Integration von miniaturisierter Festphasenextraktion und LC-MS / MS-Nachweis von 3-Nitrotyrosin im menschlichen Urin für klinische Anwendungen

Das übergeordnete Ziel dieser miniaturisierten Festphasenextraktion in Kombination mit einem LC-MS/MS-Assay besteht darin, freies 3-Nitrotyrosin im menschlichen Urin für klinische Anwendungen genau zu quantifizieren. Freies 3-Nitrotyrosin liefert Erkenntnisse und dient als Biomarker für oxidativen Stress. Es bleibt jedoch eine besondere Herausforderung, 3-Nitrotyrosin in biologischen Proben für klinische Anwendungen genau zu quantifizieren, da die derzeitigen Methoden unzureichende Empfindlichkeit, Selektivität sowie aufwändige Probenvorbereitungen aufweisen.

Diese Technik, die eine effektive Festphasenextraktion in einer hochsensitiven LC-MS/MS-Analyse kombiniert, ermöglicht eine schnelle, spezifische und genaue Bestimmung geringer Konzentrationen endogenen 3-Nitrotyrosins in menschlichem Urin, ohne dass eine Probenaufkonzentrierung oder eine zweidimensionale LC erforderlich ist. Obwohl diese Methode Einblicke in die Untersuchung von oxidativem Stress ermöglicht, kann sie auch auf andere pathologische Zustände wie komplexe entzündliche und neurodegenerative Erkrankungen angewendet werden. Die Bedeutung dieser Technik könnte sich auf die Überwachung der Wirksamkeit von antioxidativer Therapie erstrecken, da der 3-Nitrotyrosin-Spiegel durch Antioxidantien gesenkt werden kann. Um dieses Verfahren zu beginnen, vortexen Sie zuvor vorbereitete und aufgetaute Urinproben, Standards und QK-Proben.

Nach dem Vortexen geben Sie 250 Mikroliter jeder Probe und jedes Standards in 32 Vertiefungen einer sauberen 96-Loch-Sammelplatte mit zwei Milliliter. Geben Sie 50 Mikroliter der zuvor hergestellten internen Standard-Arbeitslösung in jedes Loch, mit Ausnahme des Doppel-Blanco-Probenlochs. Geben Sie anschließend 50 Mikroliter LC-MS-Reinstwasser mit 0,01 % Ameisensäure in das Doppel-Blanco-Probenloch.

Danach 250 Mikroliter LC-MS-Reinstwasser mit 0,1 % Ameisensäure zu den Vertiefungen geben. Anschließend die Lösungen dreimal mit einer Acht-Kanal-Pipette mischen und die Platte bis zur Festphasenextraktion (SPE) abgedeckt lagern. Danach eine gemischt-modale Kationenaustausch-Extraktionsmikroplatte mit 96 Vertiefungen und ein Sammelreservoir auf einen Positivdruck-Processor setzen.

Die Festphasenextraktion unter Verwendung einer Mixed-Mode-Kationenaustausch-Mikroplatte ermöglicht die gleichzeitige Probenaufreinigung und Anreicherung von 3-Nitrotyrosin in einer einzigen Extraktion. Bedingen Sie die Extraktionsplatte, indem Sie 200 Mikroliter Methanol der LC-MS-Reinheit durch die Säule leiten. Drehen Sie den Druckregler am positiven Druckprozessor, um einen niedrigen positiven Druck einzustellen, sodass die Mischung langsam durch die Säule fließt, und passen Sie den Druck bei Bedarf an.

Äquilibrieren Sie, indem Sie 200 Mikroliter LC-MS-Reinstwasser mit 2 % Ameisensäure durch die Säule fließen lassen. Laden Sie mithilfe einer Acht-Kanal-Pipette vorsichtig das gesamte Volumen jeder vorgemischten Probe auf die vorbehandelte Extraktionsplatte auf. Stellen Sie einen niedrigen positiven Druck am positiven Druck-Processor ein, um die langsame Durchflussgeschwindigkeit der Mischung durch die Säule zu ermöglichen, und passen Sie den Druck nach Bedarf an.

Danach waschen Sie die Vertiefungen, indem Sie 200 Mikroliter LC-MS-Reinstwasser mit 2 % Ameisensäure durch die Säulchen leiten. Nach dem Waschen mit 200 Mikrolitern Methanol und Wasser stellen Sie den positiven Druck-Prozessor auf hohen Druck, um die Vertiefungen zu trocknen. Sobald die Vertiefungen trocken sind, ersetzen Sie das Sammelgefäß durch eine saubere 96-Loch-Sammelplatte mit zwei Milliliter Fassungsvermögen pro Vertiefung.

Tragen Sie nun 50 Mikroliter einer 25 Millimolar-Ammoniumacetat-Lösung auf, um den gebundenen Analyten und den internen Standard langsam von der Extraktionsplatte zu eluieren. Fügen Sie anschließend 50 Mikroliter LC-MS-Reinheitsgrad-Wasser mit 5 % Ameisensäure hinzu, um das Eluat zu neutralisieren. Die Verwendung einer schwachen Ammoniumacetat-Lösung zur Elution von 3-Nitrotyrosin bietet eine erhebliche Verbesserung der Selektivität und Empfindlichkeit.

Mischen Sie die Proben mit einer Acht-Kanal-Pipette dreimal zur Vorbereitung auf die Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie-Analyse. Nach dem Einrichten des LC-MS/MS-Geräts equilibrieren Sie die 3-Nitrotyrosin-LC-MS/MS-Methode 10 Minuten lang mit dem LC-Gradienten-Elutionsprogramm. Durch das Equilibrieren der Methode wird der LC-Gradient auf die anfängliche Gradienten-Elution eingestellt.

Die Temperatur des Autosamplers wird auf vier Grad Celsius und die Ofentemperatur auf 30 Grad Celsius eingestellt. Erstellen Sie eine Chargenliste, die die Urinproben, Standards und QC-Proben umfasst. Starten Sie anschließend die Charge, indem Sie die vorbereiteten Proben injizieren.

Nach Abschluss aller Injektionen erstellen Sie eine Standardkurve mit einem Bereich von 10 bis 2.500 Pikogramm pro Milliliter für die Quantifizierung von 3-Nitrotyrosin durch lineare Regression des Peakflächenverhältnisses von 3-Nitrotyrosin und interner Standard bezogen auf die nominelle 3-Nitrotyrosin-Konzentration. Quantifizieren Sie abschließend alle anderen Proben mithilfe der etablierten Standardkurve und prüfen Sie, ob die QC-Proben innerhalb des festgelegten Bereichs liegen. LC-Daten von menschlichen Urinproben zeigen, dass 3-Nitrotyrosin unter den optimierten Bedingungen chromatographisch von anderen strukturell ähnlichen Tyrosin-Analoga getrennt wird, wodurch gleichzeitige Elution durch diese stark übermäßigen Verbindungen vermieden und folglich der Grad der Assay-Selektivität erhöht wird.

Ein Signal für 3-Nitrotyrosin wird im Mehrfachreaktionsüberwachungs-Chromatogramm der Doppelblindprobe nicht beobachtet, was darauf hinweist, dass sich 3-Nitrotyrosin während des gesamten Verfahrens nicht bildet. Hier sind repräsentative Mehrfachreaktionsüberwachungs-Chromatogramme von 3-Nitrotyrosin und dem internen Standard für eine gesunde Person dargestellt. Es wurden keine störenden Signale zu den Retentionszeiten von 3-Nitrotyrosin und internem Standard beobachtet.

Hier ist eine repräsentative Standardkurve dargestellt. Die Nachweisgrenze, definiert als die niedrigste Konzentration mit einem Signal-Rausch-Verhältnis von mehr als drei, betrug zwei Pikogramm pro Milliliter. Die untere Grenze der Quantifizierung betrug 10 Pikogramm pro Milliliter und ist definiert als die niedrigste Konzentration innerhalb von 20 % Ungenauigkeit und Genauigkeit bei einem Signal-Rausch-Verhältnis von mehr als 10.

Der feinabgestimmte Integrationsassay bietet eine deutlich verbesserte Spezifität, Empfindlichkeit und Durchsatzleistung bei reduziertem Matrixeffekt, geringerem Säuleneinsatz und weniger Abfallentsorgung. Mit diesem einfachen und schnellen Assay können Harnproben innerhalb von 24 Stunden bearbeitet werden. Berücksichtigen Sie die nichtinvasive und kostengünstige Harnprobennahme.

Diese bemerkenswert verbesserte Methode eignet sich gut, um die Rolle von 3-Nitrotyrosin als Biomarker für oxidativen Stress in präklinischen und klinischen Studien zu bewerten.