Integration von miniaturisierter Festphasenextraktion und LC-MS / MS-Nachweis von 3-Nitrotyrosin im menschlichen Urin für klinische Anwendungen

Das übergeordnete Ziel dieser miniaturisierten Festphasenextraktion in Kombination mit dem LC-MS/MS-Assay ist die genaue Quantifizierung von freiem 3-Nitrotyrosin im menschlichen Urin für klinische Anwendungen. Freies 3-Nitrotyrosin hilft bei den Erträgen und ist ein Biomarker für oxidativen Stress. Eine besondere Herausforderung wird es jedoch bleiben, 3-Nitrotyrosin in biologischen Notfällen für klinische Anwendungen aufgrund unzureichender Sensitivität, Selektivität und umständlicher Probenvorbereitungen genau zu quantifizieren.

Diese Technik, die eine effektive Festphasenextraktion in einer hochempfindlichen LC-MS/MS-Wechselwirkung beinhaltet, ermöglicht eine schnelle, spezifische und genaue Bestimmung niedriger Konzentrationen von endogenem 3-Nitrotyrosin im menschlichen Urin, ohne dass eine Konstitution und eine zweidimensionale LC erforderlich sind. Obwohl diese Methode Einblicke in die Untersuchung von oxidativem Stress geben kann, kann sie auch auf andere pathologische Erkrankungen wie komplexe entzündliche und neurodegenerative Erkrankungen angewendet werden. Die Auswirkungen dieser Technik könnten auf die Überwachung der Wirksamkeit der antioxidativen Behandlung ausgeweitet werden, da der 3-Nitrotyrosin-Spiegel durch Antioxidantien gesenkt werden kann. Um dieses Verfahren zu starten, wurde zuvor Urinproben, Standards und QC-Proben vortexen vorbereitet und aufgetaut.

Nach dem Vortexen 250 Mikroliter jeder Probe und den Standard in 32 Vertiefungen einer sauberen 96-Well-Sammelplatte mit zwei Millilitern geben. Geben Sie 50 Mikroliter einer zuvor vorbereiteten internen Standardarbeitslösung in jede Vertiefung mit Ausnahme der Vertiefung mit doppelter Blindprobe. Geben Sie dann 50 Mikroliter Wasser in LC-MS-Qualität mit 0,01 % Ameisensäure in die Vertiefung der Doppelblindprobe.

Geben Sie anschließend 250 Mikroliter Wasser in LC-MS-Qualität mit 0,1 % Ameisensäure in die Vertiefungen. Mischen Sie dann die Lösungen dreimal mit einer Achtkanalpipette und decken Sie die Platte bis zur SPE-Beladung ab. Platzieren Sie als Nächstes eine 96-Well-Extraktionsmikroplatte mit gemischtem Kationenaustausch und ein Sammelreservoir auf einem Überdruckprozessor.

Die Festphasenextraktion mit einer Mischmoden-Kationenaustauscher-Mikroplatte ermöglicht die gleichzeitige Probenreinigung und Anreicherung von 3-Nitrotyrosin in einer einzigen Extraktion. Konditionieren Sie die Extraktionsplatte, indem Sie 200 Mikroliter Methanol der Klasse LC-MS durch das Sorptionsmittel fließen lassen. Drehen Sie den Druckeinstellknopf am Überdruckprozessor, um einen niedrigen Überdruck einzustellen, damit das Gemisch langsam durch das Sorptionsmittel fließen kann, und passen Sie den Druck bei Bedarf an.

Äquilibrieren Sie, indem Sie 200 Mikroliter Wasser der LC-MS-Qualität mit 2 % Ameisensäure durch das Sorptionsmittel fließen lassen. Mit einer Achtkanalpipette wird das gesamte Volumen jeder der vorgemischten Proben vorsichtig auf die vorkonditionierte Extraktionsplatte geladen. Stellen Sie einen niedrigen Überdruck auf den Überdruckprozessor ein, damit die Mischung langsam durch das Sorptionsmittel fließen kann, und passen Sie den Druck nach Bedarf an.

Waschen Sie anschließend die Vertiefungen, indem Sie 200 Mikroliter Wasser in LC-MS-Qualität mit 2 % Ameisensäure durch das Sorptionsmittel fließen lassen. Stellen Sie nach dem Waschen mit 200 Mikrolitern Methanol und Wasser den Überdruckprozessor auf hohen Druck, um die Vertiefungen zu trocknen. Sobald die Vertiefungen trocken sind, ersetzen Sie das Reservoir durch eine saubere Auffangplatte mit zwei Millilitern und 96 Vertiefungen.

Tragen Sie nun 50 Mikroliter einer 25 millimolaren Ammoniumacetatlösung auf, um den zurückgehaltenen Analyten und den internen Standard langsam von der Extraktionsplatte zu eluieren. Fügen Sie dann 50 Mikroliter LC-MS-Wasser mit 5% Ameisensäure hinzu, um das Eluent zu neutralisieren. Die Anwendung einer milden Ammoniumacetatlösung zur Elution von 3-Nitrotyrosin bietet eine erheblich verbesserte Selektivität und Empfindlichkeit.

Mischen Sie die Proben dreimal mit einer Achtkanalpipette zur Vorbereitung auf die Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie-Analyse. Nach dem Einrichten des LC-MS/MS-Instruments äquilibrieren Sie die 3-Nitrotyrosin-LC-MS/MS-Methode für 10 Minuten mit der LC-Gradienten-Elution. Durch die Äquilibrierung der Methode wird der LC-Gradient mit der anfänglichen Gradienten-Elution äquilibriert.

Die Temperatur des Autosamplers wird auf vier Grad Celsius und die Temperatur des Ofens auf 30 Grad Celsius eingestellt. Erstellen Sie eine Chargenliste, die die Urinproben, Standards und QC-Proben enthält. Starten Sie dann die Charge, indem Sie die vorbereiteten Proben injizieren.

Nachdem alle Injektionen abgeschlossen sind, erstellen Sie eine Standardkurve mit einem Bereich von 10 bis 2.500 Pikogramm pro Milliliter für die 3-Nitrotyrosin-Quantifizierung durch lineare Regression des Peak-Flächenverhältnisses von 3-Nitrotyrosin und internem Standard gegenüber der nominalen 3-Nitrotyrosin-Konzentration. Quantifizieren Sie abschließend alle anderen Proben anhand der festgelegten Standardkurve und bestimmen Sie, ob die QC-Proben innerhalb des festgelegten Bereichs liegen. LC-Daten von menschlichen Urinproben zeigen, dass 3-Nitrotyrosin unter den optimierten Bedingungen chromatographisch von anderen strukturell ähnlichen Tyrosinanaloga getrennt wird, wodurch co-eluierende Interferenzen aufgrund dieser stark übermäßigen Verbindungen eliminiert und folglich der Grad der Assay-Selektivität erhöht wird.

Ein 3-Nitrotyrosin-Signal wird im Chromatogramm zur Mehrfachreaktionsüberwachung der Doppelblindprobe nicht beobachtet, was darauf hindeutet, dass während des gesamten Prozesses kein 3-Nitrotyrosin gebildet wird. Repräsentative Multireaktions-Monitor-Chromatogramme von 3-Nitrotyrosin und internem Standard für einen gesunden Menschen sind hier dargestellt. Bei den Retentionszeiten von 3-Nitrotyrosin und internem Standard wurden keine Störsignale beobachtet.

Hier ist eine repräsentative Normkurve dargestellt. Die Nachweisgrenze, die als niedrigste Konzentration mit einem Signal-Rausch-Verhältnis von mehr als drei definiert ist, wurde mit zwei Pikogramm pro Milliliter bestimmt. Die untere Bestimmungsgrenze wurde auf 10 Pikogramm pro Milliliter festgelegt und ist definiert als die niedrigste Konzentration innerhalb von 20 % der Ungenauigkeit und Genauigkeit mit einem Signal-Rausch-Verhältnis von mehr als 10.

Der fein abgestimmte Integrationsassay bietet eine deutlich verbesserte Spezifität, Sensitivität und Durchsatz bei reduziertem Matrixeffekt, Sorptionsmittelverbrauch und Abfallentsorgung. Mit diesem einfachen und schnellen Assay kann die Urinprobe innerhalb von 24 Stunden verarbeitet werden. Berücksichtigen Sie die nicht-invasive und kostengünstige Urinprobenahme.

Diese bemerkenswert verbesserte Methode eignet sich gut, um die Rolle von 3-Nitrotyrosin als Biomarker für oxidativen Stress in präklinischen und klinischen Studien zu bewerten.