Nicht-invasive Probenahme von Schleimhaut-Flüssigkeit für die Quantifizierung von In Vivo oberen Atemwegen immun-Mediator-Level
7. August 2017
Dieses Protokoll beschreibt eine nicht-invasive Technik für die Entnahme von ungestörten Schleimhaut Flüssigkeit aus den oberen Atemwegen. Es kann verwendet werden, die Quantifizierung der in Vivo -Level von Protein Mediatoren wie Zytokine und Chemokine, bei Patienten aller Altersgruppen durchführen.
Das übergeordnete Ziel dieser Methode zur Probenahme von Schleimhautflüssigkeiten ist es, die lokale Immunsignatur der Atemwege zu untersuchen, ohne dass Stimulationsverfahren erforderlich sind. Mit dieser Methode können Sie Schlüsselfragen im Bereich der pädiatrischen Atemwegserkrankungen wie Infektionen, Asthma und Allergien untersuchen. Die Vorteile der Methode bestehen darin, dass Sie in vivo sehr geringe Konzentrationen von Immunmediatoren in der unstimulierten Atemwegsschleimhaut messen können.
Die Demonstration des Eingriffs wird von Dr. Wolsk durchgeführt. Schneiden Sie für die Entnahme von Neugeborenenproben zunächst mindestens zwei drei x 15 Millimeter große Streifen aus faserigen hydroxylierten Polyester-Filterschichten ab. Legen Sie das Neugeborene anschließend auf ein Bett und achten Sie auf alle Symptome einer Atemwegsinfektion.
Führen Sie dann mit einer Pinzette ein Stück Filterpapier etwa einen Zentimeter in den vorderen Teil der unteren Nasenmuschel jedes Nasenlochs des Säuglings ein und verabreichen Sie dem Neugeborenen bei Bedarf Zuckerwasser, um es zu beruhigen. Achten Sie auf Niesen, anhaltendes Weinen oder Nasenbluten, die während des Probenahmezeitraums auftreten. Nach zwei Minuten Absorption werden die Filterpapiere zur sofortigen Lagerung bei minus 80 Grad Celsius in ein beschriftetes Röhrchen überführt.
Das experimentelle Verfahren wird von Lisbeth Rosholm, einer Technikerin in meinem Labor, vorgeführt. Für die Quantifizierung von Immunmediatoren der Atemwege legen Sie bis zu 10 Proben aus einer Lagerung bei minus 80 Grad Celsius auf Eis und notieren Sie ihre Identifikationsnummern. Wenn die Proben aufgetaut sind, tauchen Sie beide Filterpapiere pro Subjekt in 150 Mikroliter frisch zubereiteten Puffer pro Filterpapier, ergänzt mit einer vollständigen Proteasehemmer-Tablette pro 25 Milliliter Pufferstofflösung.
Die Proben werden fünf Minuten lang bei 400 U/min in einen Plattenschüttler überführt. Übertragen Sie den Puffer und das Filterpapier in die Becher der einzelnen Celluloseacetat-Schlauchfilter. Zentrifugieren Sie die Proben, um den gefilterten Nasenextrakt am Boden der Mikrozentrifugenröhrchen zu sammeln.
Nehmen Sie dann die Becher heraus und legen Sie die Röhrchen auf Eis. Als nächstes werden 150 Mikroliter Aliquots des Nasenextrakts in einzelne Vertiefungen mit Speicherplatten mit geringer Proteinbindung überführt und die Platten bis zur Analyse bei minus 80 Grad Celsius gelagert. Messen Sie dann die Konzentration der nasalen Immunmediatoren von Interesse mit einem hochempfindlichen Elektrochemilumineszenz-basierten Multiplex-Array gemäß Standard-Assay-Protokollen.
In dieser repräsentativen Analyse von 620 Neugeborenen zeigten die meisten der gemessenen Immunmediatoren einen geringen Nachweis. Die IFN-Gamma-Spiegel lagen in fast der Hälfte der Proben unter der unteren Nachweisgrenze, während die TNF-alpha-, CCL4- und TGF-beta-Spiegel in weniger als 1 % der Proben unter der unteren Nachweisgrenze lagen. Für die 20 detektierten Mediatorstufen zeigte sich eine starke Multikollinearität, wie eine Heatmap zeigt.
Bei asymptomatischen Picornavirus-infizierten Neugeborenen wurde ein hochreguliertes Profil beobachtet, das hauptsächlich von Typ-1-Immunmediatoren beeinträchtigt war, was auf eine immunauslösende Rolle der Besiedlung von Bakterien und Viren in der frühesten Lebensphase hindeutet. Es wurde auch ein Zusammenhang zwischen der Anwesenheit von Geschwistern im Haushalt bei der Geburt und einer spezifischen Typ-1-Typ-17-gerichteten Schleimhautimmunantwort festgestellt, wobei eine Korrelation dieses Phänomens mit einem in utero-Immun-Priming-Effekt nachgewiesen wurde, der umgekehrt mit der Zeit seit der letzten Geburt korreliert. Darüber hinaus waren Kinder von Müttern, die hohe Präparate im Vergleich zu Placebo-Präparaten erhielten, durch eine Hochregulierung spezifischer Immunmediatoren gekennzeichnet, was darauf hindeutet, dass Vitamin D eine antibakterielle Immunantwort fördert, die unabhängig von der durch Viren, Bakterien, Geschwister oder mütterliche Atopie induzierten Immunantwort ist.
Diese Methode der Mikroprobenahme kann auch mit einem Bronchoskop verwendet werden, um die Immunmediatoren in den unteren Atemwegen zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Mediatoren in der unstimulierten Atemwegsschleimhaut in vivo bei Neugeborenen und älteren Kindern misst.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt eine nichtinvasive Technik zur Gewinnung ungestörter Schleimhautausstriche aus den oberen Atemwegen. Sie ermöglicht die Quantifizierung der in-vivo-Spiegel von Proteinmediatoren wie Zytokinen und Chemokinen bei Probanden jeden Alters.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Atemwegserkrankungen
- Immunologie
- Pädiatrie
Hintergrund
- Diese Methode untersucht die lokale Immunsignatur der Atemwege ohne Stimulationsverfahren.
- Sie ist anwendbar auf pädiatrische Atemwegserkrankungen wie Infektionen, Asthma und Allergien.
- Die Technik ermöglicht die Messung geringer Konzentrationen von Immunvermittlern in der unstimulierten Atemwegsschleimhaut in vivo.
- Die Demonstration des Verfahrens erfolgt durch Dr. Wolsk.
Zweck der Studie
- Untersuchung der Immunantwort in der Atemwegsschleimhaut.
- Gewinnung von Erkenntnissen zu respiratorischen Erkrankungen im Kindesalter.
- Ermöglichung nichtinvasiver Probennahmetechniken für die Forschung.
Verwendete Methoden
- Sammlung von Schleimhautflüssigkeit aus den oberen Atemwegen.
- Verwendung von faserigen, hydroxylierten Polyesterfilterfolien zur Probenentnahme.
- Beobachtung von Symptomen einer Atemwegsinfektion bei Neugeborenen.
- Quantifizierung von Zytokinen und Chemokinen in den gesammelten Proben.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Gewinnung von Schleimhautausstrichen ohne invasive Verfahren.
- Möglichkeit zur Messung immunvermittelter Substanzen in vivo.
- Erkenntnisse zum Immunprofil von pädiatrischen Patienten.
- Potenzielle Anwendungen beim Verständnis von Atemwegserkrankungen.
Schlussfolgerungen
- Die nichtinvasive Probennahmemethode ist wirksam für die Untersuchung der Atemwegsimmunität.
- Diese Technik kann die Forschung zum Atemwegsstatus bei Kindern verbessern.
- Zukünftige Studien könnten die Erkenntnisse zu immunvermittelnden Substanzen erweitern.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese nichtinvasive Methode zur Gewinnung von Schleimhautausstrichen ermöglicht die direkte Quantifizierung von in vivo vorhandenen Immunmediatoren in der Mukosa der oberen Atemwege ohne vorherige Stimulation und liefert somit einen physiologisch relevanten Nachweis der immunologischen Aktivität der Atemwege. Die Technik ermöglicht die Immunprofilerstellung in der Frühphase des Lebens sowie die longitudinale Überwachung und unterstützt dadurch die mechanistische Entlastung von Risiken bei der Entwicklung respiratorischer Therapeutika, indem genetische und umweltbedingte Expositionen mit Immunphänotypen verknüpft werden. Ihre Anwendung in neonatalen und pädiatrischen Kohorten bietet einen prädiktiven Wert für die Endotypprofilierung und die Beobachtung des Krankheitsverlaufs, insbesondere im Zusammenhang mit Asthma, Allergien und Infektionskrankheiten.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch die Messung von Grund- und induzierten Spiegeln immunvermittlernder Substanzen in nicht stimuliertem Schleimhautgewebe.
- Operativer Wert: Bietet eine reproduzierbare, minimalinvasive Matrix zur funktionellen Zielvalidierung in pädiatrischen Populationen.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die biologische Ent-Risikobewertung durch die Korrelation von Mediatorprofilen mit klinischen Phänotypen wie asymptomatischen Virusinfektionen und Effekten der Exposition gegenüber infizierten Geschwistern.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Eignung: Erzeugt eluierte Proteinpulsen, die mit hochsensitiven elektrochemilumineszenten Multiplex-Anordnungen zur quantitativen Immunprofillierung kompatibel sind.
- Standardisierung: Verwendet konsistente Protokolle zur Absorption und Elution auf Filterpapier, um eine reproduzierbare Rückgewinnung von Analyten über verschiedene Probanden und Zeitpunkte hinweg sicherzustellen.
- Skalierbarkeit: Zeigte Machbarkeit in großen neonatalen Kohorten (n=620), was Hochdurchsatz-Screening-Anwendungen in epidemiologischen und interventionsbasierten Studien unterstützt.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Ermöglicht die Längsschnittuntersuchung von der Geburt bis ins Kindesalter und verknüpft immunologische Profile des frühen Lebens mit späteren Atemwegserkrankungen.
- Biomarker-Korrelation: Weist eine Hochregulation von Immunvermittlern des Typ-1- und Typ-17-Systems bei asymptomatischen, mit Picornaviren infizierten Neugeborenen nach und legt damit ihre Eignung zur Identifizierung immunologischer Endotypen nahe.
- Mechanistische Entlastung: Zeigt Assoziationen zwischen der Supplementierung von Vitamin D während der Schwangerschaft und antibakteriellen Immunantworten auf und unterstützt dadurch die Priorisierung von Zielstrukturen für immunmodulatorische Interventionen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode ist in die Entdeckungsbiologie-Phase integriert, indem sie die direkte Messung immunvermittelter Substanzen in vivo ermöglicht und somit die Zielstrukturauswahl und Aufklärung von Signalwegen vor der Identifizierung von Leitverbindungen unterstützt.
- Entdeckungsbioanalyse: Unterstützt die Hypothesenprüfung der Aktivierung immunologischer Signalwege im Schleimhautgewebe ohne ex vivo-Manipulation oder Stimulation künstlicher Effekte.
- Screening: Erzeugt standardisierte Eluate, die für multiplexe Immunassays geeignet sind und den vergleichenden Auswertungen zwischen Behandlungs- oder Expositionsgruppen erleichtern.
- Analytik: Erstellt quantitative Werte für Mediatoren, die statistische Bewertungen von Kollinearität, Aktivität immunologischer Netzwerke und Assoziationen zu Phänotypen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verbindet neonatale Immunprofile mit Atemwegssymptomen im Kindesalter und Umweltexpositionen und unterstützt so entscheidungsrelevante Risikoeinschätzungen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt eine plattformkompatible Probennahmetechnik dar, die in verschiedenen Modellen respiratorischer Erkrankungen und therapeutischen Verfahren Anwendung finden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet eine vorhersagbare Sicherheit bei der Zielvalidierung, indem die endogene Immunaktivität im nativen Schleimhaut-Mikromilieu erfasst wird.
- Operationaler Wert: Stellt durch standardisierte Sammlungs-, Elutions- und Lagerungsverfahren die Reproduzierbarkeit sicher und minimiert präanalytische Variabilität.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch, indem immunmodulatorische Mechanismen mit immunologischen Profilen des frühen Lebensabschnitts verknüpft werden, wodurch das biologische Risiko in späteren Phasen bei Atemwegsprogrammen verringert wird.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Kandidaten basierend auf nachgewiesenen Effekten auf Schleimhaut-Immunwegen in relevanten, longitudinalen humanen Modellen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Schulung in der neonatalen Atemwegsanatomie und eine schonende Probenahmetechnik, um den Komfort der Probanden und die Probenechtheit zu gewährleisten.
- Hängt von der Verfügbarkeit von Ultrafilterröhrchen, Plattenrührern und der Infrastruktur für die elektrochemilumineszenzbasierte Immunoassay-Detektion der Analyten ab.
- Erfordert die standardisierte Pufferherstellung mit Proteaseinhibitoren, um eine Degradation der Mediatoren während der Extraktion zu verhindern.
- Erfordert eine Anpassung der Probenahmedauer oder der Filtergröße, wenn die Methode bei älteren Kindern oder an alternativen Schleimhautoberflächen angewendet wird.
- Eingeschränkt durch die geringe Menge an Analyten, wobei einige Mediatoren häufig unterhalb der Nachweisgrenze liegen und daher eine Optimierung der Empfindlichkeit des Assays für Zielstrukturen mit geringer Expression notwendig ist.
