Name: Integration von miniaturisierter Festphasenextraktion und LC-MS / MS-Nachweis von 3-Nitrotyrosin im menschlichen Urin für klinische Anwendungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Erfahren Sie die miniaturisierte Festphasenextraktion mit LC-MS/MS zur Quantifizierung von 3-Nitrotyrosin im menschlichen Urin. Diese hochsensitive Methode ermöglicht klinische Anwendungen zur Untersuchung von oxidativem Stress.

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Die Autoren würden Scott Howard und Abigail Marinack für die allgemeine Unterstützung und Koordination dieser Arbeit anerkennen.

Alle Studien mit menschlichen Urinproben wurden unter Einhaltung des von Pharmasan / Neuroscience Institutional Review Board (IRB) genehmigten Verfahrens durchgeführt. 1. Urinprobenentnahme und Creatinin (Cr) Bestimmung <ol><li> Sammle 5 ml des nächsten Morgens Urinproben nach ca. 10 h über Nacht in einem 5 mL Transportrohr A mit 250 μl 3 N HCl als Konservierungsmittel und bei -20 ° C bis zur Verwendung aufbewahren. </li><li> Tau und Wirbel 5 mL Transport Urin Eine Röhre und zentrifugieren in einer Zentrifuge ( zB Sorvall) (2297 xg, 10 min). </li><li> Aliquot 1 ml Urin zweimal aus dem 5 ml Transportrohr A </li><li> Bestimmen Sie Cr durch eine Urin-Kreatinin-Methode 26 . </li></ol> 2. Vorbereitung von Standard-, IS- und Qualitätskontroll- (QC) Proben <ol><li> Eine Stammlösung von 3-NT mit 100 μg / ml in Wasser mit 0,01% HCOOH-Mobilphase A (MA) herstellen und bei -20 ° C aufbewahren. </li><li> MachenEine 3-NT-Arbeits-Standardlösung bei einer Konzentration von 100 ng / ml durch Verdünnen der 100 μg / ml 3-NT-Stammlösung mit MA. </li><li> Generierung von Standards von 5 bis 2500 pg / ml durch Verdünnung des 100 ng / mL-Arbeitsstandards mit 0,15 M HCl angesäuerter Blindurin frei von 3-NT zusammen mit leeren und doppelten Blindproben. </li><li> Eine Stammlösung von IS 13 C 9 -3-NT bei 100 μg / mL in Wasser mit MA vorbereiten und bei -20 ° C aufbewahren. </li><li> Machen Sie eine IS-Arbeitslösung bei 500 pg / ml durch Verdünnung der 100 μg / mL 13 C 9 -3-NT IS-Stammlösung mit MA. </li><li> Stellen Sie fünf Niveaus von QC-Proben fest, die das LLOQ, niedrige, mittlere und hohe Niveaus ( dh 10, 25, 100, 500 und 1.250 pg / ml) abdecken, durch Verdünnung des 3-NT-Arbeitsstandards im angesäuerten leeren Urin. </li></ol> 3. Festphasenextraktion <ol><li> Tau-und Vortex Urin Proben, Standards und QC Proben. </li><li> Fügen Sie Urin Proben, Standards und QC-SampLes (jeweils 250 &amp; mgr; l) bis 32 Vertiefungen einer sauberen 2 ml 96-Well-Sammelplatte. </li><li> Stellen Sie die 500 pg / ml IS-Arbeitslösung (50 μL) in jede Vertiefung vor, außer bei doppelter Blindprobe gut. Füge 0,01% HCOOH (50 μl) zu der doppelten Blindprobe gut hinzu. </li><li> Füge LC-MS / MS Wasser mit 0,1% HCOOH (250 μL) hinzu. </li><li> Mischen Sie die obige Mischung mit einer 8-Kanal-Pipette dreimal. </li><li> Abdeckung der Platte bis zum SPE-Laden. </li><li> Legen Sie eine MCX 96-well Extraktion Platte und ein Sammelbehälter auf einem positiven Druck Prozessor. </li><li> Bedingung der Extraktionsplatte mit fließendem MeOH (200 μL) durch das Sorptionsmittel. </li><li> Äquilibrieren durch Fließen von Wasser mit 2% HCOOH (200 μL) durch das Sorptionsmittel. </li><li> Laden Sie das gesamte Volumen jeder der vorgemischten Proben sorgfältig auf die vorkonditionierte Extraktionsplatte mit einer 8-Kanal-Pipette. </li><li> Setzen Sie einen niedrigen positiven Druck ( z. B. 3 psi) auf den positiven Druckprozessor, um zu ermöglichen, dass die Mischung durchströmtOust das Sorptionsmittel langsam, stellen Sie den Druck, wenn nötig. </li><li> Waschen Sie die Vertiefungen durch Fließen von Wasser mit 2% HCOOH (200 &amp; mgr; l) durch das Sorptionsmittel. </li><li> Waschen Sie die Vertiefungen durch Fließen von Methanol (200 &amp; mgr; l) durch das Sorptionsmittel. </li><li> Waschen Sie die Vertiefungen durch Fließen von Wasser (200 &amp; mgr; l) durch das Sorptionsmittel. </li><li> Trocknen Sie die Vertiefungen vollständig mit einer hohen positiven Druckeinstellung ( z. B. 40 psi) auf dem positiven Druckprozessor. </li><li> Ersetzen Sie das Reservoir durch eine saubere 2 mL 96-Well-Sammelplatte. </li><li> 25 mM NH 4 OAc bei pH 9 (50 μL) auftragen, um den zurückgehaltenen Analyten und IS aus der Extraktionsplatte zu eluieren. </li><li> LC-MS Wasser mit 5% HCOOH (50 μL) pipettieren, um das Eluat zu neutralisieren. </li><li> Mit der 8-Kanal-Pipette dreimal mischen und zur LC-MS / MS-Station zur Analyse einreichen. </li></ol> 4. LC-MS / MS-Analyse <ol><li> Messen Sie 2.000 mL LC-MS-Wasser mit einem Messzylinder genau und überführen Sie ihn in eine 2-l-Flasche. </li><li> PIpette 200 μl reines HCOOH in die obige Flasche, die LC-MS Wasser enthält. </li><li> Gründlich mischen und als mobile Phase A (MA) etikettieren. Include Initialen, Vorbereitungsdatum und Ablaufdatum. </li><li> Nehmen Sie eine 2-l-Flasche LC-MS Methanol und Etikett als mobile Phase B (MB) mit Startdatum und Verfallsdatum. </li><li> Stellen Sie die Temperatur des Auto-Samplers auf 4 ° C ein. </li><li> Legen Sie die Sammelplatte mit vorbereiteten Proben in den Autosampler. </li><li> Legen Sie eine PFP-Säule (150 mm x 2,1 mm id, 3 μm) und Schutzsäule in den Ofen. </li><li> Stellen Sie die Ofentemperatur auf 30 ° C ein. </li><li> Äquilibrieren Sie 10 min unter Verwendung des Erfassungsverfahrens mit der LC-Gradientenelution, wie in Tabelle 1 gezeigt . </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Zeit (min) </td><td> Modul </td><td> Veranstaltungen </td><td> Parameter </td></tr><tr><td> 0 </td><td> Pumps </td><td> Pumpe B konz. </td><td> 5 </td></tr><tr><td> 0,5 </td><td> Pumps </td><td> Pumpe B konz. </td><td> 20 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Pumps </td><td> Pumpe B konz. </td><td> 50 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> Pumps </td><td> Pumpe B konz. </td><td> 80 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Pumps </td><td> Pumpe B konz. </td><td> 90 </td></tr><tr><td> 4.01 </td><td> Pumps </td><td> Pumpe B konz. </td><td> 95 </td></tr><tr><td> 5.5 </td><td> Pumps </td><td> Pumpe B konz. </td><td> 95 </td></tr><tr><td> 5.6 </td><td> Pumps </td><td> Pumpe B konz. </td><td> 5 </td></tr><tr><td> 7 </td><td> Regler </td><td> Halt </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Flüssigchromatographie-Gradienten-Elutionsbedingungen <ol start="10"><li> Erstellen Sie eine Batch-Liste mitStandards, QC und Urinproben. </li><li> Starten Sie die Charge durch Injektion der vorbereiteten Proben (12 μL). </li></ol> 5. Peak Identification, Integration und Datenprozess <ol><li> Steuerung der Datenerfassung und -verarbeitung mit der Software. </li><li> Identifizieren und integrieren 3-NT- und IS-Peaks für alle Proben. </li><li> Stellen Sie eine Standardkurve mit einem Bereich von 10-2.500 pg / mL für die 3-NT-Quantifizierung durch lineare Regression des Peakflächenverhältnisses von 3-NT und IS gegenüber der nominalen 3-NT-Konzentration mit einem Gewichtungsfaktor von 1 / x fest. </li><li> Quantifizieren Sie alle Proben mit der Standardkurve. </li><li> Bestimmen Sie, ob die QC-Proben in den festgelegten Bereich fallen. </li><li> Umwandlung der detektierten Konzentrationen von Urinproben in endgültige Ergebnisse in der Einheit von nM oder nmol / mmol Cr. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt haben.

Wesentliche Schwankungen der bisher in der Literatur berichteten Konzentrationen für das endogene freie 3-NT in menschlichen Urinproben zeigen methodische Probleme, die mit den verfügbaren Assays 8 , 9 , 10 , 11 verbunden sind . Eine genaue Bestimmung des niedrigen Basalniveaus von 3-NT im menschlichen Urin bleibt eine anspruchsvolle Aufgabe, die besondere Vorkehrungen für die Probenvorbereitu...

Die Auswirkungen von oxidativem Stress auf die klinische Präsentation wurden in den letzten Jahren in den Vordergrund gerückt 1 . Einer der untersuchten Biomarker ist 3-Nitrotyrosin (3-NT), ein endstabiles Produkt, das gebildet wird, wenn reaktive Stickstoffspezies (RNS) mit Tyrosin, einem Catecholamin-Neurotransmitter-Vorläufer, zusammenwirken. Während 3-NT klinischen Wert als Biomarker für RNS in vivo haben kann, können die wesentlichen Veränderungen der Eigenschaften und Funktionen von Tyrosin die entsprechenden Proteine ​​und zellulären Funktionen 1 , 2 nachteilig beeinflussen. Emerging Research hat vorgeschlagen, dass 3-NT eine wichtige Rolle bei entzündlichen Zuständen spielen kann 3 , neurodegenerative Erkrankungen 4 , 5 , Herz-Kreislauf-Erkrankungen 6 und Diabetes 7 sowie Zustände im Zusammenhang mit oxidativem Stress. Doch diese obseRvations basiert auf Ergebnissen aus Methoden, denen keine Sensitivität und / oder Selektivität fehlt 8 , 9 , 10 , 11 . Die enormen 3-NT-Konzentrationsbereiche für die bisher in der Literatur berichteten biologischen Proben zeigen, dass mit diesen Assays ernsthafte analytische Probleme verbunden sind und technische Verbesserungen erforderlich sind, um die Niveaus von 3-NT genau zu quantifizieren und ihre Rolle in der Pathologie dieser Bedingungen zu überprüfen . Die Quantifizierung von freiem 3-NT in biologischen Matrizen stellt eine besondere Herausforderung für Mensch und Instrument 8 , 9 , 10 , 11 dar . Erstens verlangt der Spurengrad des endogenen 3-NT eine hochempfindliche Detektion; Zweitens die Existenz zahlreicher strukturell ähnlicher Analoga, insbesondere Tyrosin, die inGroßer Überschuss erfordert einen hohen Grad an Selektivität; Drittens erfordert die artefaktuelle Bildung von 3-NT durch Tyrosin-Nitrierung mit ubiquitärem Nitrat und Nitrit eine besondere Berücksichtigung während der Probenvorbereitung, um eine falsche Überschätzung von 3-NT zu vermeiden. Unter einer Vielzahl von Methoden, die zur Messung von 3-NT eingesetzt wurden, wurde MS / MS aufgrund seiner überlegenen Empfindlichkeit und Selektivität 11 , 12 , 13 , 14 als Goldstandardmethode angesehen. Gaschromatographie (GC) gekoppelte MS / MS bietet die beste Empfindlichkeit, jedoch sind die unentbehrlichen Probenderivatisierungsschritte zu langwierig und zeitaufwendig, um für den klinischen Nutzen 15 , 16 effizient zu sein. LC-MS / MS erfordert keine komplexe Musterderivatisierung und ist damit vielversprechender. Dennoch gibt es mehrere Hindernisse zu überwinden wie die seDie in der Literatur berichteten LC-MS / MS-Methoden müssen sich für die Messung von niedrigen 3-NT 7 , 17 , 18 verbessern und die relativ lange Durchlaufzeit für die Hochdurchsatzanwendungen 12 , 13 , 17 , 19 verkürzen . Darüber hinaus spielt bei der Betrachtung klinischer Anwendungen die verwendete biologische Matrix eine bedeutende Rolle. Es sollte einfach und kostengünstig zu erhalten und nicht-invasiv, wenn möglich 20 , 21 , 22 . Plasma, die traditionell verwendete Probe in der Literatur, ist keine klinisch wünschenswerte Matrix, so dass eine Methodik, die Urin verwendet, die nicht-invasiv und kostengünstig ist, gesucht wurde. Mehrere Versuche zu entwickeln relUnd spezielle LC-MS / MS-Methoden wurden mit Urin 9 , 10 , 11 gemacht . Allerdings haben sie alle nicht selektiv, zuverlässig oder effizient genug für die klinische Anwendung. Die Effektivität der vorherrschenden SPE mit herkömmlicher Umkehrphasenpatrone (C18-Typ) als Probenreinigung für die 3-NT-Analyse wurde in Frage gestellt und eine sequentielle SPE von starkem Kationenaustausch (SCX) und umgekehrter Phase C18-OH wurde vorgeschlagen 6 , 7 , 19 Eine kürzlich entwickelte LC-MS / MS-Methode verwendete ein mehrstufiges Reinigungsverfahren von manueller C18 SPE, präparative Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) und Online-SPE zur Analyse von 3-NT 23 . Obwohl diese Methode für klinische Zwecke empfindlich genug war, mit einem LLOQ von 0,041 nM, war der Cleanup-Prozess intensiv und langwierig und requiRote 3 ml Urin, die ihre Durchführbarkeit für Hochdurchsatz begrenzt. Ein molekular geprägtes Polymer wurde als SPE-Sorptionsmittel verwendet, um die Effizienz des Reinigungsverfahrens 14 zu verbessern, aber das resultierende LLOQ (0,7 &amp; mgr; g / ml) war für klinische Proben nicht niedrig genug. Eine andere Methode erforderte zweidimensionale (2D) LC-MS / MS- und Immunoaffinitätschromatographie zur Probenreinigung, um eine Nachweisgrenze (LOD) von 0,022 nM 24 zu erreichen . Während alle diese Methoden Fortschritte bei der Bewertung von 3-NT gemacht haben, hat keiner die Empfindlichkeit, Zuverlässigkeit und Effizienz für klinische Anwendungen erreicht. Um die Pathologie der freien 3-NT und seine Rolle als Biomarker für oxidativen Stress im klinischen Umfeld zu untersuchen, haben wir eine Methode entwickelt , die einfache, effiziente, genaue und präzise ist, so dass für Hochdurchsatz - klinische Anwendungen 25. Ein miniaturisierter Mischmodus Kation exc(MCX) 96-well Extraktion Mikroplatte wurde implementiert, um eine einfache und effektive Probenreinigung und Anreicherung von 3-NT in einer einzigen Extraktion zu erreichen, die die Nachteile bei den bestehenden Methoden, die eine Derivatisierung, Verdampfung und 2D-LC erfordern, umgehen. Die Flüssigkeitschromatographie mit 0,01% HCOOH als Additiv in der mobilen Phase lieferte eine verbesserte Signalantwort mit einer schnellen Zykluszeit. Die Selektivität wurde durch die Anwendung einer milden NH 4 OAc-Elutionslösung für die selektive Elution von 3-NT und die Verwendung des MRM-Übergangs für sowohl 3-NT als auch den internen Standard (IS) weiter verbessert. Der Matrixeffekt wurde durch die Verwendung einer reduzierten Menge eines bevorzugten 13 C-markierten Isotopen IS zur Quantifizierung kompensiert. Mit dem Aufkommen dieser Methodik werden Forscher und Kliniker in der Lage sein, die Rolle von 3-NT in klinischen Zuständen zu überprüfen und die Auswirkungen von oxidativem Stress weiter zu erforschen.

<table><tbody><tr><td>3-Nitro-L-Tyrosin</td><td>Sigma</td><td>N7389-5g</td><td></td></tr><tr><td>3-Nitro-L-Tyrosin-13C9</td><td>Sigma</td><td>652296-5.0mg</td> Massenspektrometer <td></td></tr><tr><td>Gold Urin</td><td>Golden West Biologicals</td><td>MSG 5000-1L</td><td></td></tr><tr><td>Oasis MCX 96-well & Mikro; Elutionsplatte</td><td>Waters</td><td>186001830BA</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 96 Well-Sammelplatte</td><td>Phenomenex&nbsp; &nbsp;</td><td>AH0-7194</td><td></td></tr><tr><td>96 positiver Prozessor</td><td>Wasser&nbsp;</td><td></td><td></td>186005521</tr><tr><td>LC-MS Ultra CHROMASOLV Methanol&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>14262-2L</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS Ultra CHROMASOLV Wasser</td><td>Sigma</td><td>14263-2L</td><td></td></tr><tr><td>Ameisensäure für die Massenspektrometrie</td><td>Sigma</td><td>94318-50ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumhydroxidlösung</td><td>Sigma</td><td>338818-1L</td><td></td></tr><tr><td>Ultra PFP Propylsäulen</td><td>Restek</td><td>9179362</td><td></td></tr><tr><td>5500 Triple Quad</td><td>AB Sciex&nbsp;</td><td>/</td><td>Kontaktieren Sie den Hersteller für weitere Details</td></tr><tr><td>UFLC-XR</td><td>Shimadzu&nbsp;</td><td>/</td><td>Kontaktieren Sie den Hersteller für weitere Informationen</td></tr><tr><td>Integra 400 Plus&nbsp;</td><td>Roche</td><td>/</td><td>Kreatinin Jaff&eakut im Urin; Gen 2 Methode</td></tr><tr><td>LCMS-zertifiziert 12 x 32 mm Fläschchen mit Schraubhals</td><td>Wasser</td><td>600000751CV</td><td></td></tr><tr><td>LCGC-zertifiziert 12 x 32 mm Fläschchen mit Schraubhals und vollständiger Rückgewinnung</td><td>Wasser</td><td>186000384C</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Transportröhrchen</td><td>Phenix</td><td>TT-3205</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>Kristallinen&nbsp;</td><td>23-2263</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>kristallgen&nbsp;</td><td>23-2266</td><td></td></tr><tr><td>eLine elektronische Pipette</td><td>Sartorius</td><td>730391</td><td></td></tr><tr><td>Mikrofuge-Zentrifuge&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>A46474</td><td></td></tr><tr><td>OHAUS Auswucht&nbsp; &nbsp;</td><td>Kennedy Scales, Inc.</td><td>735</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Mischer&nbsp;</td><td>Bernstead Thermolyne</td><td>M16715</td><td></td></tr></tbody></table>

integration von miniaturisierter festphasenextraktion und lc-ms / ms-nachweis von 3-nitrotyrosin im menschlichen urin für klinische anwendungen

Integration of Miniaturized Solid Phase Extraction and LC-MS/MS Detection of 3-Nitrotyrosine in Human Urine for Clinical Applications

Freies 3-Nitrotyrosin (3-NT) wurde weitgehend als möglicher Biomarker für oxidativen Stress eingesetzt. Erhöhte Niveaus von 3-NT wurden in einer Vielzahl von pathologischen Bedingungen berichtet. Allerdings fehlt es den vorhandenen Methoden an der ausreichenden Empfindlichkeit und / oder Spezifität, die notwendig sind, um das niedrige endogene Niveau von 3-NT zuverlässig zu messen und für klinische Anwendungen zu schwerfällig zu sein. Daher ist eine analytische Verbesserung dringend erforderlich, um die Niveaus von 3-NT genau zu quantifizieren und die Rolle von 3-NT in pathologischen Zuständen zu überprüfen. Dieses Protokoll stellt die Entwicklung einer neuartigen Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS / MS) -Erkennung in Kombination mit einer miniaturisierten Festphasenextraktion (SPE) für die schnelle und genaue Messung von 3-NT im menschlichen Urin als nicht-invasiven Biomarker dar Für oxidativen Stress SPE mit einer 96-Well-Platte vereinfachte den Prozess durch die Kombination von Probenreinigung und Analytanreicherung ohne mühsame Derivatisierungs- und Verdampfungsschritte deutlich, Verringerung des Lösemittelverbrauchs, Abfallentsorgung, Verunreinigungsgefahr und Gesamtverarbeitungszeit. Die Verwendung von 25 mM Ammoniumacetat (NH 4 OAc) bei pH 9 als SPE-Elutionslösung verbesserte die Selektivität wesentlich. Die Massenspektrometrie-Signalantwort wurde durch die Einstellung der MRM-Übergänge (MRM) verbessert. Die Verwendung von 0,01% HCOOH als Additiv auf einer Pentafluorphenyl (PFP) -Säule (150 mm x 2,1 mm, 3 μm) verbesserte die Signalantwort weiter 2,5-fach und verkürzte die Gesamtlaufzeit auf 7 min. Es wurde eine untere Grenze der Quantifizierung (LLOQ) von 10 pg / ml (0,044 nM) erreicht, was eine signifikante Empfindlichkeitsverbesserung gegenüber den angegebenen Assays darstellt. Diese vereinfachte, schnelle, selektive und empfindliche Methode erlaubt es, zwei Platten von Urinproben (n = 192) in einer 24-Stunden-Zeitspanne zu verarbeiten. In Anbetracht der deutlich verbesserten analytischen Leistungsfähigkeit und der nicht-invasiven und kostengünstigen Urinprobenentnahme ist der vorgeschlagene Assay für präklinische und klinische Zwecke von VorteilStudien.

Fig. 1 veranschaulicht, daß 3-NT vollständig chromatographisch von anderen strukturell ähnlichen Tyrosin-Analoga unter der optimierten LC-Bedingung getrennt ist, was die Co-Elutions-Interferenzen aufgrund dieser stark übermäßigen Verbindungen eliminiert und folglich den Grad der Assay-Selektivität erhöht. Darüber hinaus ermöglicht die Gradientenelution mit 0,01% HCOOH als Additiv in MA und Methanol bei einer Durchflussrate von 0,45 mL / min eine schnelle Elu...

Ein selektives und empfindliches Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrieverfahren (LC-MS / MS), gekoppelt mit einer effizienten Festphasenextraktion auf einer gemischten Kationenaustausch- (MCX) 96-Well-Mikroplatte, wurde für die Messung von freiem 3-Nitrotyrosin ( 3-NT) im menschlichen Urin mit hohem Durchsatz, der für klinische Anwendungen geeignet ist.

Integration von miniaturisierter Festphasenextraktion und LC-MS / MS-Nachweis von 3-Nitrotyrosin im menschlichen Urin für klinische Anwendungen

Free 3-nitrotyrosine (3-NT) has been extensively used as a possible biomarker for oxidative stress. Increased levels of 3-NT have been reported in a wide ...

Das übergeordnete Ziel dieser miniaturisierten Festphasenextraktion in Kombination mit einem LC-MS/MS-Assay besteht darin, freies 3-Nitrotyrosin im menschlichen Urin für klinische Anwendungen genau zu quantifizieren. Freies 3-Nitrotyrosin liefert Erkenntnisse und dient als Biomarker für oxidativen Stress. Es bleibt jedoch eine besondere Herausforderung, 3-Nitrotyrosin in biologischen Proben für klinische Anwendungen genau zu quantifizieren, da die derzeitigen Methoden unzureichende Empfindlichkeit, Selektivität sowie aufwändige Probenvorbereitungen aufweisen.Diese Technik, die eine effektive Festphasenextraktion in einer hochsensitiven LC-MS/MS-Analyse kombiniert, ermöglicht eine schnelle, spezifische und genaue Bestimmung geringer Konzentrationen endogenen 3-Nitrotyrosins in menschlichem Urin, ohne dass eine Probenaufkonzentrierung oder eine zweidimensionale LC erforderlich ist. Obwohl diese Methode Einblicke in die Untersuchung von oxidativem Stress ermöglicht, kann sie auch auf andere pathologische Zustände wie komplexe entzündliche und neurodegenerative Erkrankungen angewendet werden. Die Bedeutung dieser Technik könnte sich auf die Überwachung der Wirksamkeit von antioxidative

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Chemie

Angesichts Speichel Probenahme für zukünftige klinische Anwendung wurde ein Lollipop-ähnliche Ultrafiltration (LLUF) Sonde hergestellt, um in die menschliche Mundhöhle passen. Direkte Analyse von unverdauten Speichel mit nanoLC-LTQ Massenspektrometrie zeigten die Fähigkeit von LLUF Sonden, um große Proteine ​​und hohe Abundanz Proteine ​​zu entfernen, und machen Low-reiche Peptide mehr nachweisbar.

Probenahme menschliche Speichel Indigene Peptidoms Mit einem Lollipop-Like Ultrafiltration Sonde: vereinfachen und erweitern Peptid-Erkennung für Klinische Massenspektrometrie

Untargeted metabolomics stellt eine Hypothese generieren Momentaufnahme eines metabolischen Profils. Dieses Protokoll wird zeigen, die Extraktion und Analyse von Metaboliten von Zellen, Serum oder Gewebe. Eine Reihe von Metaboliten werden mit flüssigem befragten-Flüssigphasenextraktion, Mikroströmungsfühler UltraPerformance Flüssigkeits-Chromatographie / hochauflösende Massenspektrometrie (UPLC-HRMS), gekoppelt mit Differential-Analyse-Software.

Untargeted Metabolomics aus biologischen Quellen Mit UltraPerformance Flüssigkeits-Chromatographie-hochauflösender Massenspektrometrie (UPLC-HRMS)

Ein schnelles Protokoll für den proteolytischen Aufschluss mit einem hausgemachten Durchfluss-Tryptik-Mikroreaktor, der mit einem Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometer (ESI) gekoppelt ist, wird vorgestellt. Die Herstellung des Mikroreaktors, der Versuchsaufbau und der Datenerfassungsprozess werden beschrieben.

Schnelle enzymatische Prozessierung von Proteinen für MS-Detektion mit einem Durchfluss-Mikroreaktor

Α-Hydroxylierung von krebserregenden Nitrosaminen durch Cytochrom P450s ist der anerkannte Stoffwechselweg, der DNA-schädigenden Zwischenprodukte, produziert die Mutationen verursachen. Neue Daten gibt jedoch weitere Oxidation zu Nitrosamides auftreten kann. Wir beschreiben eine allgemeine Methode zur Erkennung von Nitrosamides aus in-vitro- Cytochrom P450-katalysierte Metabolismus von Nitrosaminen hergestellt.

Eine allgemeine Methode zur Erkennung von Nitrosamide Formation in der In-vitro- Metabolismus von Nitrosaminen durch Cytochrom P450s

Wir präsentieren eine bequeme Festphasen-Extraktion gekoppelt an Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) mit elektrochemischen Detektion (ECD) für die gleichzeitige Bestimmung von drei Monoamin-Neurotransmittern und zwei ihrer Metaboliten im Urin von Säuglingen. Wir erkennen auch der Metabolit MHPG als potenzielle Biomarker für die Früherkennung von Schädigungen des Gehirns für Kleinkinder.

Eine bequeme Methode für die Extraktion und Analyse mit Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie Katecholamin Neurotransmitter und deren Metabolite

Wir präsentieren Ihnen eine Methode, um 3 Nitrotyrosine chemische Veränderungen der atmosphärischen Proteine mit 6 mm Durchmesser runden Schnitt von Luft Sampler Tiefenfilter mit einem Hochleistungs-flüssige Chromatographie-elektrochemischen Detektor (HPLC-ECD) zu erkennen.

Erkennung von 3-Nitrotyrosine in atmosphärischen Umgebungen über eine High-Performance Liquid Chromatography-elektrochemischen Detektor-System

Hier beschreiben wir eine Hochdurchsatz-Verfahren zur umfassenden Droge-Überwachung, die für die verbesserte Auflösung und Erkennung von großen Platten von Medikamenten, Missbrauch und deren Metabolite mit Qualitätskontrolle auf multisegment-Injektion-Kapillare ermöglicht Elektrophorese-Massenspektrometrie.

High-Throughput und umfassende Droge-Überwachung mittels Massenspektrometrie Multisegment-Injektion-Kapillar-Elektrophorese

Die proteomische Profilierung von Tyrosin-Nitrat-Proteinen war aufgrund der geringen Häufigkeit der 3-Nitrotytyrosin-Modifikation eine anspruchsvolle Technik. Hier beschreiben wir einen neuartigen Ansatz für die Nitropeptidanreicherung und Profilierung unter Verwendung von Angiotensin II als Modell. Diese Methode kann für andere In-vitro- oder In-vivo-Systeme erweitert werden.

Nitropeptid Profilierung und Identifikation illustriert von Angiotensin II

Beschrieben wird hier ein Protokoll zur Bestimmung von vier verschiedenen Tryptophan-Metaboliten, die im Kynurenin-Signalweg (Kynurenin, 3-Hydroxykynurenin, Xanthurensäure, 3-Hydroxyanthranilsäure) in dem Medium erzeugt werden, das aus Krebszellkulturen gesammelt wird, die durch flüssige Chromatographie in Verbindung mit einer einzigen Quadrupol-Massenspektrometrie analysiert werden.

Gleichzeitige Quantifizierung ausgewählter Kynurenine, analysiert durch Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

Dieses Protokoll beschreibt einen CRISPR-Cas-vermittelten, synthetischen Multianalyt-Urin-Biomarker-Test, der eine Point-of-Care-Krebsdiagnostik durch die Ex-vivo-Analyse tumorassoziierter Proteaseaktivitäten ermöglicht.

CRISPR-Cas-vermittelter synthetischer Multianalyt-Urin-Biomarker-Test für tragbare Diagnostik

Erfahren Sie die miniaturisierte Festphasenextraktion mit LC-MS/MS zur Quantifizierung von 3-Nitrotyrosin im menschlichen Urin. Diese hochsensitive Methode ermöglicht klinische Anwendungen zur Untersuchung von oxidativem Stress.

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Integration von miniaturisierter Festphasenextraktion und LC-MS / MS-Nachweis von 3-Nitrotyrosin im menschlichen Urin für klinische Anwendungen

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