine Minute lang bei 23 Grad Celsius mit maximaler Geschwindigkeit zentrifugiert. Sobald das Supernatant aspiriert ist, wird das Pellet in 10 bis 100 Mikrolitern Triton-, DAPI- und Sorbitollösung wieder suspendiert.

Pipettieren Sie etwa 0,8 Mikroliter der gefärbten Zellsuspension direkt auf das Zentrum eines sauberen Abdecks. Verwenden Sie eine Pipettenspitze, um den Tropfen vorsichtig in eine kreisförmige Fläche von etwa einem Quadratzentimeter zu verteilen. Legen Sie den Deckdeckel auf einen Objektträger.

Mit einem Kimwipe drücken Sie vorsichtig an den Rändern des Deckzettels herum, um die Probe gleichmäßig zu verteilen. Dann versiegeln Sie die Ränder des Deckzettels mit Nagellack, um das Muster zu sichern. Bringen Sie den vorbereiteten Objektträger zu einem Mikroskop mit einer 60-fachen Vergrößerung, einer numerischen Apertur-Ölimmersionsobjektiv mit 1,42 m sowie einem roten, grünen, blauen und fernroten Laser- und Filterset.

Fokussiere das Mikroskop auf die Hefezellen, die am Deckzettel haften. Nach dem Fokussieren passen Sie die Belichtungseinstellungen für jeden Fluoreszenzkanal so ein, dass ein Signal-Rausch-Verhältnis von mindestens drei zu eins erreicht wird. Passen Sie die Aufnahmeeinstellungen so an, dass 14 bis 20 Z-Stack-Bilder mit jeweils 0,2 Mikrometern Abstand pro Schnitt erfasst werden, was eine Gesamtz-Tiefe von zwei bis vier Mikrometern abdeckt.

Bei Mikroskopen, die mit Nachbearbeitungsmodulen ausgestattet sind, wählen Sie für jedes Z-Stack-Bild die Dekonvolutions- und Schnellprojektionsoptionen aus. Erfassen Sie Z-Stacks der Probe und nehmen genügend Bilder auf, um etwa 100 bis 200 Hefezellen für jede experimentelle Bedingung oder jeden Zeitpunkt aufzuzeichnen. Zur Analyse öffnen Sie die projizierten Bilder in der ImageJ-Software.

Passen Sie Helligkeit und Kontrast jedes Fluoreszenzkanals an, um die Sichtbarkeit zu verbessern. Um den Zellzyklusverlauf zu analysieren, zählen Sie 100 Zellen pro Zeitpunkt und klassifizieren Sie sie als mit einem oder zwei Kernen. Um den Prozentsatz der Zellen zu berechnen, die Stu2-GFP-Puncta zeigen, standardisieren Sie die grünen Kanalhelligkeitseinstellungen für alle Bilder.

Zähle Zellen, die zeigen, dass Stu2-GFP-Puncta, die mit Spc110-mCherry-Puncta ko-lokalisieren, positiv für die Kinetochor-Lokalisation sind. Um die Intensität der Proteinpuncta zu quantifizieren, verwenden Sie anschließend das freihändige Auswahlwerkzeug, um die Interessenregion um das Signal herum zu skizzieren. Füge die Auswahl zum Interessensbereichsmanager hinzu, indem du T drückst oder die Option im ROI-Manager-Menü auswählst.

Im ROI-Manager klicken Sie auf Messen, um die Puncta-Intensität zu berechnen. Um Veränderungen im Zeitverlauf zu visualisieren, wird die durchschnittliche Intensität mit 95%-Konfidenzintervallen für jeden Zeitpunkt dargestellt. Zähle etwa 100 Zellen pro Erkrankung.

In G1-gestoppten Zellen lokalisierte sich Stu2-GFP auf einen einzelnen spindelpoligen proximalen Punctum mit zusätzlich dispersierten Signalen entlang zytoplasmatischer Mikrotubuli. 60 Minuten nach der Freigabe lokalisierte sich Stu2-GFP als zwei Puncta, die an duplizierte Spindelstangen mit Spc110-mCherry markiert sind. Nach 90 Minuten, während der Anaphase, erschien Stu2-GFP sowohl in der Nähe der Spindelpole als auch entlang der Mikrotubuli, die die einzelne Achse umfassen.

Nach dem mitotischen Austritt erschien Stu2-GFP nach 120 Minuten erneut auf astralen Mikrotubuli im Zytoplasma. Die Quantifizierung zeigte, dass die Stu2-GFP-Intensität in der Nähe der Spindelpole während der frühen Mitose zunahm, vor der Anaphase ihren Höhepunkt erreichte und danach abnahm. Der Anteil der binukleären Zellen erreichte etwa 90 Minuten seinen Höhepunkt, was auf einen synchronisierten Anaphaseneintritt hinweist.