Nicht-invasive Probenahme von Schleimhaut-Flüssigkeit für die Quantifizierung von In Vivo oberen Atemwegen immun-Mediator-Level
August 7th, 2017
Dieses Protokoll beschreibt eine nicht-invasive Technik für die Entnahme von ungestörten Schleimhaut Flüssigkeit aus den oberen Atemwegen. Es kann verwendet werden, die Quantifizierung der in Vivo -Level von Protein Mediatoren wie Zytokine und Chemokine, bei Patienten aller Altersgruppen durchführen.
Das übergeordnete Ziel dieser Methode zur Probenahme von Schleimhautflüssigkeiten ist es, die lokale Immunsignatur der Atemwege zu untersuchen, ohne dass Stimulationsverfahren erforderlich sind. Mit dieser Methode können Sie Schlüsselfragen im Bereich der pädiatrischen Atemwegserkrankungen wie Infektionen, Asthma und Allergien untersuchen. Die Vorteile der Methode bestehen darin, dass Sie in vivo sehr geringe Konzentrationen von Immunmediatoren in der unstimulierten Atemwegsschleimhaut messen können.
Die Demonstration des Eingriffs wird von Dr. Wolsk durchgeführt. Schneiden Sie für die Entnahme von Neugeborenenproben zunächst mindestens zwei drei x 15 Millimeter große Streifen aus faserigen hydroxylierten Polyester-Filterschichten ab. Legen Sie das Neugeborene anschließend auf ein Bett und achten Sie auf alle Symptome einer Atemwegsinfektion.
Führen Sie dann mit einer Pinzette ein Stück Filterpapier etwa einen Zentimeter in den vorderen Teil der unteren Nasenmuschel jedes Nasenlochs des Säuglings ein und verabreichen Sie dem Neugeborenen bei Bedarf Zuckerwasser, um es zu beruhigen. Achten Sie auf Niesen, anhaltendes Weinen oder Nasenbluten, die während des Probenahmezeitraums auftreten. Nach zwei Minuten Absorption werden die Filterpapiere zur sofortigen Lagerung bei minus 80 Grad Celsius in ein beschriftetes Röhrchen überführt.
Das experimentelle Verfahren wird von Lisbeth Rosholm, einer Technikerin in meinem Labor, vorgeführt. Für die Quantifizierung von Immunmediatoren der Atemwege legen Sie bis zu 10 Proben aus einer Lagerung bei minus 80 Grad Celsius auf Eis und notieren Sie ihre Identifikationsnummern. Wenn die Proben aufgetaut sind, tauchen Sie beide Filterpapiere pro Subjekt in 150 Mikroliter frisch zubereiteten Puffer pro Filterpapier, ergänzt mit einer vollständigen Proteasehemmer-Tablette pro 25 Milliliter Pufferstofflösung.
Die Proben werden fünf Minuten lang bei 400 U/min in einen Plattenschüttler überführt. Übertragen Sie den Puffer und das Filterpapier in die Becher der einzelnen Celluloseacetat-Schlauchfilter. Zentrifugieren Sie die Proben, um den gefilterten Nasenextrakt am Boden der Mikrozentrifugenröhrchen zu sammeln.
Nehmen Sie dann die Becher heraus und legen Sie die Röhrchen auf Eis. Als nächstes werden 150 Mikroliter Aliquots des Nasenextrakts in einzelne Vertiefungen mit Speicherplatten mit geringer Proteinbindung überführt und die Platten bis zur Analyse bei minus 80 Grad Celsius gelagert. Messen Sie dann die Konzentration der nasalen Immunmediatoren von Interesse mit einem hochempfindlichen Elektrochemilumineszenz-basierten Multiplex-Array gemäß Standard-Assay-Protokollen.
In dieser repräsentativen Analyse von 620 Neugeborenen zeigten die meisten der gemessenen Immunmediatoren einen geringen Nachweis. Die IFN-Gamma-Spiegel lagen in fast der Hälfte der Proben unter der unteren Nachweisgrenze, während die TNF-alpha-, CCL4- und TGF-beta-Spiegel in weniger als 1 % der Proben unter der unteren Nachweisgrenze lagen. Für die 20 detektierten Mediatorstufen zeigte sich eine starke Multikollinearität, wie eine Heatmap zeigt.
Bei asymptomatischen Picornavirus-infizierten Neugeborenen wurde ein hochreguliertes Profil beobachtet, das hauptsächlich von Typ-1-Immunmediatoren beeinträchtigt war, was auf eine immunauslösende Rolle der Besiedlung von Bakterien und Viren in der frühesten Lebensphase hindeutet. Es wurde auch ein Zusammenhang zwischen der Anwesenheit von Geschwistern im Haushalt bei der Geburt und einer spezifischen Typ-1-Typ-17-gerichteten Schleimhautimmunantwort festgestellt, wobei eine Korrelation dieses Phänomens mit einem in utero-Immun-Priming-Effekt nachgewiesen wurde, der umgekehrt mit der Zeit seit der letzten Geburt korreliert. Darüber hinaus waren Kinder von Müttern, die hohe Präparate im Vergleich zu Placebo-Präparaten erhielten, durch eine Hochregulierung spezifischer Immunmediatoren gekennzeichnet, was darauf hindeutet, dass Vitamin D eine antibakterielle Immunantwort fördert, die unabhängig von der durch Viren, Bakterien, Geschwister oder mütterliche Atopie induzierten Immunantwort ist.
Diese Methode der Mikroprobenahme kann auch mit einem Bronchoskop verwendet werden, um die Immunmediatoren in den unteren Atemwegen zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Mediatoren in der unstimulierten Atemwegsschleimhaut in vivo bei Neugeborenen und älteren Kindern misst.
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Überblick
Dieses Protokoll beschreibt eine nichtinvasive Technik zur Probenahme von ungestörter Schleimhautflüssigkeit aus den oberen Atemwegen. Es ermöglicht die Quantifizierung der in vivo-Spiegel von Proteinmediatoren, wie Zytokinen und Chemokinen, bei Probanden aller Altersgruppen.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Atemwegserkrankungen
- Immunologie
- Pädiatrie
Hintergrund
- Diese Methode untersucht die lokale Immunsignatur der Atemwege ohne Stimulationsverfahren.
- Sie ist anwendbar auf pädiatrische Atemwegserkrankungen wie Infektionen, Asthma und Allergien.
- Die Technik ermöglicht die Messung niedriger Mengen an Immunmediatoren in der nicht stimulierten Atemwegsschleimhaut in vivo.
- Die Demonstration des Verfahrens wird von Dr. Wolsk durchgeführt.
Zweck der Studie
- Zur Untersuchung der Immunantwort in der Atemwegsschleimhaut.
- Um Einblicke in pädiatrische Atemwegserkrankungen zu gewinnen.
- Um nichtinvasive Probenahmetechniken für die Forschung zu ermöglichen.
Verwendete Methoden
- Sammeln von Schleimhautflüssigkeit aus den oberen Atemwegen.
- Verwendung von faserigen hydroxylierten Polyester-Filterblättern zur Probensammlung.
- Beobachtung von Symptomen von Atemwegsinfektionen bei Neugeborenen.
- Quantifizierung von Zytokinen und Chemokinen in den gesammelten Proben.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Sammlung von Schleimhautflüssigkeit ohne invasive Verfahren.
- Fähigkeit, Immunmediatoren in vivo zu messen.
- Einblicke in das Immunprofil von pädiatrischen Patienten.
- Potenzielle Anwendungen zum Verständnis von Atemwegserkrankungen.
Schlussfolgerungen
- Die nichtinvasive Probenahmemethode ist effektiv für die Untersuchung der Atemwegsimmunität.
- Diese Technik kann die Forschung zur pädiatrischen Atemwegsgesundheit verbessern.
- Zukünftige Studien können die Erkenntnisse zu Immunmediatoren erweitern.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This noninvasive mucosal lining fluid sampling method enables direct quantification of in vivo immune mediators in the upper airway mucosa without stimulation, providing a physiologically relevant readout of airway immune activity. The technique supports early-life immune profiling and longitudinal monitoring, facilitating mechanistic de-risking in respiratory therapeutic development by linking genetic and environmental exposures to immune phenotypes. Its application in neonatal and pediatric cohorts offers predictive value for endotyping and monitoring disease progression, particularly in asthma, allergy, and infectious disease contexts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by measuring baseline and induced levels of immune mediators in unstimulated mucosal tissue.
- Operational Value: Provides a reproducible, minimally invasive matrix for functional target validation in pediatric populations.
- Predictive Value: Supports biological de-risking through correlation of mediator profiles with clinical phenotypes such as asymptomatic viral infection and sibling exposure effects.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates eluted protein samples compatible with high-sensitivity electrochemiluminescence multiplex arrays for quantitative immune profiling.
- Standardization: Uses consistent filter paper absorption and elution protocols to ensure reproducible recovery of analytes across subjects and timepoints.
- Scalability: Demonstrated feasibility in large neonatal cohorts (n=620), supporting high-throughput screening applications in epidemiologic and interventional studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Enables longitudinal sampling from birth through childhood, linking early-life immune signatures to later respiratory disease outcomes.
- Biomarker Alignment: Detects upregulation of type 1 and type 17 immune mediators in asymptomatic picornavirus-infected neonates, suggesting utility in identifying immune endotypes.
- Mechanistic De-risking: Reveals associations between maternal vitamin D supplementation and antibacterial immune responses, supporting target prioritization for immunomodulatory interventions.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology phase by enabling direct measurement of immune mediators in vivo, informing target selection and pathway elucidation prior to lead identification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of immune pathway activation in mucosal tissue without ex vivo manipulation or stimulation artifacts.
- Screening: Produces standardized eluates suitable for multiplex immunoassay readouts, facilitating comparative analysis across treatment or exposure groups.
- Analytics: Generates quantitative mediator levels that allow statistical assessment of collinearity, immune network activity, and phenotype associations.
- Translational Research: Connects neonatal immune profiles to childhood respiratory symptoms and environmental exposures, supporting risk-stratified advancement decisions.
- Enterprise Reuse: Represents a platform-compatible sampling technique applicable across respiratory disease models and therapeutic modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by capturing endogenous immune activity in the native mucosal microenvironment.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized collection, elution, and storage procedures, minimizing pre-analytical variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking immunomodulatory mechanisms to early-life immune signatures, reducing late-stage biological risk in respiratory programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on demonstrated effects on mucosal immune pathways in relevant, longitudinal human models.
Implementation Considerations
- Requires training in neonatal airway anatomy and gentle sampling technique to ensure subject comfort and sample integrity.
- Dependent on access to ultrafilter tubes, plate shakers, and electrochemiluminescence immunoassay infrastructure for analyte detection.
- Necessitates standardized buffer preparation with protease inhibitors to prevent mediator degradation during extraction.
- Requires adaptation of sampling duration or filter size when applied to older children or alternative mucosal sites.
- Limited by analyte abundance, with some mediators frequently below detection limit, necessitating assay sensitivity optimization for low-expression targets.
