Eine allgemeine Methode zur Erkennung von Nitrosamide Formation in der In-vitro- Metabolismus von Nitrosaminen durch Cytochrom P450s

Das übergeordnete Ziel dieser Methodik ist es, zu bestimmen, ob Cytochrom P450s in vitro prozessiv n Nitrosamine zu n Nitosamiden oxidieren kann. Diese Methode kommt der Toxikologie zugute, indem sie untersucht, ob Nitosamine direkt zu Nitrosamiden metabolisiert werden. Da Nitrosamide in der Alkylat-DNA relativ stabil sind, könnten sie eine Rolle bei der Krebsentstehung spielen.

Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Verwendung eines hochempfindlichen Massenspektrometers, das niedrigere Nachweisgrenzen als bisher für ähnliche In-vitro-Nitrosamin-Metabolismus-Assays erreicht. Um diesen Vorgang zu beginnen, stellen Sie einen 25-Milliliter-Rundkolben mit einem magnetischen Rührstab in einen Ofen. 16 Stunden bei 140 Grad Celsius trocknen.

Danach wird der Kolben in einen Abzug umgefüllt und unter einem Strom von Stickstoffgas abgekühlt. 31,8 mg Norcotinin, fünf Milliliter Essigsäureanhydrid und einen Milliliter Essigsäure in den Kolben geben und mit dem Rühren beginnen. Den Kolben in ein Eiswasserbad geben.

Fügen Sie 33,3 Milligramm Natriumnitrit hinzu. Rühren Sie 2,5 Stunden lang weiter und gießen Sie dann die Reaktion in 18 Milliliter eiskaltes Wasser, um die Reaktion zu löschen. Übertragen Sie die Lösung sofort in einen Scheidetrichter mit 18 Millilitern DCM und extrahieren Sie die wässrige Lösung.

Extrahieren Sie die wässrige Schicht zwei weitere Male mit jeweils 9 Millilitern DCM. Trocknen Sie anschließend die gepoolten organischen Stoffe über 100 Milligramm Magnesiumsulfat für zwei Minuten. Verwenden Sie nach dem Filtern einen Rotationsverdampfer, um die Lösung auf 30 Grad Celsius zu konzentrieren, um ein rohes gelbes Öl zu erhalten.

Reinigen Sie die Rohverbindung mit Hilfe der Säulenchromatographie, wie im Textprotokoll beschrieben. Danach lösen Sie die reine Verbindung in einem Milliliter deuteriertem Chloroform auf. Bestätigen Sie mit Hilfe der NMR die Struktur und Molarität der Lösung, wie im Textprotokoll beschrieben.

Lagern Sie diese Lösung bis zur Verwendung im Dunkeln bei einer Temperatur zwischen zwei und acht Grad Celsius. Bestätigen Sie dann die genaue Ausgangsmasse und bestimmen Sie die Produktionsionenmassen der reinen NNC-Lösung durch direkte Infusion auf einem hochauflösenden Massenspektrometer, wie im Textprotokoll beschrieben. Nehmen Sie zunächst die benötigten Reagenzien aus einem 80 Grad Celsius warmen Gefrierschrank und tauen Sie sie auf Eis auf.

Nach dem Auftauen verwenden Sie einen Reaktionspuffer mit einer Stärke von 0,5, um die Baculosomen im NADPH-Regenerationssystem 1-10 bzw. 1-50 in einem Ein-Milliliter-Röhrchen zu verdünnen. Geben Sie als nächstes drei Mikroliter der NADP-Stammlösung in ein Ein-Milliliter-Röhrchen mit 97 Mikrolitern eines Reaktionspuffers der Stärke 0,5. Für jede Inkubation wird ein Ein-Milliliter-Röhrchen vorbereitet, indem 40 Mikroliter einer viermikromolaren NNN-Lösung mit Reaktionspuffer hinzugefügt werden.

50 Mikroliter Enzymlösung mit fünf Picomolen P450 2A6 werden in jedes Röhrchen gegeben. In einem Wasserbad bei 37 Grad zwei Minuten lang vorinkubieren. Geben Sie dann 10 Mikroliter verdünnte NADP+-Lösung in jedes Röhrchen.

Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für eine bis 30 Minuten. Fügen Sie danach zuerst 10 Mikroliter 3,0 normales Zinksulfat hinzu und fügen Sie dann 10 Mikroliter 3,0 normales Bariumhydroxid hinzu, um die Reaktion zu löschen. Die Lösung verzerren und zu einem weißen Niederschlag verrühren.

Zentrifugieren Sie anschließend vier Minuten lang bei achttausend G. Sammeln Sie sofort den Überstand und analysieren Sie zwei Mikroliter durch Flüssigkeitschromatographie, positive Nanoelektrospray-Ionisation, hochauflösende Tandem-Massenspektrometrie. In dieser Studie wird Norcotinin sauber und in hoher Ausbeute zu NNC nitrosiert, wodurch ein Standard für die Verwendung im In-vitro-Experiment hergestellt wird.

Der Erfolg der Reaktion wird durch spektroskopische Analysen verifiziert, einschließlich hochauflösender Tandem-Massenspektrometrie, die bestätigte, dass die Masse des Elternteils innerhalb von fünf ppm des theoretischen Wertes liegt. Die Tandem-Massenspektrometrie-Fragmentierung von NNC wird dann verwendet, um die am häufigsten vorkommenden produktiven Ionenmassen zu bestimmen. Wie man sehen kann, sind die beiden am häufigsten vorkommenden Produktionen 134 und 162, mit einer genauen Massendetektion bis auf fünf Dezimalstellen.

Das synthetisierte NNC wird dann als Standard für den in vitro P450-Metabolismus-Assay verwendet. Unter den verwendeten Bedingungen eluiert die synthetische NNC nach etwa 17,5 Minuten, mit gut aufgelösten Peaks sowohl in den Ionen- als auch in den Produktionenkanälen des Elternteils. In Übereinstimmung mit der Positivkontrolle wird die NNC-Bildung in den Inkubationen von einer Minute, fünf Minuten und 10 Minuten beobachtet.

Bei ordnungsgemäßer Durchführung kann die spektroskopische Analyse der Nitrosamidsynthese in etwa sechs Stunden durchgeführt werden. Ebenso sollte der In-vitro-Assay mit mehreren Inkubationen nicht länger als acht Stunden dauern. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Risikobewertung von tabakbedingten Krebserkrankungen, da die Messung von Nitrosamid-verwandten Biomarkern Aufschluss über die individuelle Nitrosaminaktivierung geben könnte.

Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, daran zu denken, Enzyminkubationen schnell zu verarbeiten. Nitrosamide hydrolysieren unter diesen Bedingungen und sollten nicht lange vor der Massenspektrometrie-Analyse sitzen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Nitrosamidstandards herstellt und bewertet, ob sie in vitro durch das richtige Nitrosamin-Cytochrom-P450-System gebildet werden.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit NNN, NNC oder verwandten Karzinogenen gefährlich sein kann. Diese Verbindungen sollten immer in einem Abzug gehandhabt werden, während Sie einen Laborkittel, eine Schutzbrille und Handschuhe tragen. Darüber hinaus sollten alle krebserregenden Abfälle ordnungsgemäß gelagert und gekennzeichnet werden.