Nicht-invasive Probenahme von Schleimhaut-Flüssigkeit für die Quantifizierung von In Vivo oberen Atemwegen immun-Mediator-Level

Dieses Protokoll beschreibt eine nicht-invasive Technik für die Entnahme von ungestörten Schleimhaut Flüssigkeit aus den oberen Atemwegen. Es kann verwendet werden, die Quantifizierung der in Vivo -Level von Protein Mediatoren wie Zytokine und Chemokine, bei Patienten aller Altersgruppen durchführen.

Das übergeordnete Ziel dieser Methode zur Probenahme von Schleimhautflüssigkeiten ist es, die lokale Immunsignatur der Atemwege zu untersuchen, ohne dass Stimulationsverfahren erforderlich sind. Mit dieser Methode können Sie Schlüsselfragen im Bereich der pädiatrischen Atemwegserkrankungen wie Infektionen, Asthma und Allergien untersuchen. Die Vorteile der Methode bestehen darin, dass Sie in vivo sehr geringe Konzentrationen von Immunmediatoren in der unstimulierten Atemwegsschleimhaut messen können.

Die Demonstration des Eingriffs wird von Dr. Wolsk durchgeführt. Schneiden Sie für die Entnahme von Neugeborenenproben zunächst mindestens zwei drei x 15 Millimeter große Streifen aus faserigen hydroxylierten Polyester-Filterschichten ab. Legen Sie das Neugeborene anschließend auf ein Bett und achten Sie auf alle Symptome einer Atemwegsinfektion.

Führen Sie dann mit einer Pinzette ein Stück Filterpapier etwa einen Zentimeter in den vorderen Teil der unteren Nasenmuschel jedes Nasenlochs des Säuglings ein und verabreichen Sie dem Neugeborenen bei Bedarf Zuckerwasser, um es zu beruhigen. Achten Sie auf Niesen, anhaltendes Weinen oder Nasenbluten, die während des Probenahmezeitraums auftreten. Nach zwei Minuten Absorption werden die Filterpapiere zur sofortigen Lagerung bei minus 80 Grad Celsius in ein beschriftetes Röhrchen überführt.

Das experimentelle Verfahren wird von Lisbeth Rosholm, einer Technikerin in meinem Labor, vorgeführt. Für die Quantifizierung von Immunmediatoren der Atemwege legen Sie bis zu 10 Proben aus einer Lagerung bei minus 80 Grad Celsius auf Eis und notieren Sie ihre Identifikationsnummern. Wenn die Proben aufgetaut sind, tauchen Sie beide Filterpapiere pro Subjekt in 150 Mikroliter frisch zubereiteten Puffer pro Filterpapier, ergänzt mit einer vollständigen Proteasehemmer-Tablette pro 25 Milliliter Pufferstofflösung.

Die Proben werden fünf Minuten lang bei 400 U/min in einen Plattenschüttler überführt. Übertragen Sie den Puffer und das Filterpapier in die Becher der einzelnen Celluloseacetat-Schlauchfilter. Zentrifugieren Sie die Proben, um den gefilterten Nasenextrakt am Boden der Mikrozentrifugenröhrchen zu sammeln.

Nehmen Sie dann die Becher heraus und legen Sie die Röhrchen auf Eis. Als nächstes werden 150 Mikroliter Aliquots des Nasenextrakts in einzelne Vertiefungen mit Speicherplatten mit geringer Proteinbindung überführt und die Platten bis zur Analyse bei minus 80 Grad Celsius gelagert. Messen Sie dann die Konzentration der nasalen Immunmediatoren von Interesse mit einem hochempfindlichen Elektrochemilumineszenz-basierten Multiplex-Array gemäß Standard-Assay-Protokollen.

In dieser repräsentativen Analyse von 620 Neugeborenen zeigten die meisten der gemessenen Immunmediatoren einen geringen Nachweis. Die IFN-Gamma-Spiegel lagen in fast der Hälfte der Proben unter der unteren Nachweisgrenze, während die TNF-alpha-, CCL4- und TGF-beta-Spiegel in weniger als 1 % der Proben unter der unteren Nachweisgrenze lagen. Für die 20 detektierten Mediatorstufen zeigte sich eine starke Multikollinearität, wie eine Heatmap zeigt.

Bei asymptomatischen Picornavirus-infizierten Neugeborenen wurde ein hochreguliertes Profil beobachtet, das hauptsächlich von Typ-1-Immunmediatoren beeinträchtigt war, was auf eine immunauslösende Rolle der Besiedlung von Bakterien und Viren in der frühesten Lebensphase hindeutet. Es wurde auch ein Zusammenhang zwischen der Anwesenheit von Geschwistern im Haushalt bei der Geburt und einer spezifischen Typ-1-Typ-17-gerichteten Schleimhautimmunantwort festgestellt, wobei eine Korrelation dieses Phänomens mit einem in utero-Immun-Priming-Effekt nachgewiesen wurde, der umgekehrt mit der Zeit seit der letzten Geburt korreliert. Darüber hinaus waren Kinder von Müttern, die hohe Präparate im Vergleich zu Placebo-Präparaten erhielten, durch eine Hochregulierung spezifischer Immunmediatoren gekennzeichnet, was darauf hindeutet, dass Vitamin D eine antibakterielle Immunantwort fördert, die unabhängig von der durch Viren, Bakterien, Geschwister oder mütterliche Atopie induzierten Immunantwort ist.

Diese Methode der Mikroprobenahme kann auch mit einem Bronchoskop verwendet werden, um die Immunmediatoren in den unteren Atemwegen zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Mediatoren in der unstimulierten Atemwegsschleimhaut in vivo bei Neugeborenen und älteren Kindern misst.